Lorsque le système nerveux central des mammifères est lésé, un ensemble de réactions secondaires impliquant l’inflammation et une gliose réactive conduit à la formation d’une cicatrice gliale qui inhibe la régénération axonale. Dans le cas d’une lésion de la moelle épinière l’absence de réparation efficace des réseaux axonaux lésés peut conduire à la paraplégie ou à la tétraplégie. Aujourd’hui on estime à plus de 2,5 millions le nombre d’individus dans le monde souffrant de ces handicaps et il n’existe à ce jour aucun traitement validé pour améliorer la situation des patients. Cependant, certaines approches de thérapie moléculaire, cellulaire, et de réadaptation semblent toutefois prometteuses sur modèle animal. La dégradation des chondroitines sulfates protéoglycanes (CSPGs), principales protéines inhibitrices de la cicatrice gliale, par clivage des coeurs protéiques et ou des chaînes latérales glycosaminoglycanes favorise la régénération axonale et entraîne une récupération fonctionnelle. Des études ont montré que la métalloprotéase matricielle MMP‐2 est capable de dégrader le coeur protéique de ces CSPGs. Par ailleurs, les cellules engainantes de la muqueuse olfactive (CEOs) occupent une place privilégiée parmi les types cellulaires proposés dans la thérapie cellulaire en favorisant la croissance axonale et la récupérationfonctionnelle après lésion de la moelle épinière. Cependant, les mécanismes qui sous‐tendent les propriétés régénératrices des CEOs restent essentiellement inconnus. Dans notre Thèse, nous présentons nos travaux en trois parties. Dans la première, nous montrons in vitro que : i) les CEOs en culture primaire secrètent des taux élevés de MMP‐2, au moins en partie active ; ii) les gélatinases MMP‐2 et MMP‐9 présentent une sécrétion vésiculaire golgi‐dépendante; iii) la distribution des vésicules contenant les MMPs est liée à celle du cytosquelette et des moteurs moléculaires qui participent probablement à une sécrétion focalisée de ces molécules en fonction d’interactions entre le milieu extracellulaire et le cytosquelette ; iv) les MMPs peuvent avoir une distribution nucléaire dans les CEOs ; v) MMP‐2 jouerait un rôle dans la migration des CEOs, un processus important dans leurs capacités à réparer le tissu nerveux. Dans la seconde partie de notre thèse, nous avons développé un modèle de cicatrice gliale in vitro et nous montrons que : i) la migration des cellules astrocytaires de la cicatrice gliale in vitro est sensible aux effets des inhibiteurs des MMPs, contrairement aux cellules microgliales ; ii) les CEOs lèvent l’inhibition de croissance axonale due aux cellules astro‐microgiales ; iii) le potentiel des CEOs à créer un environnement permissif à la croissance axonale serait lié aux gélatinases sécrétées par ces cellules, en particulier MMP‐2. Dans la troisième partie de notre Thèse, nous avons évalué in vivo si MMP‐2 contribuait aux effets bénéfiques des CEOs. Nous montrons pour la première fois, dans un model animal d’hémisection de la moelle épinière, et en utilisant des approches anatomiques, électrophysiologiques et d’analyse de la locomotion, qu’une administration chronique de MMP‐2 recombinante : i) augmente le nombre et le diamètre des axones du coté distal du site de lésion ; ii) restaure la réponse évoquée du reflexe‐H distal au site de lésion ; iii) améliore la réponse respiratoire à la fatigue musculaire induite électriquement et, iv) le plus important, améliore la récupération de la locomotion. L’ensemble de notre travail suggère que MMP‐2 sécrétée par les CEOs jouerait un rôle important des les propriétés bénéfiques de ces cellules lorsqu’elles sont transplantées dans des sites de lésions de la ME, et que cette MMP présente un réel potentiel thérapeutique qui reste à explorer. / When the mammalian central nervous system is injured, a set of secondary reactions involving inflammation and reactive gliosis leads to the formation of a glial scar that inhibits axonal regeneration. In the case of a spinal cord lesion, the lack of effective repair of injured axonal networks can lead to paraplegia or quadriplegia. Today it is estimated that more than 2.5 million people are suffering from these handicaps worldwide, and there is as yet no validated treatment to improve the situation of patients. However, based on animal models, some molecular, cellular, and rehabilitation therapy approaches seem promising. Degradation of chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), the main inhibitory protein of the glial scar, by cleavage of either the protein core or side chains glycosaminoglycans, promotes axonal regeneration and leads to functional recovery. Studies have shown that the matrix metalloproteinase MMP-2 is capable of degrading the core protein of the CSPG. In addition, olfactory mucosa ensheathing cells (OECs) represent the most promising cell type for promoting axonal growth and functional recovery after spinal