Les microchampignons unicellulaires du genre Pneumocystis sont transmis par voie aérienne et pénètrent dans l’alvéole pulmonaire de l’homme et de nombreux mammifères. Si le système immunitaire est déficient, leur prolifération provoque une insuffisance respiratoire grave, souvent fatale. Les personnes concernées par cette pathologie sont principalement les individus séropositifs pour le VIH au stade SIDA mais également les patients recevant un traitement immunosuppresseur en cas de cancers, de greffe d’organes ou de maladies auto-immunes. Du fait de la très forte spécificité d’hôte qui caractérise ces microchampignons, l’étude directe de Pneumocystis jirovecii, l’espèce spécifique de l’homme, reste bien entendu limitée mais la présence d’autres espèces du parasite chez de nombreux mammifères a permis de développer des modèles expérimentaux performants. Néanmoins, la transition dynamique d’un stade parasitaire à l’autre n’a jamais était suivie en temps réel et la forme infectieuse demeure inconnue. Pour examiner ces aspects fondamentaux du cycle biologique de Pneumocystis, la séparation physique des stades parasitaires (formes trophiques ou formes kystiques) constitue l’un des pré-requis indispensable. Dans un premier temps, nous avons mis au point une nouvelle méthode pour obtenir des populations parasitaires totalement pures. L’utilisation d’un cytomètre trieur à haut débit (FACSAria®), suite à un coimmunomarquage spécifique, nous a permis de séparer les formes trophiques des formes kystiques avec une pureté proche de 100 %. Les parasites obtenus demeurant infectieux après inoculation intra-trachéale chez le rat Nude, nous avons pu les utiliser afin de clarifier les mécanismes qui sous-tendent la multiplication et la différenciation de Pneumocystis carinii. Notre but était de mieux comprendre le cycle biologique des organismes du genre Pneumocystis en tentant de répondre aux interrogations suivantes : quel est le ou les modes de multiplication des formes kystiques et trophiques de Pneumocystis ? Quelles sont les voies métaboliques activées chez les formes kystiques et trophiques ? Quels acteurs moléculaires sont impliqués dans le processus de différenciation des formes trophiques en formes kystiques ? Dans un premier temps, nous avons suivi le devenir de chaque stade parasitaire trié d’une part (i) dans le micro-environnement naturel des Pneumocystis, l’alvéole pulmonaire, après inoculation endotrachéale, chez le rat nude, et, d’autre part, (ii) in vitro dans des systèmes de cultures axéniques ou de co-cultures sur cellules épithéliales alvéolaires de rat (lignée cellulaire L2). Nos résultats suggèrent d’une part, que les formes trophiques peuvent, in vitro, se multiplier indépendamment des formes kystiques (sans toutefois permettre une croissance continue de P.carinii) et, d’autre part, que ces formes trophiques pures sont incapables de redonner, in vitro, des formes kystiques contrairement à nos observations chez l’animal. Ainsi, l’échec de la culture pourrait, en partie, être du à l’incapacité des formes trophiques à se différencier en formes kystiques in vitro. Ensuite, nous avons analysé la ploïdie des formes trophiques et kystiques afin de mieux appréhender les modes de multiplication de ces microchampignons, en utilisant un agent intercalant de l’ADN et en comparant le contenu en ADN de Pneumocystis à celui des souches référence haploïdes et diploïdes de Saccharomyces cerevisiae. Deux stratégies complémentaires ont été employées afin de comparer les transcrits exprimés par ces deux populations : (i) l’hybridation sur puces à ADN (en collaboration avec le Pr. Melanie Cushion, Université de Cincinnati, USA) et (ii) les banques soustractives d’ADN complémentaire. Globalement, ces résultats devraient permettre de clarifier les modes de multiplication et le cycle biologique de ces microchampignons opportunistes. / Pneumocystis organisms are atypical and ubiquitous microfungi that proliferate in the lungs of immuno-suppressed mammals, including human beings, thus provoking serious, and often life-threatening pneumonia. Patients suffering from this disease are mainly HIV-positive individuals and patients with primary immunodeficiency, patients receiving immunosuppressive therapies for malignancies, organ transplantations or autoimmune diseases. It is also considered as a worsening factor in respiratory diseases such as infant bronchiolitis and chronic obstructive pulmonary diseases (COPD). Even though Pneumocystis clinical spectrum is widening in the human population, fundamental aspects of its biology remain uncovered. To date, no continuous culture model is available, thus significantly preventing Pneumocystis research progress. Consequently, most Pneumocystis cell biology studies have to rely on competitive animal models while epidemiological studies on P. jirovecii stem from molecular biology data. What is more, dynamic Pneumocystis stage-to-stage transitions has never been followed nor do we know the infectious form. To examine these fundamental aspects of the Pneumocystis life cycle, separation of trophic and cystic forms is required. A reliable high speed sorting system (FACSAria cytometer, Becton Dickinson) was used to set up a new and efficient method of separation of P. carinii life cycle stages. Following specific coimmuostaining of both trophic and cystic forms of Pneumocystis, host cell debris were successfully eliminated and highly pure