La polarité cellulaire est une caractéristique commune à tous les organismes. Jusqu’à récemment, il était assumé que la sécrétion de protéines vers des domaines polaires de la cellule végétale se faisait de façon non polarisée, mais ce point de vue a été re-étudié, la sécrétion est polarisée mais la dynamique, les voies de traficempruntées et les mécanismes sont toujours inconnus. Précédemment, mon laboratoire d’accueil a caractérisé un enrichissement en sphingolipides contenant des acides gras à très longues chaines (VLCFAs) au niveau d’un sous-domaine du trans-Golgi Network (TGN) appelé Vésicules de Sécrétions (SVs). Plus précisément, il a été montré que la longueur des acides gras des sphingolipides jouait un rôle critique dans la sécrétion du transporteur d’auxine PIN2 des SVs vers des domaines polaires de la membrane plasmique. Pendant ma thèse, je me suis intéressé à la question suivante : comment les sphingolipides agissent-t-ils au TGN? En identifiant le protéome des SVs, ainsi qu'en utilisant des outils génétiques et pharmacologiques en combinaison avec la visualisation de marqueurs lipidiques, j'ai pu identifier que les sphingolipides agissent sur l’homéostasie des phosphoinositides en mettant en avant un lien fonctionnel entre ces deux classes de lipides au sein de la cellule végétale. En utilisant un set de marqueurs des phosphoinositides (PIPs), j’ai pu montrer que les sphingolipides ciblent principalement le phosphatidyl-inositol-3-phosphate, PI(3)P et le phosphatidylinositol- 4-phosphate, PI(4)P. De plus, mon analyse protéomique a montré que la localisation d'un ensemble de protéines liées aux PIPs était diminuée dans les SVs/TGN immunopurifiées quand la composition des sphingolipides est altérée. Mes résultats nous forcent à revoir notre vision de la dynamique des lipides au niveau des membranes, et suggère l’idée que la dynamique de remodelage de la composition d’une classe de lipide, les phosphoinositides, peut être modulée par une autre classe de lipide, les sphingolipides. / Cell polarity is a defining feature of all organisms. Until very recently, it was thought that delivery of proteins to polar domains of root epidermal cells plasma membrane was non-polar, but this view has been re-examined, the delivery is polar but the dynamics, the paths taken, and the mechanisms are unknown. My host team previously characterised an enrichment of Very-Long-Chain-Fatty-Acids (VLCFAs)-containing sphingolipids at the site of secretory vesicles (SVs) sub-domain of the trans-Golgi Network (TGN). Moreover, the length of sphingolipids acyl-chain was found to play a critical role in secretory sorting of the auxin carrier PIN2 from SVsassociated TGN to apical polar domain of the plasma membrane (PM). During my PhD, I addressed the following question: how sphingolipids act at SVs/TGN? Using proteomics of SVs, genetics and pharmacological tools in combination with visualisation of lipid probes we could identify that sphingolipids act on phosphoinositides (PIPs) homeostasis establishing a new functional link between these two lipids in plant cells. Using a set of multi-affinity fluorescent PIPs probes I could show that sphingolipids target phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) and phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P). Moreover, my proteomic analyses show that several PIPs-related proteins are downregulated in immuno-purified TGN-associated SVs when the sphingolipid composition is altered pharmacologically. My results force the reassessment of our view of lipid membranes dynamics and highlight the idea that dynamic remodelling of the composition of one lipid class, the phosphoinositides, can be modulated by another lipid class, the sphingolipids.