cord injury. However, the mechanisms underlying the regenerative properties of OECs remain essentially unknown. Here, we present our work in 2 parts. First, we show in vitro that: i) OECs in primary culture secrete high levels of active MMP-2; ii) both gelatinases, MMP-2 and MMP-9, have a vesicular Golgi-dependent secretion; iii) the distribution of vesicles containing the MMPs is linked to cytoskeleton and molecular motors distribution, which are probably involved in focused secretion of these molecules; iv) MMPs may have a nuclear distribution in OECs; v) MMP-2 plays a role in the migration of EOCs, an important process in their ability to repair nerve tissue. In the second part of my work, we evaluated whether the MMP-2 contributed to the beneficial effects of EOCs. We used an in vivo approach and we show for the first time, in an animal model of hemisection of the spinal cord, and using anatomical, electrophysiological analysis of locomotion approaches, that a chronic administration of recombinant MMP-2: i) increases the number and diameter of axons in the distal side of the site of injury; ii) restores the response-evoked H-reflex distal to the lesion site, iii) enhances the respiratory response to electrically-induced muscle fatigue, and iv) most importantly, improves the recovery of locomotion. All our work suggests that MMP-2, secreted by the EOCs, plays an important role in the recovery properties of these cells, when transplanted into spinal cord lesions, and that this MMP has a real therapeutic potential that remains to be explored.

Nous démontrons qu'il est possible de former des bicouches fluides non phospholipides en milieu aqueux avec un mélange d'acide palmitique (PA), cholestérol (Chol) et sulfate de cholestérol (Schol) avec une proportion molaire de 30/28/42. Ces liposomes non phospholipidiques peuvent maintenir un gradient de pH (pHinterne 8 / pHexterne 6) sur une période 100 fois plus longue que les liposomes faits de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de cholestérol (60/40 mol/mol). De plus, ces LUV non phospholipidiques protègent l'acide ascorbique d'un milieu oxydant (1 mM de fer (III)). Une fois piégé dans les liposomes, l'acide ascorbique présente une vitesse de dégradation similaire à celle obtenue en l'absence de fer(III). Ces performances illustrent la perméabilité exceptionnellement limitée de ces liposomes, ce qui implique qu'ils peuvent présenter des avantages comme nanocontenants pour certaines applications. D'autre part, des vésicules unilamellaires géantes (GUV pour Giant Unilamellar Vesicles) ont été formées à partir d'un mélange d'acide palmitique et de cholestérol (30/70 mol/mol). Ces GUV sont stables sur l'échelle de temps de semaines, elles ne s'agrègent pas et elles sont sensibles au pH. Afin d'établir la formation des GUV, l'imagerie par microscopie confocale à balayage laser a été utilisée. Deux sondes fluorescentes ont été utilisées: le rouge du Nile, une sonde hydrophobe qui s'insère dans le cœur hydrophobe des bicouches lipidiques, et la calcéine, une sonde hydrophile qui a été emprisonné dans le réservoir interne des GUV. Cette approche a permis l'observation des parois des GUV ainsi que de leur contenu. Ces résultats montrent la possibilité de former de nouveaux microcontenants à partir d'un mélange d'un amphiphile monoalkylé et de stérol. / First, we demonstrate that it is possible to form non-phospholipid fluid bilayers in aqueous milieu with a mixture of palmitic acid (PA), cholesterol (Chol), and cholesterol sulfate (Schol) in a molar proportion of 30/28/42. These non-phospholipid liposomes can sustain a pH gradient (pHinternal 8 / pHexternal 6) 100 times longer than LUVs made of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and cholesterol (60/40 mol/mol). These non-phospholipid LUVs are shown to protect ascorbic acid from an oxidizing environment (1 mM Iron (III)). Once entrapped in these liposomes, ascorbic acid displays a degradation rate similar to that obtained in the absence of Iron (III). This ability illustrates the exceptionally limited permeability of these liposomes, indicating that they can present advantages as nanocontainers for some applications. Second, Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) were formed from a mixture of palmitic acid and cholesterol (30/70 mol/mol). These GUVs were stable over weeks, did not aggregate, and were pH-sensitive. In order to establish their formation, confocal laser scanning microscopy imaging was carried out. Two fluorescent probes were used: Nile Red, a hydrophobic probe that inserted in the hydrophobic core of lipid bilayers, and calcein, a hydrophilic probe that was trapped in the GUV internal pool. This approach allowed observation of both the walls of the GUVs as well as their entrapped content. These results show the possibility to form novel microcontainers from a mixture of a monoalkylated amphiphile and sterols.