trophic and cystic form populations were reproducibly separated and collected for further analyses with a purity of 99,6 to 100%. These sorted populations remaining infectious in endotracheally-inoculated Pneumocystis-free Nude rats, they were used to clarify the mechanisms of multiplication and differenciation of P. carinii. Our aim was to better understand the life cycle of Pneumocystis organisms by addressing the following questions: How do the Pneumocystis trophic and cystic forms proliferate? Which are the active metabolic pathways in the trophic or cystic form populations? Which molecular actors are involved in the trophic-to-cystic form differenciation process? First of all, growth kinetics of either pure trophic or cystic forms of P. carinii were followed (i) in the natural Pneumocystis microenvironment (pulmonary alveolus), after endotracheal inoculation of either pure trophic or cystic populations in Pneumocystis-free Nude rats ; (ii) in vitro in an axenic short-term culture model or in co-culture with rat epithelial alveolar cells (L2 cell line). These experiments indicated that trophic forms could multiply in vitro but that they cannot develop into cystic forms, in contrast to what happened in the rat model. The lack of cyst production in vitro may explain the absence of continuous growth of Pneumocystis in this system. Second, ploidy of trophic and cystic forms was analysed to better understand the multiplication process of these micromycetes. A DNA intercalating agent allowed us to measure DNA contents of sorted trophic and cystic forms in comparison with DNA contents of haploid and diploid Saccharomyces cerevisiae reference strains. Trophic forms contain 1, 2, 3 and 4 DNA contents whereas cystic forms contain 8C of DNA. Finally, expression profiles of sorted Pneumocystis cystic or trophic populations were compared using microarray approaches (University of Cincinnati, USA) and subtraction cDNA libraries. All together, these results should shed new light on the intricate modes of multiplication and life cycle of these opportunistic micromycetes.

Th.--Sci. nat.--Lille 1, 1977. N°: 95.

Ce travail de thèse a pour but d'étudier la fixation d'azote marine dans les environnements riches mais déficitaires en azote (N), comparé au phosphore (P) dans un rapport N:P<16, grâce à l'utilisation d'approches complémentaire en culture in vitro et sur le terrain in situ. La première partie de ce travail a consisté à évaluer la réponse de la fixation d'azote de la cyanobactérie unicellulaire diazotrophe Crocosphaera watsonii face à des concentrations micromolaires en azote inorganique dissous (DIN) supposées inhiber l'activité de fixation d'azote : - suite à un apport sporadique, ou, - après une longue période d'acclimatation. Les résultats de ces études n'ont pas permis d'observer une inhibition des activités de fixation d'azote de cet organisme, laissant supposer que ce processus pourrait être actif dans une zone de l'Océan ayant ces même caractéristiques biogéochimiques : le Sud Est Tropical de l'Océan Pacifique (ETSP). En effet, cette zone est une des trois plus grandes zones de minimum d'oxygène (OMZ) de l'Océan et d'intenses processus de pertes de N (dénitrification et anammox) y ont lieu, résultant en un déficit de N par rapport au P. Des études présumaient que des processus inverses, de gains de N par la fixation d'azote, pourraient y être actifs mais aucune mesure à l'échelle du bassin n'y avait été faite car la fixation d'azote n'était supposée se produire que dans les environnements oligotrophes, comme les gyres subtropicaux. Dans le cadre d'un projet international, des missions océanographiques ont pu avoir lieu dans cette zone en Février 2010 pendant un évènement El Niño et en Mars-Avril 2011 pendant un évènement La Niña. / The objectif of these thesis was to study dinitrogen fixation in marine environments rich but deficient of nitrogen (N) compared to phosphorus (P) in a ratio N:P<16, by using complementary approaches in culture in vitro and in the field in situ. The first part of this work was to evaluate the response of nitrogen-fixing unicellular Cyanobacteria Crocosphaera watsonii faced with micromolar concentrations of dissolved inorganic nitrogen (DIN) supposed to inhibit nitrogen fixation activity : - after sporadic input, or, - after a long period of acclimatization. The results of these studies have failed to observe the inhibition of nitrogen fixation activities of this organism, suggesting that this process could be active in an area of the Ocean with these same biogeochemical characteristics : the Eastern Tropical South Pacific (ETSP). Indeed, this area is one of the three largest oxygen minimum zones (OMZ) of the Ocean, where intense processes of N losses (denitrification and anammox) took place, resulting in a deficit of N compared to P. Studies assumed that the inverse process, gain of N by nitrogen fixation, could be active in the ETSP but no measurements across the basin have been performed because nitrogen fixation was assumed to occur only in oligotrophic environments, such as the subtropical gyres. In the framework of an international project, cruises took place in this area in February 2010 during a El Niño event and in March-April 2011 during a La Niña event. Results of these two cruises have confirmed that nitrogen fixation was unexpectedly active with an intensity comparable to those reported in oligotrophic areas.

