Les vésicules matricielles sont des organites extracellulaires impliques dans les processus de minéralisation. Nous avons détermine le mode d’action du strontium, ion contenu dans le principe actif d’un médicament antiostéoporotique sur les vésicules matricielles. Nous avons montre que le strontium agit en fonction de la concentration aussi bien sur la formation de l’hydroxyapatite que sur les activités phosphomonoéstérase et phosphodiestérase de la phosphatase alcaline tissu non spécifique. Pour des faibles concentrations (comprises entre 25 et 100^M), le strontium augmente l’activité phosphodiestérase et inhibe partiellement l’activité phosphomonoestérase. La balance entre la production de PPi, inhibiteur de la minéralisation et la production de Pi, essentiel a la formation d’hydroxyapatité pourrait être affectée par le strontium. / The matrix vesicles are extracellular organelles implicated in the process of mineralization.We determined the mode of action of strontium, ion contained in the active principle of an antiosteoporotic drug on the matrix vesicles. We showed that the action of strontium is concentration dependent on the hydroxyapatite formation and on phosphomonoesterase and phosphodiesterase activities of the tissue non specific alkaline phosphatase. At low concentration (between 25 and 100^M), strontium increased phosphodiesterase activity and inhibited partly phosphomonoesterase activity. The balance between the production of PPi, inhibitor of mineralization and the production of Pi, essential in the formation of hydroxyapatite could be affected by the strontium.

La déformation et le comportement dynamique d'une vésicule sous l'action d'un écoulement externe appliqué (cisaillement simple et Poiseuille) est étudié dans la limite de faibles nombres de Reynolds. Les cas de géométries non-confinée et confinée sont considérés. On fait usage de plusieurs méthodes: (i) un calcul analytique tridimensionnelle (théorie de faible déformation) (ii) des simulations bidimensionelle (méthodes de Boltzmann sur réseau et intégrale de frontière) dans le but de résoudre les équations hydrodynamiques correspondantes et de suivre explicitement la dynamique de la vésicule. La théorie analytique de faible déformation est utilisée pour construire le diagramme de phase résumant tous les régimes dynamiques connus pour une vésicule (chenille de char, bascule et vacillation-respiration) sous un écoulement de cisaillement. L'impacte de la variation des paramètres, contrôlant la dynamique, sur l'évolution de différentes quantités caractérisant chaque régime dynamique d'une vésicule est présenté. On utilise également la méthode de Boltzmann sur réseau afin de simuler la dynamique d'une vésicule dans une géométrie confinée (e.g. un micro-canal). Comme cas test, les formes d'équilibre d'une vésicule et son mouvement de chenille de char sous cisaillement ont été analysés. L'effet du confinement sur la dynamique de la vésicule a été examiné. La migration latérale d'une vésicule placée dans un écoulement de Poiseuille non-confiné et semi-confiné est traité en utilisant des simulations basées sur la méthode d'intégrale de frontière. Pour le cas de la géométrie non-confinée, on a trouvé que le caractère non linéaire de l'écoulement de Poiseuille combiné à la déformabilité de la vésicule, induit une migration latérale des vésicules vers le centre de l'écoulement. La présence d'une paroi délimitant le fluide externe induit également une force de portance. On a analysé la compétition entre la force de portance due à la paroi et celle du la courbure de l'écoulement de Poiseuille. Une loi donnant la vitesse de migration latérale (en fonction des paramètres caractérisant la vésicule et l'écoulement) est proposée et est en accord avec les résultats expérimentaux .