L’ischémie/reperfusion (I/R) occurrente à toutes transplantations d’organe solide, constitue un stimulus pro-autophagique/pro-apoptotique pour les cellules endothéliales. Nous avons récemment démontré que les cellules endothéliales apoptotiques (CEapo) sécrètent des vésicules apoptotiques exosome like (ApoExo) qui induisent une réponse auto-immune et accélèrent le rejet vasculaire dans un modèle de greffe aortique chez la souris. Ces ApoExo qui diffèrent des corps apoptotiques classiques par leur structure et leur contenu protéique contiennent le fragment C-terminal du perlécan, LG3. Le LG3, un auto-antigène d’importance en transplantation, favorise le remodelage vasculaire et est augmenté en circulation chez les patients greffés rénaux atteints d’un rejet vasculaire. De plus, la présence d’anticorps anti-LG3 avant la transplantation est associée à un risque plus élevé de développer un rejet vasculaire chez des patients greffés du rein et à la perte du greffon à long terme. Il est connu que la génération du fragment LG3 implique la protéolyse du perlécan par la cathepsine L, une protéase lysosomiale, mais le mécanisme de transport de ce fragment au sein des ApoExo est encore inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité lysosomiale et l’autophagie jouent un rôle important dans la maturation et le chargement du LG3 dans les vésicules ApoExo sécrétées par les CEapo. Une étude longitudinale de microscopie électronique chez les cellules endothéliales humaines carencées en sérum pendant 1h, 2h et 3h, nous a révélé la présence du perlécan / fragment LG3 au sein de compartiments autophagiques (autophagosomes et autophagolysosomes) à différentes étapes du processus autophagique. Après 3 heures de carence en sérum, nous avons identifié le fragment LG3 dans des vésicules membranaires situées au sein de grands réseaux vacuolaires s’apparentant à des autophagolysosomes. L’inhibition de la cathepsine L, de l’acidification du lysosome et de l’autophagie diminuent la présence du fragment LG3 dans les vésicules ApoExo sans affecter la sécrétion de vésicules démontrant donc le rôle de l’autophagie dans l’intégration du fragment LG3 au sein des ApoExo. Toutefois, l’injection de vésicules ApoExo LG3-, provenant de cellules murines aortiques traitées à la bafilomycine, dans un modèle murin de greffe aortique induit une réponse auto-immune anti-LG3 ainsi qu’un remodelage vasculaire à des niveaux similaires aux souris ayant reçu des ApoExo véhicule. Une analyse protéomique de ces vésicules ApoExo LG3-, nous a révélé que la bafilomycine modifie le contenu protéique des ApoExo en induisant une augmentation de la présence de protéines lysosomiales et de la matrice extracellulaire dont le perlécan. Ceci suggère que la présence du motif LG3 au sein du perlécan natif non clivé dans les ApoExo LG3- pourrait être responsable de la mise en place de la réponse anti-LG3 observées chez les souris. Les travaux de ce doctorat ont permis de mettre en évidence que l’autophagie dans les cellules endothéliales productrices d’ApoExo ne régule pas l’immunogénicité des ApoExo. Cependant, elle régule au sein des cellules endothéliales apoptotiques le transport et le clivage du perlécan qui lui est immunogène. En effet, l’autophagie module les différentes formes de perlécan natif et clivé sécrétées dans les ApoExo. L’étude chez la souris greffée nous a donc permis de considérer non plus l’implication du fragment LG3 mais l’implication du motif LG3 présent au sein du perlécan natif non clivé et de ses différentes formes intermédiaires dans la réponse auto-immune anti-LG3 et le rejet vasculaire. La