La mer Méditerranée est une des zones océaniques les plus oligotrophes de la planète pour laquelle la fixation biologique d’azote a été proposée comme jouant un rôle important dans les flux de carbone et d’azote. Comme les organismes planctoniques potentiellement responsables de cette activité n’y ont jamais été étudiés, les objectifs de cette thèse étaient de caractériser la diversité (abondance et richesse spécifique), la distribution spatio-temporelle, et les facteurs de contrôle des diazotrophes, en s’axant particulièrement sur les cyanobactéries unicellulaires (UCYN). Pour cela, des hybridations in situ (TSAFISH)sur différentes fractions de taille en combinaison avec des comptages microscopiques et des analyses phylogénétiques sur les gènes 16S ADNr et nifH ont été réalisées, à la fois lors d’un cycle saisonnier à la station côtière SOMLIT de Marseille, et lors du transect Méditerranéen BOUM. Alors que les cyanobactéries filamenteuses Richelia intra cellularis et Trichodesmium sp. ont été détectées seulement ponctuellement dans le temps et dans l’espace, en très faible concentration (0.02 filament.ml-1), la communauté des cyanobactéries diazotrophes était dominée à 99,9% par du picoplancton hybridé avec la sonde Nitro821, spécifique aux UCYN. Ces cellules, de petite (0.7-1.5 μm) ou de grande (2.5-3.2 μm)taille, ont été retrouvées en faible concentration (1-6 cellule.ml-1) dans toute la Méditerranée et tout au long de l’année, à l’exception de l’été 2006 lorsque la concentration des petites cellules a atteint 5300 cellule.ml-1 au cours d’un évènement exceptionnel de pollution atmosphérique urbaine. Des efflorescences similaire sont été observées suite à des enrichissements en poussières sahariennes à une station côtière en Corse et au large au centre de la Méditerranée, simultanément avec des augmentations de l’activité de fixation d’azote.L’affiliation des petites cellules aux UCYN-A a été confirmée par phylogénie dans les eaux du large de la Méditerranée occidentale. Les librairies de clones nifH de la fraction de taille picoplanctonique étaient dominées par des séquences d’α-protéobactéries appartenant à un nouveau groupe marin de Bradyrhizobium. D’autres groupes de rhizobia et des γ-protéobactéries ont été détectés ponctuellement.Alors que l’absence de Trichodesmium sp. au large pourrait être liée aux faibles concentrations en phosphate et en fer, les facteurs inhibant le développement des UCYN-B et –C restent inconnus. Lesdiazotrophes picoplanctoniques (Bradyrhizobium, rhizobia, UCYN-A) pourraient avoir développé des stratégies spécifiques, telles que des associations avec des eucaryotes ou des particules inertes, et/ou la capacité de photosynthèse, pour acquérir le carbone nécessaire au soutien du processus de la diazotrophie / The Mediterranean Sea is one of the most oligotrophic marine areas on earth where nitrogenfixation has been formally believed to play an important role in carbon and nitrogen fluxes. Although thisview is under debate, the diazotrophs responsible for this activity have still not been investigated. The aimsof this PhD were to characterise the diversity (abundance and species richness) and the spatio-temporaldistribution of diazotrophs, as well as factors controlling their development, with a particular focus onunicellular cyanobacteria. A combination of microscopic counts with size fractionated in situ hybridization(TSA-FISH), and 16S rDNA and nifH phylogenies were done, either over a year and a half seasonal cycle atthe coastal SOMLIT station off Marseilles, and across the entire Mediterranean Sea during the BOUMtransect. Low concentrations of diazotrophic cyanobacteria were detected and this community wasdominated at 99.9% by picoplankton hybridized with Nitro821 probe, specific for unicellular diazotrophiccyanobacteria (UCYN). Among filamentous cyanobacteria, only 0.02 filament ml-1 of Richeliaintracellularis and Trichodesmium sp. were detected sporadically in time and space. Small (0.7-1.5 μm) andlarge (2.5-3.2 μm) Nitro821-targeted cells were recovered in low concentrations (1-6 cell ml-1) across theentire Mediterranean Sea and all the year long, except over a month period in summer 2006 whenconcentrations of small cells reached 5300 cell ml-1, during an exceptionally high urban pollution event.Similar blooms of small and large cells were reported after Saharan dust inputs off Corsica and at open Sea,simultaneously with increases in N2 fixation rates. The affiliation of the small Nitro821-targeted cells toUCYN-A was confirmed by 16S and nifH phylogenies offshore in the western Mediterranean Sea. Rhizobiasequences, including the ones of a new marine group of Bradyrhizobium, were dominating nifH clonelibraries from picoplanktonic size fractions. A few sequences of γ-proteobacteria were also detected incentral Mediterranean Sea. While low phosphate and iron concentrations could explain the absence ofTrichodesmium sp. offshore, the factors that prevent the development of UCYN-B and C remain unknown.It is proposed that the dominating Mediterranean picoplankters (Bradyrhizobium, rhizobia, UCYN-A)probably developed specific strategies, such as associations with protists or particles, and/or photosyntheticactivity, to acquire carbon for sustaining diazotrophy.