Les syndécans forment une famille de quatre protéines transmembranaires qui sont substituées par l'héparane sulfate. Grâce à ces chaînes glucidiques extracellulaires, les syndécans contrôlent la signalisation d'une pléthore de facteurs de croissance et de molécules d'adhésion. Une autre caractéristique remarquable des syndécans est la conservation de leur domaine intracellulaire au cours de l'évolution. Ce domaine contient un motif C-terminal qui peut induire une interaction avec les protéines dites «PDZ». Les interactions PDZ sont promiscues et les protéines PDZ contrôlent divers aspects de la signalisation cellulaire et de la communication cellule-cellule. Quatre interactions syndecan-PDZ ont été décrites à ce jour et toutes ces interactions ont des effets drastiques sur le comportement des cellules. En particulier, il a été documenté que l'interaction syndécan-synténine a un impact sur le trafic intracellulaire de molécules de signalisation liant l’héparan sulfate. De plus, les syndécans et la synténine coopèrent dans le contrôle la biogenèse des exosomes, organites extracellulaires fonctionnant comme des médiateurs importants de la communication cellule-cellule (y compris dans différentes maladies systémiques comme le cancer). Le protéome humain compte 150 protéines PDZ qui contiennent 266 domaines PDZ. Dans ce travail, nous avons mis à jour la complexité de l'interactome syndecan-PDZ et testé son impact sur le trafic membranaire et sur la composition des vésicules extracellulaires. Notre travail ouvre la voie à une meilleure compréhension des réseaux moléculaires contrôlant la communication cellule-cellule en physio-pathologie. / Syndecans form a family of four transmembrane proteins that are substituted with heparan sulfate. By virtue of these extracellular carbohydrate chains, syndecans control the signaling of a plethora of growth factors and adhesion molecules. Another remarkable feature of syndecans is the conservation of their intracellular domain through evolution. This domain contains a C-terminal motif that can mediate interaction with PDZ proteins. PDZ interactions are promiscuous and PDZ proteins control various aspects of cell signaling and cell-cell communication. Four syndecan-PDZ interactions have been described so far and all these interactions have broad effects on cell behavior. In particular, it was documented that syndecan-syntenin interaction has impact on the intracellular trafficking of heparan sulfate cargo. Moreover syndecan-syntenin controls the biogenesis of exosomes, extracellular organelles emerging as important mediators of cell-cell communication in health and diseases. The human proteome contains 150 PDZ proteins and 266 PDZ domains. Here we started addressing the complexity of the syndecan-PDZ interactome and tested for its impact on membrane trafficking and on the composition of extracellular vesicles. Our work paves the way for a better understanding of the molecular mechanisms and networks controlling cell-cell communication in health and disease.

The goal of this PhD was to design responsive biomimetic objects from Giant Unilamellar Vesicles and PolyNipam solutions or gels. We highlighted the coupling between the lipid membrane and the internal polyNipam medium, which confers those composite vesicles thermoresponsive properties, and the behaviour of such objects during thermal transition has been investigated by quantitative fluorescence studies. We have also measured the influence of the coupling between polyNipam chains and lipid membrane on the bending modulus of the membranes. Then the mechanical properties of the composite vesicles have been measured using micropipette aspiration technique, showing the relevance of those objects as cellular mechanical models. Further studies concerning adhesion properties, membrane tether extrusion and lipid extraction from composite vesicles have been adressed.

Dans les neurones, la stabilité des microtubules est induite par leur association avec deux protéines associées aux micotubules, les protéines E- et N-STOP (Early and adult neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). L'invalidation du gène stop chez la souris entraîne des défauts de la transmission synaptique associée à une réduction du nombre de vésicules synaptiques. <br />Les neurones matures contiennent également une protéine apparentée à la protéine N-STOP, la protéine SL21 (STOP like protein of 21 kDa) qui possède deux zones homologues aux protéines STOPs : un domaine homologue au domaine de liaison et de stabilisation des microtubules et une région de 35 acides aminés située à l'extrémité amino-terminale. Cette protéine se localise à la fois au niveau de l'appareil de Golgi et des microtubules.