modulation de la sécrétion du perlécan et du LG3 dans les ApoExo constitue une cible thérapeutique potentielle afin de diminuer la réponse auto-immune pouvant augmenter le dommage vasculaire après la greffe / Ischemia/reperfusion (I/R) occurring in all solid organ transplantation, constitute a proautophagic / pro-apoptotic stimulus on endothelial cells. We recently demonstrated that apoptotic endothelial cells (CEapo) secrete apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) that induce autoimmune response and accelerate vascular rejection in a mouse aortic transplant model. These ApoExo, that differ from classical apoptotic bodies in structure and protein content, contain the C-terminal fragment of perlecan, LG3. LG3, an autoantigen of importance in transplantation, promotes vascular remodeling and is increased in circulation in renal transplant patients undergoing vascular rejection. In addition, the presence of anti-LG3 antibodies prior to transplantation is associated with a higher risk of developing vascular rejection in kidney transplant patients and long-term graft loss. It is known that the generation of LG3 fragment involves the proteolysis of perlecan by cathepsin-L, a lysosomal protease, but the mechanism of export of this fragment within ApoExo is still unknown. We hypothesized that lysosomal activity and autophagy play an important role in the maturation and the secretion of LG3 in ApoExo vesicles secreted by CEapo. Longitudinal electron microscopy study after 1h, 2h and 3h in serum starved endothelial human cells revealed the presence of perlecan / LG3 fragment within autophagic compartments (autophagosomes and autophagolysosomes) at different stages of the autophagic process. After 3 hours of serum starvation, we identified LG3 fragment in membrane vesicles located within large vacuolar networks reminiscent of autophagolysosomes. Inhibition of cathepsin-L, of lysosomal acidification and of autophagy decrease the presence of LG3 fragment in ApoExo vesicles without affecting vesicle secretion thus demonstrating the role of autophagy in the secretion of LG3 fragment within ApoExo. However, Injection of ApoExo LG3- vesicles from bafilomycin-treated aortic murine cells into a murine aortic transplant model induces autoimmune anti-LG3 response and vascular remodeling at levels similar to the ApoExo vehicle mice control group. Proteomic analysis of ApoExo from bafilomycin-treated aortic murine cells has demonstrated that bafilomycin modifies ApoExo protein content by inducing an increase of the presence of lysosomal proteins and the extracellular matrix, including perlecan. This suggests that the presence of LG3 motif in uncleaved native perlecan in ApoExo LG3- could be responsible for the establishment of the anti-LG3 response as well as the vascular remodeling observed in mice. Collectively, these results demonstrate that autophagy in endothelial cells producing ApoExo does not regulate the immuogenicity of ApoExo. However, it regulates within apoptotic endothelial cells the processing and cleavage of perlecan who is immunogenic. Indeed, autophagy modulates the different forms of native and cleaved perlecan secreted in ApoExo. Grafted mice study thus allowed us to consider neither the involvement of the LG3 fragment but the implication of the LG3 motif present in the uncleaved native perlecan and its intermediate forms in the anti-LG3 autoimmune response and vascular rejection. Modulating perlecan and LG3 secretion in ApoExo vesicles is a potential therapeutic target to reduce the autoimmune response that can increase vascular damage after transplantation.

