L'adhésion est un processus fondamental qui influence le déclenchement et le déroulement des processus pathologiques, notamment concernant les cellules circulantes aux parois vasculaires (réaction inflammatoire dans le flux sanguin). Sa compréhention nécessite la connaissance des mécanismes biologiques impliqués mais aussi d'un cadre physique de description du mouvement sous flux d'objets déformables en interaction avec une paroi. Notre travail utilise des systèmes modèles (vésicules, billes) pour identifier le rôle de paramètres de l'adhésion (densité, mobilité des ligands membranaires, déformabilité) sur le mouvement. Le système d'interaction développé est la chélation entre un ion nickel et deux histidines. L'imidazole, partie complexante de l'histidine, va permettre de réguler la force de l'interaction. Nous avons décrit le mouvement des lipides membranaires sous flux dans le cas de vésicules en interaction forte. On a mis en évidence la présence d'un flux surfacique dépendant de la forme de l'objet et de la force de l'adhésion. En régulant l'adhésion spécifique faible de billes, nous montrons la spécificité de l'interaction, des phénomènes originaux de capture, de détachement et de déplacement en adhésion sous écoulement de cisaillement.

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n'ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d'Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l'enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d'une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l'ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d'ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L'un d'eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d'adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l'apparition des virus.En plus d'être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces " thermococcines " nécessitent d'être caractérisées, il s'agit de la première mise en évidence d'une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales.

Les vésicules sont des bicouches lipidiques refermées sur elles même, séparant ainsi un volume intérieur du milieu extérieur. Elles sont donc utilisées dans de nombreuses applications nécessitant l'encapsulation d'une substance mais également pour la construction d'objets biomimétiques. Une nouvelle méthode simple, appelée continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation (cDICE), a été développée pour la fabrication de vésicules de taille et de contenu finement contrôlés. Ainsi, des vésicules dans la gamme de taille 5-70 μm de diamètre et encapsulant des solutions aussi variées que des colloïdes micrométriques, protéines, cellules, solutions visqueuses (40 mPas) ou solutions salines (>300 mosm), sont produites de façon continue et à fréquence élevée (∼ 150 Hz). Des vésicules " drépanocytaires " ont également pu être produites grace à cette méthode. La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie génétique dont la principale conséquence est la vaso-occlusion de la circulation sanguine. La conception de canaux microfluidiques se rapprochant au mieux des conditions physiologiques (vitesse d'écoulement, concentration d'oxygène, hématocrite...) de la microcirculation a permis une approche biomimétique de la vaso-occlusion, mettant en évidence l'importance de paramètres physiques tels que la géométrie de l'écoulement, le taux d'oxygène, la présence de globules blancs et l'hémoglobine libre en solution sur la formation d'agrégats cellulaires qui pourraient jouer un rôle dans la vaso-occlusion.

Le but de ce travail était de développer des modèles mécaniques de cellules basés sur les vésicules lipidiques géantes unilamellaires (GUVs) et d'étudier les relations entre paramètres mécaniques et comportements sous contraintes. Nous avons tout d'abord réussi à modifier les propriétés structurelles des membranes soit en les décorant de polyélectrolytes (chitosane ou acide hyaluronique), soit en utilisant la transition de phase des lipides pour obtenir des membranes en phase gel. La caractérisation des membranes décorées a montré l'origine électrostatique de l'interaction polyélectrolyte/membrane, et a mis en évidence le rôle de la structure chimique des polymères sur leur conformation à la surface des vésicules. Concernant les membranes en phase gel, nous proposons un protocole astucieux permettant de préserver la forme sphérique de GUVs lors de la diminution de température. Nous avons ensuite montré que la structure de la membrane influence fortement la valeur des paramètres mécaniques et le comportement des GUVs complexes soumises à différentes contraintes (pression osmotique, chocs de pH et de sel, compression entre deux plans (microscopie à force atomique) ou force ponctuelle (extrusion de nanotubes de membrane)). Les expériences d'AFM ont révélées que la décoration rigidifie les membranes, augmentant notamment leur module de compressibilité. Le dégonflement osmotique de GUVs en phase gel a mis en évidence une grande variété de formes polyédriques, que nous avons pu retrouver numériquement en utilisant un modèle 2D élastique adapté. Nous avons enfin proposé une technique originale pour caractériser les vésicules en étudiant leur écoulement dans des géométries confinées.