<br />La première partie de ce travail est consacrée à la caractérisation fonctionnelle du domaine amino-terminal. Il contient 3 résidus cystéines en position 5, 10 et 11 qui peuvent être palmitoylée (modification permettant l'association des protéines aux membranes). Nous avons montré que les cystéines 5 et 11 de SL21 sont palmitoylables mais que seule la cystéine 5 est suffisante et nécessaire pour localiser SL21 au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons également mis en évidence que la protéine STOP, en plus d'être localisée aux microtubules, s'associe également au Golgi par l'intermédiaire de son domaine amino-terminal homologue à SL21 et qu'elle est aussi palmitoylable.<br />Dans la deuxième partie de ce travail, pour mieux comprendre la fonction de SL21, nous nous sommes intéressées aux partenaires de SL21. Un criblage ciblé en Double-Hybride, utilisant comme protéines cibles des protéines connues comme étant des partenaires de STOP, a été réalisé au laboratoire. Trois partenaires potentiels ont été mis en évidence : la protéine Tctex1, une des chaînes légère du moteur moléculaire dynéine. Nous avons confirmé l'interaction de ces protéines avec SL21 par co-immunoprécipitation après surexpression dans les cellules et aussi, à partir d'un extrait de cerveau pour l'interaction de SL21 et de STOP. Nous avons également déterminé leur site d'interaction au niveau de SL21. La protéine Tctex1 interagit avec SL21 au niveau de son module de liaison aux microtubules, le site de multimérisation de SL21 se localise au niveau du domaine amino-terminal, pouvant impliquer la palmitoylation de ces protéines. <br />L'ensemble de ces résultats permet d'envisager un rôle des protéines STOPs au niveau de la régulation de la relation microtubule-membrane des vésicules synaptique au sein de la synapse

Les vésicules matricielles (VM) sont impliquées dans l'initiation des minéralisations physiologique ou pathologique. Le pyrophosphate (PPi) est une source de phosphate (Pi) pour maintenir la formation d'hydroxyapatite (HA) mais aussi un inhibiteur de la croissance de ces minéraux. Nous avons montré que la formation d'HA était optimale lorsque le rapport molaire Pi/PPi était supérieur à 140, tandis que du calcium pyrophosphate dihydraté, marqueur de l'arthrose, était exclusivement formé lorsque ce rapport était inférieur à 6. Des analyses protéomiques et en compositions lipidiques sur les VM et les microvillosités des cellules Saos-2 ont révélé que les VM étaient formées dans le réticulum endoplasmique et qu'elles possèdent des lipides et protéines caractéristiques de radeaux lipidiques. Finalement, nous avons montré que les VM sont libérées à partir des microvillosités grâce aux actions coordonnées de protéines dépolymérisant l'actine et de protéines contractiles. Les protéines impliquées dans la biogenèse des VM peuvent être des nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir des calcifications pathologiques.

Cette thèse est consacrée à l'étude analytique et numérique d'instabilités de forme de vésicules lipidiques à deux phases. Les vésicules sont un système modèle de choix pour étudier les propriétés mécaniques et physico-chimiques de la membrane cellulaire. Aussi, elles ont été largement étudiées depuis une trentaine d'années et, dans le cas d'une bicouche homogène, leurs propriétés sont désormais bien comprises. On sait maintenant réaliser des vésicules formées d'un mélange de lipides. Il peut alors se produire une séparation de phase conduisant à la formation de domaines de composition différente. Des structures similaires de très<br />petite taille, appelées 'rafts', existeraient dans les membranes cellulaires. Différentes expériences sur des vésicules multiphasiques montrent que cette inhomogénéïté latérale favorise des instabilités de forme. Nous avons modélisé trois instabilités différentes, observées expérimentalement, pour mieux comprendre comment les propriétés mécaniques des vésicules sont affectées par l'existence d'un domaine. Deux instabilités concernent des déformations hors du plan de la bicouche : la rupture d'un tube de membrane, provoquée par les contraintes mécaniques internes, et l'éjection d'un domaine d'une vésicule tendue, soit par l'absorption de molécules soit par un changement de pression osmotique. Enfin, nous avons modélisé une instabilité illustrant le comportement hydrodynamique de la bicouche, qui justifie le concept de viscosité associé à celle-ci tout en soulignant son caractère bidimensionnel.