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes : migration des granules de sécrétion (GS) vers la membrane plasmique (MP), accostage et arrimage des GS à la MP, exocytose ou fusion des GS avec la MP permettant la libération du contenu des GS dans le milieu extracellulaire. Bien que très utiles, les méthodes électrophysiologiques et électrochimiques ne donnent d'informations ni sur la localisation ou les mouvements des GS avant fusion, ni sur le devenir de la membrane des GS après fusion. Plusieurs techniques d'imagerie in vivo cherchent à répondre à ces questions. La mieux adaptée est la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente (TIRFM) qui permet d'observer les mouvements de GS individuels à proximité immédiate de la MP. Nous avons appliqué cette approche à l'étude de la sécrétion des cellules BON (lignée dérivée d'un carcinome). Leur stimulation a été faite par la technique du Ca cagé, appliquée pour la première fois en microscopie TIRF. Après exocytose, nous avons observé et quantifié le phénomène de persistance de la forme d'une partie des GS, ainsi que l'exocytose séquentielle de GS situés plus à distance de la MP. De manière surprenante, l'exocytose séquentielle représente ~25% des événements d'exocytose. L'analyse détaillée des trajectoires en 3 dimensions des GS avant leur fusion nous a montré qu'environ 40% des GS effectuent une transition de 20 nm vers la MP, puis fusionnent dans un délai de ~3 s. Cette observation originale de la transition entre l'accostage et l'arrimage des GS pourrait être la traduction d'évènements moléculaires impliqués dans l'amorçage des GS, nécessaire à la fusion.

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes. Les granules de sécrétion (GS) contenant ces hormones sont formés au niveau du réseau trans-golgien puis migrent jusqu'à la périphérie de la cellule. Ces hormones sont libérées dans le milieu extérieur par exocytose en cas de stimulation de la cellule. Grâce à l'observation des GS situés dans la région juxta-membranaire par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente, les mouvements de ces organites ont été étudiés à l'échelle du granule unique. Une méthode d'analyse permettant la mise en évidence de comportements transitoires au sein des trajectoires tridimensionnelles des GS a été mise au point. Grâce à son application à l'étude des effets de drogues du cytosquelette et à des observations en double marquage, nous avons pu associer chaque type de mouvements décrit par les GS à un environnement particulier (GS lié à la membrane plasmique, au cytosquelette d'actine ou de microtubules). Nous avons de plus étudié le rôle du complexe protéique Rab27A/MyRIP/Myosine Va lors de la capture des GS en périphérie de la cellule et leur accrochage aux filaments d'actine.

Les membranes biologiques sont le centre de nombreux phénomènes hors équilibres qui sont essentiels pour les cellules. Pour une description physique plus complète des biomembranes, nous avons étudié, théoriquement et expérimentalement, les effets de deux processus hors équilibres sur les propriétés de membranes artificielles. Premièrement, nous avons développé une théorie, complètement covariante, des membranes qui sont soumises à des échanges de matériels biologiques (i.e. lipides, enzymes et protéines membranaires). Avec cette description, l'étude des fluctuations de telles membranes nous a montré que, sous certaines conditions, celles-ci peuvent devenir instables en développant un long et fin tubule qui présente certaines similitudes morphologiques avec les membranes des organelles. Nous avons appliqué ce modèle avec succès pour décrire le phénomène de fusion observé expérimentalement entre de petites et de grosses vésicules chargées mimant le phénomène d'endocytose. Deuxièmement, nous avons étudié les effets de l'activité des protéines membranaires sur le spectre des fluctuations. Un modèle théorique qui prend en compte l'activité hors-équilibre des protéines prévoit une amplification des fluctuations lorsqu'un bruit hors-équilibre s'ajoute au bruit thermique. Pour tester expérimentalement ces prévisions, nous avons reconstitué une pompe ATP-dépendante, l'ATPase-Ca2+ dans des vésicules géantes unilamellaires. Puis grâce à la technique d'aspiration par micropipette, nous avons mis en évidence à la fois une décroissance du module de courbure liée à la présence des protéines dans la membrane, et une augmentation des fluctuations dans les membranes actives.

Nous avons développé une nouvelle technique de reconnaissance de contours de vésicules lipidiques géantes en microscopie à contraste de phase permettant une analyse en temps réel avec une très bonne précision. Nous obtenons ainsi le spectre de fluctuation d'une vésicule et nous avons développé le formalisme nécessaire à une comparaison avec les théories développées sur des membranes planes. Nous avons appliqué notre technique à l'analyse de vésicules purement lipidiques et nous mesuré le spectre de fluctuations. Les modules de courbure déduits correspondent aux valeurs de la littérature. Cette technique nous a aussi permis d'étudier deux types de membranes hors équilibre : d'une part des liposomes contenant de la bactériorhodopsine où nos résultats ne s'interprètent pas avec la théorie actuelle des membranes actives ; notre technique a été aussi appliquée à des membranes en présence d'apport de lipides, et nous avons pu mettre en évidence l'apparition d'une tension négative.