Trois dérivés d'amino acides sont reconnus d'une manière stéréo sélective par l'albumine du sérum bovin. Cette propriété a été observée dans le cas de la phosphatase alcaline de tissu non spécifique, (TNAP). Des inhibiteurs agissant à trois niveaux distincts sur les processus de minéralisation ont été cherchés: 1) TNAP ; 2) Formation de l'hydroxyapatite (HA); 3) Vésicules maticielles (VMs). Nous avons trouvé que des dérivés de benzothiophènes et de tétramisoles, solubles dans l'eau, sont des inhibiteurs spécifiques de TNAP. Un modèle qui permet de produire du HA, a été développé et a confirmé que les nucléotides sont des inhibiteurs de formation de HA. Nous avons montré que le médicament anti-rhumatisme sinomenine, n'ayant aucun effet sur le TNAP, ainsi que la théophylline ralentissaient tous les deux la formation de HA induits par les VMs. Ces modèles de minéralisation présentent un grand potentiel lors du criblage de médicaments pour le traitement de l'ostéoarthrose

Les bicouches lipidiques sont souvent utilisées comme modèle simplifié des membranes biologiques. Leurs propriétés à l'équilibre sont actuellement bien comprises. Cependant, pour se rapprocher d'une modélisation réaliste des membranes cellulaires, il faut prendre en compte les aspects hors-équilibre de ce type de membrane. L'objectif du travail de recherche, que nous présentons dans ce manuscrit, s'inscrit dans cette direction. Nous avons utilisé, comme membranes modèles actives, des bicouches lipidiques, se présentant sous la forme de vésicules géantes (GUV), contenant la bactériorhodopsine. Cette protéine est une pompe à protons activée par la lumière. Pour caractériser l'effet de l'activité protéique sur les propriétés physiques de ces membranes, nous avons mesuré leurs spectres de fluctuations. Nous avons d'abord visualisé les vésicules géantes par microscopie à contraste de phase. Nous avons ensuite utilisé une méthode de détection et d'analyse des contours des vésicules pour mesurer leurs spectres de fluctuations. En conduisant une étude comparative entre les spectres acquis en activant la protéine, et ceux acquis dans des conditions d'équilibre, nous avons découvert que la présence de l'azide de sodium est nécessaire à l'émergence d'effets actifs mesurables par nos techniques expérimentales. Nous avons aussi montré qu'en présence d'1 mM d'azide de sodium, l'amplitude des fluctuations est amplifiée de manière active. Cette amplification est particulièrement marquée aux petits vecteurs d'onde. La comparaison de ces résultats aux prédictions théoriques montre que l'activité de la bactériorhodopsine induit une baisse de la tension membranaire.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L'électroperméabilisation est un procédé fondé sur l'application d'impulsions électriques qui peuvent induire une perméabilisation réversible de la membrane plasmique de cellules vivantes. En d'autres termes: si vous soumettez une cellule à des impulsions électriques d'amplitude et de durée judicieusement choisies, vous serez alors en mesure d'introduire dans son cytoplasme des molécules d'intérêt autrement incapables de traverser son enveloppe externe, et ce sans affecter sa viabilité. Cette technique a donné lieu à diverses applications, notamment dans le cadre de la lutte contre le cancer ou des thérapies géniques. Comportant moins de risques que les méthodes de transfection virales ou chimiques, son usage est de plus en plus répandu dans la communauté médicale. Cependant, les processus de réorganisation de la membrane, au niveau microscopique, sont encore méconnus et sujets à débat. Une meilleure description de ces phénomènes permettrait d'améliorer l'efficacité et la sécurité des protocoles de traitement. Une stratégie possible pour accroître notre compréhension de l'électroperméabilisation consiste en la réalisation d'expériences sur des systèmes modèles. Cette thèse aborde l'étude de l'effet d'impulsions électriques perméabilisantes de longue durée (quelques millisecondes) sur des systèmes lipidiques artificiels, des vésicules unilamellaires géantes. Il est décrit comment ce travail sur systèmes modèles a contribué à améliorer notre compréhension fondamentale de l'électroperméabilisation, mais aussi comment il a donné lieu à deux catégories d'applications: le chargement de vésicules avec des macromolécules et la mesure de grandeurs physiques caractéristiques des bicouches lipidiques, les tensions de bord. Ces recherches comportent aussi un aspect de modélisation de l'entrée dans des cellules électroperméabilisées de différentes molécules, via la résolution numérique d'équations aux dérivées partielles gouvernant l'évolution de leur concentration. Cette partie apporte des éléments de réponse visant à expliquer les différences observées expérimentalement entre le transfert de petites et de macromolécules.

L'objectif principal de cette thèse est consacré à l'étude de la dynamique et la rhéologie d'une suspension de particules denses qui se comportent comme des fluides complexes. La premier partie de cette thèse est consacrée à l'étude de la déformation, le comportement dynamique et la rhéologie d'une suspension de vésicule (un modèle simple pour les globules rouges) sous l'action d'un écoulement externe appliqué (cisaillement simple et Poiseuille confiné) dans la limite de faible nombre de Reynolds. L'étude basée sur des simulations numériques en utilisant la méthode des intégrales de frontière. Cette étude est inspirée par le comportement des globules rouges dans le système microvasculaire. Notre étude est ensuite consacrée aux effets du confinement et du nombre capillaire sur la forme, le comportement dynamique et la viscosité effective d'une suspension de vésicules. Nous avons montré que pour des membranes rigides (nombre capillaire petit), on peut observer en plus de la forme parachute et pantoufle, les formes suivantes : (i) forme d'oscillation centrée, (ii) forme d'oscillation décentrée et (iii) la forme cacahuète. Egalement, nous avons examiné l'influence du contraste de viscosité sur la dynamique et la rhéologie d'une vésicule. Nous avons montré qu'il existe une phase de "coexistence" entre la forme pantoufle et la forme parachute. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons proposé un modèle analytique et une étude numérique pour étudier les propriétés dynamiques et rhéologiques d'une suspension de particules rigides sous écoulement de Poiseuille confiné. Le débit, la dissipation et la viscosité apparente sont étudiés en fonction de la structure des plaques dans le canal. Egalement, l'étude numérique d'une suspension de particules sphériques (formes des chaînes de particules) est en accord qualitatif avec le modèle analytique qui considère les longues plaques. Cette étude numérique est basée sur une méthode de la dynamique des particules du fluide, où les particules sont représentées par un champ scalaire ayant une viscosité élevée à l'intérieur.