Contrairement à leurs homologues animales, les cellules végétales sont entourées d’une fine enveloppe de polysaccharides appelée paroi primaire, dont la principale structure portante est un réseau de microfibrilles de cellulose reliées entre elles par des hémicelluloses. L’objectif de ce travail est de mettre au point des capsules biomimétiques de la paroi végétale qui puissent servir de système modèle dans l’étude des propriétés mécaniques de ce matériau naturel. Pour ce faire, des vésicules géantes unilamellaires d’un diamètre moyen de 20 µm ont été utilisées comme support de dépôts couche-par-couche de nanocristaux de cellulose (les sous-éléments des microfibrilles) et de xyloglucane (l’hémicellulose la plus répandue) jusqu’à une dizaine de bicouches, les capsules ainsi obtenues ayant été caractérisées par microscopie confocale. Leur comportement en déformation en réponse à une pression osmotique a pu être observé : leur dégonflement a donné lieu à l’apparition de diverses morphologies dont certaines sont similaires aux formes de coques minces de matériau isotrope dégonflées, tandis que leur comportement en gonflement est comparable à la réponse d’un matériau viscoélastique. Enfin, des expériences de nano-indentation par microscopie à force atomique ont été effectuées pour mesurer la rigidité de la paroi des capsules. Leur module d’Young a pu être déduit des courbes de force-déformation et s’avère être compris entre 6 et 18 MPa, ce qui est du même ordre de grandeur que les valeurs obtenues par des mesures similaires effectuées sur des parois végétales naturelles. / Unlike their animal counterparts, plant cells are surrounded by a thin polysaccharide-rich envelop called the primary wall, in which the main load-bearing structure is a network of cellulose microfibrils tethered by hemicellulose. This work aims at designing plant cell wall mimicking capsules that could be used as a model system in the mechanical characterization of this natural material. To do so, we used giant unilamellar vesicles with an average diameter of 20 µm as a template for the layer-by-layer deposition of cellulose nanocrystals (the microfibrils sub-elements) and xyloglucan (the most common hemicellulose) up to ten bilayers, the resulting capsules being characterized by confocal microscopy. Their deformation behaviour under osmotic stress could be observed : deflation of the capsules led to various morphologies, some of them similar to what is observed for thin deflated shells of isotropic material, while their response to swelling resembled that of a viscoelastic material. Nano-indentation experiments were eventually performed using an atomic force microscope to probe the stiffness of the capsules wall. Their Young’s modulus could be deduced from the force-depth curves and found to be in the 6-18 MPa range, which is in the same order of magnitude of values obtained with similar measurements done on natural plant cell walls.

Les RAB GTPases sont des régulateurs majeurs du trafic vésiculaire et sont localisées sur des compartiments spécifiques. L'identification des processus moléculaires régulant la localisation des RAB est donc cruciale afin de comprendre les mécanismes de transport intracellulaire. Nous sommes parvenus, pour la première fois, à incorporer des protéines RAB purifiées et prénylées dans des membranes artificielles. Nous avons tout d'abord observé que RAB6 est capable de promouvoir une agrégation de vésicules, phénomène qui n'est pas observé avec RAB1 et RAB5. Nous suggérons un modèle dans lequel RAB6 interagit en trans avec lui-même et par conséquent induit un accolement de membranes. La partie principale de cette étude consistait à identifier les propriétés physicochimiques des membranes requises pour le recrutement des protéines RAB. Nous avons observé que RAB1, RAB5 et RAB6 se lient préférentiellement à des membranes désordonnées et courbées, phénomène qui s'explique par l'insertion du groupement prenyl hydrophobe au niveau de défauts d'agencement de lipides. En revanche, le recrutement de RAB35 requiert la présence de lipides chargés négativement et peut être modulé, dans une moindre mesure, par les défauts d'agencement lipidique. Bien que RAB4 et RAB11 soient recrutées sur des fractions de Golgi purifiées, les charges membranaires et les défauts d'agencement lipidique ne sont pas suffisants pour permettre leur recrutement sur des vésicules synthétiques. Cela suggère que le recrutement de RAB4 et RAB11 nécessite des propriétés membranaires plus complexes. Nos travaux démontrent que les propriétés membranaires sont cruciales pour la localisation spécifique des protéines RAB. / RAB GTPases are major regulators of vesicular trafficking and localize to specific compartments. Deciphering the molecular mechanisms governing RAB localization is thus critical to understand intracellular transport processes. We have managed, for the first time, to incorporate purified and prenylated RABs into artificial membranes. By doing so, we observed that RAB6, but not RAB1 or RAB5, is able to promote by itself vesicle tethering. We believe