La salinisation des eaux douces est un problème global qui, dans les régions tempérées nordiques, est lié à l'urbanisation. Les principaux ions responsables de cette salinisation sont les chlorures, le sodium et le calcium et leurs sources majeures sont les sels de déglaçage et l'usure de la chaussée. Durant l'hiver, ces ions s'accumulent dans la neige en bordure des routes et peuvent être transportés dans les eaux souterraines et de surface via l'eau de fonte et de ruissellement. Dans les dernières décennies, la salinité des lacs, et plus particulièrement leur concentration en chlorures, a augmenté de façon conséquente par rapport aux valeurs de référence. Par contre, pour la plupart des lacs, les niveaux atteints se situent en-deçà de la valeur seuil définie par le conseil canadien des ministres de l'environnement pour la protection de la vie aquatique qui est de 120 mg Cl L⁻¹ pour une exposition chronique. Les impacts de la salinisation des écosystèmes d'eau douce sur les organismes aquatiques sont peu connus et le manque d'information est particulièrement marqué pour les communautés microbiennes. Les objectifs principaux de cette thèse étaient 1) d'identifier les voies qu'empruntent les ions pour se rendre dans les lacs, ainsi que les moments auxquels ces mouvements ont lieu et 2) de caractériser les changements que peuvent causer ces ions, particulièrement les chlorures, dans la composition taxonomique des communautés microbiennes. Un suivi saisonnier dans le bassin versant du lac Saint-Charles (Québec, Canada) a permis de comparer la concentration de différents ions dans la neige en bordure des routes, dans les rivières et dans le lac. Ce suivi s'est échelonné de l'hiver (saison d'accumulation des ions dans la neige) au printemps (principale période de fonte) et combinait des mesures ioniques aux deux semaines dans la neige et les rivières et des mesures de conductivité prises aux 10 minutes par un mouillage dans le lac. Les résultats de ce suivi indiquent que les ions chlorures et sodium se déplacent de la neige vers le lac à tous les épisodes de fonte et que ces derniers surviennent aussi durant l'hiver. Dans les rivières, on observait une relation positive entre la concentration des ions et l'urbanisation du bassin versant, et ce dès qu'elle dépassait ≈1%. Un suivi annuel de lacs présentant des variables limnologiques différentes a permis de mettre ces dernières en relation avec la composition des communautés microbiennes planctoniques. Les lacs Clair, Saint-Charles, Clément et Saint-Augustin, situés aux alentours de la Ville de Québec, diffèrent entre autres en fonction de leur salinité, de leur morphométrie, de leur état trophique, et du niveau d'urbanisation de leur bassin versant. Les résultats ont souligné l'importance de la saison pour la composition taxonomique des communautés microbiennes, plus particulièrement celle de l'hiver, ou du couvert de glace. Ils ont aussi suggéré l'importance de la salinité comme facteur structurant, et ce à une conductivité d'environ 1000 μS cm⁻¹ et une concentration en chlorures de l'ordre de 100 mg L⁻¹. La salinité était, entre autres, positivement corrélée avec l'abondance de cryptophytes et d'haptophytes. Une expérience de microcosme en laboratoire où une communauté microbienne du lac Saint-Charles a été exposée à des concentrations de chlorures de 50 mg L⁻¹ (correspondant environ à une augmentation de la salinité par un facteur 2) a aussi été mise en place pour évaluer l'importance de ce facteur. Après deux semaines d'exposition aux chlorures, l'abondance de plusieurs taxons a augmenté, dont les cyanobactéries Synechococcus et Pseudanabaena et un cryptophyte du clade SA1-3C06. L'exposition aux chlorures, toujours à 50 mg Cl L⁻¹, mais combinée à la neige urbaine n'a pas causé de changements aussi marqués dans la composition taxonomique. Ces résultats suggèrent qu'une composante de la neige urbaine a atténué les effets des chlorures et que l'exposition aux chlorures seuls ne représente pas correctement les effets attendus dans le milieu naturel. Cette thèse a permis de montrer que la salinité des lacs pouvait changer rapidement en réponse à des épisodes de fonte de neige, même en période hivernale et que l'augmentation de la salinité, tant en milieu naturel qu'en contexte expérimental, était corrélée avec des changements dans la