Les vésicules extracellulaires (EVs) apparaissent depuis une dizaine d'années comme de nouveaux biomarqueurs à fort potentiel pour des applications de biopsie liquide. En effet, les EVs portent la signature de leurs cellules émettrices, par le transport de matériel génétique et protéique cellulaire, qui peut être exploité comme outil de diagnostic précoce. L’une des principales limitations actuelles à l'utilisation clinique des EVs est la difficulté à extraire ces nano-objets à partir de biofluides complexes et à standardiser les protocoles de préparation d'échantillon. En effet, de nouvelles technologies sont requises pour effectuer un isolement efficace, bas coût et rapide de sous-populations d'EVs, sans altérer leur intégrité et à partir de faibles volumes d'échantillon. La technique microfluidique de Déplacement Latéral Déterministe (DLD) apparaît comme une des technologies prometteuses pour atteindre ces performances grâce à une purification passive et sans marquage. Les dispositifs de DLD mettent en oeuvre un réseau de piliers générant un tri en taille des particules, et dont les paramètres géométriques permettent de contrôler précisément le diamètre de séparation. Parmi les nombreuses applications de cette technologie dans le secteur biomédical, aucune ne permet pour le moment de réaliser l'extraction complète d'EVs directement à partir du biofluide d'intérêt, sans étapes de purification intermédiaires par centrifugation par exemple. Dans cette perspective, nos développements technologiques ont pour but d'améliorer la fiablilité, l'efficacité et l'intégration des dispositifs de DLD. A partir d'études numériques et expérimentales, nous proposons ici de nouveaux modèles pour anticiper au mieux le comportement des particules lors de la conception de réseaux de DLD. Par ailleurs, dans une approche orientée système, nous proposons également un packaging fluidique des dispositifs de DLD. Plusieurs étapes de tri étant généralement requises pour la purification d’échantillons biologiques, nos développements portent également sur la façon d’interconnecter ces modules au sein d'une configuration en série. Deux applications biologiques sont adressées et démontrent la versatilité de la technologie de DLD : l'isolement de bactéries E. coli à partir de prélèvements sanguins humains - en vue du diagnostic du sepsis - et l'extraction d'EVs dans des milieux de culture cellulaires - avec en perspective la détection d'EVs spécifiques par biopsie liquide. L'étape de préparation d'échantillon ne peut être dissociée de l'étape de caractérisation. C'est pourquoi, l'isolement des EVs devra dans un second temps être couplé à leur analyse au sein d'un dispositif intégré, portable et autonome, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles perspectives vers l'application clinique des recherches actuelles sur les EVs. / Over the past decades, Extracellular Vesicles (EVs) have demonstrated strong potential as new biomarkers for liquid biopsy. Indeed, since EVs are fingerprints of parent cells, they can be exploited as early diagnostic tools. However, owing to their small size and high heterogeneity, EVs are challenging to extract from biofluids. In particular, reproducible and standardized protocols are required to perform fast, efficient, and cost-effective preparation of undamaged EV subpopulations from limited sample volumes. Deterministic Lateral Displacement (DLD) appears to be a promising microfluidic technology for this preparation by means of passive and label-free separation. DLD performs size-based separation of particles around a critical diameter that can be fine-tuned according to design parameters in an array of micropillars. Across the numerous biotechnological applications of DLD, none has yet successfully performed the complete extraction of EVs from unprocessed biofluids. This is the underlying motivation of this thesis, which outlines technological enhancements that make DLD separation more predictable, efficient, and easy-to-integrate. Based on both numerical and experimental developments, predictive models are proposed in order to anticipate particle behavior and to help in the design of efficient DLD devices. In addition to the optimization of single DLD devices, this thesis also addresses the issue of system integration. An innovative approach of serial connection between DLD modules is proposed to address the sequential sorting of particles from a complex biofluid and ensure that there is no loss of function of individual DLD devices when operated alone or in series. Two biological applications illustrate the potential of DLD-based sample preparation systems: the isolation of E. coli bacteria from human blood samples for sepsis diagnostics and the extraction of EVs from cell culture media with the perspective of liquid biopsy applications. And as sample preparation cannot be dissociated from detection or characterization, this thesis moreover highlights the potential integration of DLD in an all-in-one microfluidic device for both sample preparation and analysis of extracted EVs. Such a portable and autonomous device could overcome some of the current limitations with regard to the clinical use of EVs.