that RAB6 is able to interact in trans with itself and to consequently drive homotypic membrane tethering. In the main part of this study, we investigated the physicochemical membrane requirements necessary for RAB recruitment. RAB1, RAB5 and RAB6 were all found to only localize to disordered membrane domains and to preferentially bind to curved membranes. We demonstrated that this specific recruitment of RAB1, RAB5 and RAB6 is primarily dependent on the hydrophobic insertion of their prenyl group into lipid packing defects. In contrast, RAB35 recruitment was primarily dependent on the presence of negatively charged lipids and was found to be modulated, to a lesser extent, by lipid packing defects. Although RAB4 and RAB11 were effectively recruited to purified Golgi fractions, in an effector-independent manner, membrane charges and lipid packing defects were not sufficient to promote their recruitment to synthetic vesicles; suggesting that RAB4 and RAB11 require more demanding membrane physicochemical properties. Our work demonstrates that the properties of membranes are critical for the regulation of RAB specific membrane targeting.

Ce travail de thèse s’intéresse à l’introduction de méthodologies électrochimiques dans la problématique de la caractérisation du transport de peptides pénétrants (CPPs) à travers des membranes phospholipidiques. Malgré leur charge électrique globalement positive, ces peptides sont en effet capables de traverser les bicouches lipidiques de cellules réelles ou artificielles (liposomes) et il n’existe pas à ce jour de mécanisme d’internalisation universellement admis. Dans ce contexte, nous avons dans un premier temps développé des méthodologies visant à détecter des peptides pénétrants marqués par des sondes rédox en optimisant les conditions de volume et de confinement à l’électrode. Parallèlement, nous avons tenté d’observer le passage transmembranaire de ces peptides en utilisant un dispositif dérivé du patch-clamp, dans lequel un morceau (patch)de membrane lipidique est excisé d’une vésicule géante et le suivi du passage assuré par une détection ampérométrique sur ultramicro-électrode à proximité de la membrane. La sensibilité de la technique ampérométrique et le flux de CPP s’avérant faibles, nous nous sommes tournés vers une stratégie associant fluorescence (pour la sensibilité) et commande électrochimique (pour l’extinction de la fluorescence). Dans la mesure où les phospholipides constituent la barrière dynamique à travers laquelle doivent passer les CPPs, nous avons d’abord étudié l’extinction électrochimique de phospholipides marqués par une sonde à la fois rédox et fluorescente, le NBD. Observée sur des vésicules géantes au microscope confocale, la réduction électrochimique a permis l’extinction sélective des phospholipides situés sur le feuillet externe de la vésicule, un résultat que ne permettent ni la réduction par des agents chimiques (dithionite), ni les techniques de « photobleaching ». Cette propriété a été confirmée cette fois-ci pour des CPPs marqués par le NBD qui ont été mis à incuber en présence de vésicules géantes et pour lesquels un essai préliminaire semble confirmer une extinction de fluorescence essentiellement pour les peptides associés au feuillet externe de la vésicule. / This PhD work was aimed at introducing electrochemical strategies in the general topic devoted to the characterization of the passage of cell penetrating peptides (CPPs) across phospholipidic membranes. Although positively charged, CPPs are prone to cross lipidic bilayers of real and artificial cells (liposomes) and there is no commonly admitted internalization mechanism so far. Therefore, we first developed electrochemical setups aimed at improving the amperometric detection of redox-taggedCPPs, through optimization of volume and confinement. Additionally, we have made attempts to use patch-clamp inspired setups to monitor the passage of CPPs across a membrane patched from a giant vesicle using ultramicro-electrodes in the close vicinity of the patched membrane. Since the amperometric technique displayed poor sensibility and the flux of CPP was too narrow, we changed our strategy for a methodology coupling fluorescence (for the sensitivity) and an electrochemical command (to achieve fluorescence extinction). Considering that phospholipids are forefront actors of CPP internalization, we first focused on the electrochemical quenching of phospholipids tagged with a probe displaying both redox and fluorescent properties (NBD). Observed on giant unilamellar vesicles (GUVs) with confocal microscopy, the electrochemical reduction of the NBD probe led to the selective extinction of the phospholipids located on the outer leaflet of the vesicle, a selectivity which is not observed using chemical quenchers such as dithionite or photobleaching methods. That property was extended to NBD-tagged CPPs, previously incubated with unlabeled Guvs and that preliminary experiment confirmed that the electrochemical extinction mostly concerned peptides associated to the outer leaflet of the liposome.