composition taxonomique des communautés microbiennes. Ces résultats impliquent que l'augmentation de la salinité, même faible par rapport aux valeurs de référence, influence les écosystèmes d'eau douce, et que dans les régions froides, il devrait y avoir une gestion de l'eau de ruissellement des autoroutes afin de limiter la contamination des eaux par les sels de déglaçage. / Freshwater salinization is an ongoing global concern that in north temperate regions is linked to urbanization. Chloride, sodium, and calcium are the primary ions responsible for this salinization, and their major sources are road salts and pavement weathering. In winter, these solutes accumulate in roadside snow, and may then be transported to ground and surface waters via melting and runoff. In the last decades, the salinity of lakes and their chloride concentrations have significantly increased compared to background values. However, in most lakes, the levels reached are still below the guidelines of the Canadian Council of Ministers of the Environment for the protection of aquatic life, which is 120 mg Cl L⁻¹ for chronic exposure. The impacts of salinization on freshwater biota are largely unknown, particularly for microbial communities. The main objectives of this thesis study were to 1) identify the flow pathways and timing of ion transport from roads to receiving waters; and 2) characterize the changes that major ions, particularly chloride, may have on the taxonomic composition of freshwater microbial communities. Seasonal monitoring of the Lake Saint-Charles (Quebec, Canada) watershed allowed comparison of major ion concentrations in roadside snow, rivers within the lake basin, and the lake itself. These observations took place from winter (the season of ion accumulation in snow) to spring (the main melting period), and combined ion measurements in rivers and roadside snow at two-week intervals with conductivity measurements in the lake at 10-minute intervals. The results indicated that chloride and sodium moved from roadside snow to the lake during all melting events, which were also recorded during winter. There was a positive relationship between the major ion concentrations in the river and the watershed urbanization level, beyond a threshold of 1% pavement coverage of the catchment. To asssess the effects of chemical as well as other limnological variables on microbial community structure, plankton and associated samples were taken throughout an entire year from four lakes in the Quebec City region: lakes Clair, Saint-Charles, Clément, and Saint-Augustin. These lakes varied in terms of salinity, morphometry, trophic state, and watershed urbanization level. The results showed a strong seasonal effect on prokaryotic as well as eukaryotic taxonomic composition, and underscored the importance of winter ice cover. Salinity was also identified as a structuring factor, even at conductivities around 1000 μS cm⁻¹ and chloride concentrations around 100 mg L⁻¹. Among other taxa, cryptophyte and haptophyte abundance were positively correlated with salinity. In a laboratory microcosm experiment, the Lake Saint-Charles microbial community was exposed for two weeks to chloride at 50 mg L⁻¹ , corresponding to a two-fold increase of salinity, to test hypotheses concerning the importance of this factor. After two weeks of exposure, the abundance of many taxa increased, notably the cyanobacteria Synechococcus and Pseudanabaena and a cryptophyte of the SA1-3C06 clade. The exposure to chlorides, still at 50 mg Cl L⁻¹ but combined with urban snow, did not cause such marked changes in the taxonomic composition. These results suggest that a component of the snow mitigated the impacts of chloride, and that the exposure to chloride alone may not accurately represent the effects in natural ecosystems. This thesis study has shown that lake salinity can change rapidly in response to roadside snowmelt events, even in winter. Increases in salinity, both in natural ecosystems and in the laboratory, were correlated with changes in taxonomic composition of the microbial communities. These results imply that increased salinities, even over a low range of values, can influence freshwater ecosystems, and that the environmental management of roads in cold regions should take measures to limit the contamination of waterways by road salts.