Toutes les cellules libèrent plusieurs types de vésicules extracellulaires (VEs) qui transportent protéines, lipides et acides nucléiques. Ces vésicules de petite taille se retrouvent dans tous les fluides biologiques tel que le sang et la lymphe et interagissent avec les cellules environnantes. Le système lymphatique constitue une voie de prédilection pour la mobilisation des accepteurs de cholestérol à partir de la paroi artérielle. Nous avons démontré dans un modèle murin qu’une dysfonction lymphatique précède la formation de la plaque d’athérome et que cette dysfonction touche a priori la capacité de contraction des vaisseaux collecteurs. À la base de toutes ces observations, nous avons émis l’hypothèse que les VEs contribuent à la dysfonction lymphatique liée à l’athérosclérose. Pour répondre à ceci, nous avons mis en place un projet translationnel composé de deux groupes de sujets sains, sans maladie cardiovasculaire, qui se distinguent par la présence d’antécédents familiaux d’accidents cardiovasculaires prématurés chez un parent du premier degré. Nous avons quantifié plusieurs sous-types d’intérêt de VEs en circulation à partir du plasma exempt de plaquettes, par cytométrie en flux ultraspécialisés dans la détection de petites particules (> 100 nm) combiné à d’autres techniques complémentaires standardisées. Ensuite, nous avons évalué la fonction lymphatique grâce à l’imagerie par proche infrarouge après injection du vert indocyanine (ICG). Nos résultats préliminaires sont prometteurs quant aux rôles des VEs et de la dysfonction lymphatique dans le développement de l’athérosclérose et corroborent avec nos observations faites chez la souris. Les sujets avec antécédents familiaux de maladie cardiovasculaire (MCV) présentent des signes de dysfonction lymphatique avant même l’apparition de plaques d’athérome subcliniques. La réponse mécano-sensible de leurs vaisseaux collecteurs paraît défectueuse et est observable de concert avec un profil de VEs qui présument une atteinte lymphatique. Ces résultats restent à être confirmer avec le recrutement de sujets additionnels et l'évaluation de la corrélation avec le score de risque polygénique de développer une MCV, dans l’objectif ultime de faire des VEs et de la fonction lymphatique de nouveaux biomarqueurs dans l’identification précoce des MCV. / All cell types release extracellular vesicles (EVs) that carry different types of cellular cargo, such as proteins, lipids and nucleic acids. These small vesicles are found in all biological fluids including blood and lymph and can interact with neighboring cells. The lymphatic system is a preferred route for the mobilization of cholesterol from the arterial wall. We have demonstrated in a mouse model that lymphatic dysfunction precedes the development of atherosclerosis and that that this dysfunction affects the contraction capacity of the collecting vessels. Based on these observations, we hypothesized that EVs contribute to atherosclerosis-associated lymphatic dysfunction. Therefore, we have initiated a translational study involving two groups of healthy subjects that differ in their risk of cardiovascular disease (CVD). We quantified several subtypes of circulating EVs on platelet-free plasma by ultraspecialized flow cytometry in the detection of small particles (> 100 nm) combined to other state-of-the art complementary techniques. Next, we assessed the lymphatic function using near-infrared imaging and injection of indocyanine green (ICG). Our preliminary results are promising for the role of EVs and lymphatic dysfunction in the development of atherosclerosis and corroborate with our observations made in mice. Individuals at high risk of CVD have signs of lymphatic dysfunction even before the onset of subclinical atherosclerosis. The mechano-sensitive response of their collecting vessels appears to be defective and is observable in concert with a profile of EVs that presume lymphatic damage. These results remain to be confirmed with the recruitment of additional subjects and the assessment of the correlation with the polygenic risk score of developing a CVD, in the hope of making these specific EV subsets and lymphatic function new biomarkers in the early detection of CVD.

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Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine, favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy. Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC. Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake. Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure. Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.

L’asthme est une des maladies chroniques les plus prévalentes, affectant environ 300 millions d’individus dans le monde et causant plus de 400 000 décès annuellement. La condition se caractérise par une hyperréactivité bronchique, de l’inflammation pulmonaire et des changements structuraux (remodelage) des voies respiratoires. Bien que l’inflammation soit le plus souvent de type éosinophilique dans l’asthme, une proportion importante des patients affectés par la forme sévère de la maladie présente plutôt une infiltration des voies respiratoires par les neutrophiles. Cette inflammation neutrophilique a été associée à plusieurs issues cliniques négatives, notamment à une mauvaise réponse aux traitements, à une obstruction respiratoire permanente et à la mortalité. Malgré l’importance de ces conséquences cliniques pour les patients affectés, le rôle de l’inflammation neutrophilique dans la pathophysiologie de l’asthme, dont ses effets sur le remodelage bronchique, demeure peu exploré. Dans toutes les formes d’asthme, les traitements usuels de la maladie (glucocorticoïdes et bronchodilatateurs) ne permettent pas de renverser entièrement les lésions