La nature utilise des liaisons faibles (liaisons hydrogène, liaisons par chélation, etc.) pour assurer la cohésion d'édifices macromoléculaires (structure tertiaire des protéines, double hélice de la molécule d'ADN, etc.) et permettre la formation de structures transitoires qui nécessitent d'être créées et détruites rapidement (complexes récepteur-ligand, complexes ion-acide aminé, etc.). Les énergies de ces liaisons sont relativement peu connues notamment en raison du nombre important d'interactions agissant en parallèle. Une méthode permettant de les évaluer consiste à réaliser une mesure d'adhésion entre deux surfaces portant les groupes fonctionnels appropriés isolés de leur environnement naturel. Nous avons utilisé un lipide dont la tête polaire est constituée du groupement NTA, qui est capable de former des liaisons hydrogène et qui, dans certaines conditions physico-chimiques, peut fixer un ion nickel et former ainsi une liaison par chélation. Diverses mesures de forces ont été réalisées à l'aide de la technique SFA entre des bicouches de lipide NTA ou NTA-Ni. Des expériences réalisées dans l'eau pure ont permis de mesurer l'énergie d'une liaison hydrogène: environ 1 kBT. Des mesures de forces réalisées dans le Tris et confirmées par des mesures d'adhésion entre vésicules fonctionnalisées ont conduit à une estimation de l'énergie d'une liaison par chélation: environ 2 kBT. Le lipide NTA-Ni a également été utilisé comme un outil permettant de fixer des récepteurs his-tagués des rétinoïdes sur les surfaces d'étude du SFA. Nous avons utilisé un lipide dont la tête polaire contenait un rétinoïde synthétique et réalisé une mesure de forces entre une monocouche de ce lipide rétinoïde et une monocouche de lipide NTA-Ni portant les récepteurs. Des mesures de forces ont également été effectuées entre deux monocouches de lipide rétinoïde; elles ont mis en évidence de très grandes énergies d'adhésion dues à l'effet combiné des forces hydrophobes et des liaisons hydrogène.

La membrane plasmique de la cellule est composée de lipides et interagit notamment avec le squelette de la cellule (le cytosquelette), par l'intermédiaire de protéines d'ancrages et de lipides clefs qui jouent un rôle spécifique dans certains types d'interactions. Parmi les protéines intervenant dans l'ancrage direct de la membrane plasmique au cytosquelette, des protéines de la famille des ERM (Ezrine, Radixine, Moésine) peuvent interagir spécifiquement avec un lipide, le phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2), d'une part et avec l'actine du cytosquelette d'autre part. Dans le but de comprendre les interactions entre membrane plasmique et cytosquelette, nous avons réalisé des expériences in vitro sur des systèmes comportant un nombre minimal de constituants : des vésicules géantes (GUV) contenant du PIP2, de l'ezrine recombinante et de l'actine purifiée. Nous avons mis en évidence que la liaison au PIP2 induit des changements conformationnels de l'ezrine. L'ezrine est alors capable d'interagir avec les filaments d'actine. Nous avons caractérisé quantitativement l'incorporation de PIP2 dans la membrane de vésicule géantes, et montré que l'interaction de l'ezrine avec les vésicule géante contenant du PIP2, induit un partitionnement du lipide dans la bicouche lipidique et conduit à la formation d'agrégats de PIP2 et d'ezrine sur la membrane. La connaissance des effets de l'ezrine sur les membranes contenant du PIP2 et la connaissance des différents mécanismes se produisant lors des interactions permettra de définir plus précisément le rôle de l'ezrine in cellulo.