La spondylarthrite ankylosante (SA), la forme la plus commune des spondylarthrites (SpA), est fortement associée à la molécule du CMH de classe I HLA-B27 mais le rôle de cet antigène d'histocompatibilité dans le développement de ces pathologies reste encore inexpliqué. L’étude des rats transgéniques HLA-B27, développant une pathologie inflammatoire spontanée ressemblant aux SpA, a permis de confirmer l’implication directe du HLA-B27 et de corréler l’apparition des symptômes avec une forte expression de cette molécule. De plus, il a été montré que l’HLA-B27 présentait une propension particulière au mauvais repliement et à la formation d’oligomères de chaînes lourdes. L’objectif de mon travail de thèse était de déterminer si le trafic et/ou la formation d’oligomères du HLA-B27 étaient corrélés à sa surexpression. Pour cela, notre équipe a développé des protéines de fusion (HLA-BYFP et HLA-BRLuc) ainsi que la technique BRET afin d’étudier les interactions HLA-B/HLA-B. Au moyen de ce système expérimental, nous avons montré la formation de vésicules intracellulaires riches en protéines HLA-B mal repliées lorsqu’elles étaient fortement exprimées, qu'il s'agisse d'allèles associés à la SA (HLA-B*2702, -05, et -07) ou non (HLA-B*2706, et -09, HLA-B*0702). Cependant, ce phénomène était significativement plus prononcé pour les sous-types associés à la SA. Dans les conditions de forte expression, nous avons également observé que les sous-types associés à la SA formaient des oligomères qui se comportent différemment de ceux formés par la protéine HLA-B7. Ce phénomène ne semble pas être dû au déclenchement de la réponse cellulaire « Unfolded Protein Response » (UPR) et n’est pas abrogé par l’inhibition du protéasome. / Ankylosing spondylitis (AS), the most common form of spondyloarthritis (SpA), is strongly associated with the MHC class I HLA-B27 molecule. Although this association has been largely studied, mechanisms of pathology remain unclear. Development of a spontaneous inflammatory disease resembling human SpA in HLA-B27 transgenic rats confirmed the direct involvement of HLA-B27 and allowed to associate disease development with high expression levels of this molecule. Moreover, the HLA-B27 protein has an enhanced propensity to misfold and form aberrant disulfide linked heavy chain oligomers in the endoplasmic reticulum and at the cell surface. The goal of my thesis work was to determine if the HLA-B27 traffic and/or its ability to form oligomers are involved in this requirement of overexpression. For that, our team has developed fusion proteins ((HLA-BYFP and HLA-BRLuc) and the BRET technique to study, in vitro, the HLA-B/HLA-B interactions. Using this experimental system, we have shown the formation of intracellular vesicles, in which misfolded/unfolded HLA-B proteins accumulated when they were highly expressed, for both AS-associated alleles (HLA-B*2702, -05, et -07) or not (HLA-B*2706, et -09, HLA-B*0702). This phenomenon is strongly pronounced for AS-associated subtypes. For high-level expression, we also observed that the AS-associated subtypes form oligomers that behave differently from those formed by the HLA-B7 control protein. This phenomenon doesn’t appear to be due to unfolded protein response (UPR) triggering and is not abrogated by proteasome inhibition.