de remodelage bronchique, dont l’augmentation de la masse du muscle lisse, et ne contrôlent pas adéquatement la neutrophilie pulmonaire. L’augmentation de la masse musculaire lisse bronchique représente pourtant une cible thérapeutique importante vu son implication dans le rétrécissement de la lumière bronchique et le bronchospasme. Les objectifs de cette thèse ont donc été d’étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans l’association entre l’inflammation neutrophilique et la sévérité de la maladie, et d’investiguer les effets de thérapies anti-neutrophiliques sur le remodelage bronchique dans le modèle de l’asthme équin sévère. Similairement à la condition humaine, l’asthme équin sévère est caractérisé par une obstruction respiratoire fluctuante, de l’inflammation pulmonaire et un remodelage bronchique, notamment une augmentation de la masse du muscle lisse. Cette maladie se prête particulièrement bien à l’étude du phénotype neutrophilique puisque c’est cette cellule granulocytaire qui infiltre le milieu pulmonaire lors des exacerbations cliniques. Les études réalisées dans ce projet doctoral ont permis de déterminer que l’azithromycine, un macrolide possédant des propriétés immunomodulatrices, réduit l’inflammation neutrophilique dans le modèle de l’asthme équin. Toutefois, ce traitement n’a pas diminué l’obstruction bronchique ni les lésions de remodelage lorsqu’utilisé en monothérapie, et n’a pas potentialisé les effets des corticostéroïdes inhalés. Ces résultats suggèrent que l’atténuation de l’inflammation pulmonaire ne suffit pas à rétablir l’homéostasie tissulaire dans la phase chronique de la maladie. Toutefois, l’hétérogénéité phénotypique des neutrophiles pourrait rendre leur simple quantification dans les sécrétions respiratoires insuffisante pour élucider leurs répercussions dans l’asthme. Par exemple, les neutrophiles pourraient contribuer au remodelage bronchique par la relâche de vésicules extracellulaires, des nanoparticules qui peuvent modifier la biologie des cellules locales et distantes. Ainsi, les caractéristiques des vésicules neutrophiliques et leur effet prolifératif sur le muscle lisse bronchique ont été examinés. Les résultats obtenus indiquent que les vésicules produites par les neutrophiles augmentent la prolifération du muscle lisse bronchique lorsqu’elles proviennent de cellules exposées au lipopolysaccharide, un fragment bactérien omniprésent dans l’environnement et incriminé dans l’infiltration neutrophilique et le développement de l’obstruction bronchique dans l’asthme humain et équin. / Asthma is one of the most prevalent chronic diseases, affecting approximately 300 million people worldwide and causing over 400,000 deaths annually. The condition is characterized by the combination of bronchial hyperreactivity, lung inflammation, and structural changes in the airways (remodeling). Although an eosinophilic inflammation is common in asthma, a significant proportion of patients affected by the severe form of the disease have a neutrophilic airway infiltration. The neutrophilic phenotype has been associated with several negative outcomes in human asthma, including poor response to therapy, permanent airway obstruction and mortality. Despite these associations, the role of neutrophils in asthma, including its effects on airway remodeling, remains insufficiently explored. Unfortunately, standard asthma therapies (glucocorticoids and bronchodilators) do not adequately control neutrophilic inflammation and reverse only partially, if at all, bronchial remodeling lesions, including the increased airway smooth muscle mass. This structural modification is however an important therapeutic target because of its involvement in bronchial lumen narrowing and bronchospasm. The main objectives of this thesis were therefore to study mechanisms potentially involved in the association between neutrophilic inflammation and asthma severity, and to investigate the effects of anti-neutrophilic therapies on bronchial remodeling reversibility in the severe equine asthma model. Similar to the human disease, severe equine asthma is characterized by fluctuating airflow obstruction, pulmonary inflammation, and remodeling lesions, including a large increase in airway smooth muscle mass. Clinical exacerbations are characterized by a marked pulmonary neutrophilic influx, making this disease particularly suitable to study the neutrophilic phenotype. Studies conducted during this doctoral program revealed that azithromycin, a macrolide with immunomodulatory properties, reduces neutrophilic inflammation in the equine asthma model, but fails to alleviate bronchial obstruction and remodeling lesions, suggesting that the control of neutrophilic inflammation is not sufficient to restore tissue homeostasis when the disease reaches its chronic phase. However, the simple quantification of neutrophils within respiratory secretions might not elucidate comprehensively the possible functional consequences of this cell in the pathophysiology of asthma. For instance, neutrophils could lead and sustain bronchial structural lesions through the release of extracellular vesicles. Those nanoparticles can modify the biology of local and distant cells and are involved in the pathophysiology of several inflammatory diseases. Thus, the characteristics and the effect of neutrophil extracellular vesicles on airway smooth muscle proliferation were studied in horses with severe asthma. The results obtained indicate that extracellular vesicles increase bronchial smooth muscle cell proliferation when they are produced by neutrophils exposed to lipopolysaccharide, a ubiquitous environmental contaminant incriminated in the development of neutrophilic infiltration and bronchial obstruction in human and equine asthma.