En 1997, le volcan Soufrière Hills a connu deux périodes d'activité vulcanienne, impliquant 88 explosions. Chacune de ces explosions a vidangé la partie supérieure du conduit sur 0,5 à 2 km. Ce travail de thèse visait à comprendre et quantifier par analyse texturale des produits naturels, les processus de vésiculation du magma se produisant durant ces explosions vulcaniennes. Cette étude comporte des mesures en 2D par analyses d'images, des mesures en 3D par microtomographie à rayons X, une étude texturale détaillée de bombes en croûte de pain et des analyses chimiques comprenant notamment des mesures de teneurs en eau (par microspectrométrie Raman) et en chlore dans les verres matriciels. L'analyse en 2D nous a permis de mettre en évidence la présence de plusieurs populations de vésicules. Les plus petites (inférieures à quelques dizaines de microns) sont syn-explosives, tandis que la plupart des grandes vésicules (> plusieurs centaines de μm), dans les ponces, sont pré-explosives. Environ 15% des grandes vésicules dans les ponces et toutes celles présentes dans les bombes en croûte de pain sont créées par la fracturation synexplosive de phénocristaux d'amphiboles. Une population de vésicules de taille intermédiaire, formées par la coalescence des petites vésicules, est visible dans les ponces. La nucléation syn-explosive s'est produite de façon hétérogène sur des microlites de magnétite, les bulles ont ensuite grandi principalement par décompression. La coalescence a affecté toutes les bulles plus grandes que quelques dizaines de microns. La microtomographie à rayons X nous a permis d'obtenir une vision en 3D du système. Pour la première fois, des distributions de tailles de vésicules et de cristaux ont été réalisées jusqu'à ~2 μm en combinant plusieurs jeux de données. Les observations effectuées ainsi que les paramètres quantitatifs extraits de ces données sont en accord avec ceux issus de l'analyse en 2D. De plus, la 3D nous a permis de contraindre quantitativement la coalescence. Celle-ci s'est produite entre vésicules voisines, sans distinction de tailles. L'analyse texturale des bombes en croûte de pain a montré que ces échantillons ont subi un processus de vésiculation intermédiaire entre les échantillons denses provenant du bouchon dégazé et les ponces. La vésiculation post-fragmentation de leur intérieur représente le mécanisme principal provoquant la fracturation de la bordure plus dense, donnant l'aspect croûte de pain. Les analyses chimiques ont montré qu'il existe une corrélation entre la teneur en eau des verres matriciels et la texture des échantillons. Les ponces peuvent retenir beaucoup d'eau (jusqu'à 2,8 %pds) tandis que les échantillons denses et les bombes en croûte de pain sont plus dégazés. La teneur en chlore mesurée est constante dans tous les échantillons et peut s'expliquer par un coefficient de distribution faible (~5) entre la phase vapeur et le liquide. Le dégazage s'est fait en système partiellement ouvert entre deux explosions successives (~10h). Nous avons démontré que la vésiculation syn-explosive était importante lors de chaque explosion vulcanienne de la Soufrière Hills en 1997 et que le développement des textures était contrôlé par l'intervalle de temps entre la décompression et le début du refroidissement de la surface du claste. Les taux de décompression syn-explosifs estimés à partir des densités numériques de vésicules (> 0,3-6,5 MPa s-1), sont cohérents avec ceux prédits par les modélisations numériques.

Les vésicules géantes sont souvent utilisées comme modèles des membranes cellulaires. On a ici examiné :<br />1. leur adhésion spécifique via deux « colles moléculaires » :<br />– colle faible : fragments terminaux EC12 de E-cadhréine. Cette protéine<br />est impliquée dans la formation de tissus et dans de nombreux phénomènes<br />cancéreux. L'analyse statistique de l'adhésion bicouche supportée/vésicule<br />décorées par EC12 montre qu'existe une adhésion faible sensible au calcium et à une mutation des fragments ;<br />– colle forte : couple streptavidine/biotine. Lors de l'adhésion sur une bi-couche supportée, la tension de la vésicule joue fortement sur la morphologie du contact et sa cinétique.<br />2. la dynamique de pores transitoires (dus à une mise sous tension par éclairement<br />intense), en présence de tensioactif capable de s'insérer à leur bord. La tension de ligne en fonction de la concentration en tensioactif est un isotherme 1D, analysé en termes d'excès de ligne et d'énergie d'adsorption du tensioactif.