Les plaquettes sont essentielles au développement lymphatique dès l’embryogenèse et maintiennent la séparation lympho-sanguine au cours de la vie. Elles participent directement à la lymphangiogenèse et à la réparation des vaisseaux en plus d’améliorer l’intégrité lymphatique in vitro. En présence d’apolipoprotéine A-I (apoA-I), les plaquettes consolident les connexions intercellulaires en adhérant à l’endothélium lymphatique. Toutefois, les plaquettes sont absentes de la lymphe, contrairement à leurs vésicules extracellulaires (pEVs) exprimant un protéome similaire. De plus, leur concentration dans la lymphe s’accentue en condition d’inflammation chronique, par exemple lors de l’athérosclérose. En ayant caractérisé les effets de ces vésicules sur l’intégrité lymphatique durant ma maîtrise, nous montrons que les pEVs sont rapidement internalisées par les LECs et aident à préserver l’intégrité lymphatique des effets délétères des constituants de la lymphe tels que les EVs dérivées des globules rouges (rbEVs). In vitro, des concentrations physiologiques de pEVs limitent la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et diminuent la nécrose des cellules. Comme les pEVs injectées dans le derme de la peau sont prises en charge par les cellules endothéliales des vaisseaux lymphatiques collecteurs et qu’elles voyagent jusqu’aux ganglions afférents, nous croyons qu’une partie des pEVs circulantes dans la lymphe serait cruciale pour le maintien d’une fonction lymphatique adéquate lors de maladies chroniques inflammatoires telles que l’athérosclérose. / Platelets have a protective role in lymphatic function both at the embryogenic stage and throughout life by maintaining blood-lymphatic separation. In addition, platelets enhance the integrity of lymphatic endothelial cells (LECs) in vitro and appear to exert a shielding effect on the lymphatic endothelium by consolidating the connexion between lymphatic endothelial cells when incubated with apolipoprotein A-I (apoA-I). Whereas platelets are absent from lymph, platelet extracellular vesicles (pEVs) are abundantly circulating within lymphatic vessels, and their level increases during chronic inflammation such as atherosclerosis. Having characterized their effect on lymphatic integrity during my Master internship, we show that pEVs are rapidly internalized by LECs, which in turn help preserve the integrity of the lymphatic endothelium when harmful blood constituent such as red blood cell EVs (rbEVs) are infiltrating lymph. In vitro, physiological concentrations of pEVs are limiting the production of reactive oxygen species (ROS) by lymphatic endothelial cells and decreasing their necrosis rate. Furthermore, pEVs injected in the skin interstitium travel through the collecting lymphatics and are rapidly internalized by LECs, which in turn might help preserve the integrity of the lymphatic endothelium. Lymph pEVs might be critical for the maintenance of a proper lymphatic function during chronic inflammatory settings such as atherosclerosis.

Thesis with manuscript / La communication intercellulaire joue un rôle important dans tous les organismes, car elle permet l'échange de molécules bioactives entre les cellules. La plupart des cellules peuvent sécréter des vésicules extracellulaires (VE) délimitées par une membrane, qui peuvent servir de médiateur pour le transfert sélectif de matériel génétique, en particulier de molécules d'ARN, vers des cellules réceptrices et modifier leur phénotype. Pour faciliter le ciblage de l'ARN vers les VE, les protéines de liaison de l'ARN (RBP) interagissent avec les ARN, formant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) et guidant leur localisation vers les sites de production des VE. Alors que la facilitation du transport de l'ARN par les RBP est bien étudiée dans les cellules, leur mécanisme dans les VE reste mal compris. Pour mieux comprendre le chargement sélectif des ARN dans les VE, nous avons effectué un profilage RBP complet du sécrétome libéré par les cellules épithéliales mammaires humaines (HMLE), en comparaison avec le matériel des cellules entières. Nous avons d'abord utilisé la réticulation UV pour lier de manière covalente les RBP et leurs ARN associés, puis nous avons isolé le sécrétome par ultracentrifugation et purifié les RBP par extraction d'ARN lié à des protéines (XRNAX) et par spectrométrie de masse (MS). Grâce à une analyse comparative des RBP dans les environnements cellulaire et extracellulaire, nous avons identifié des collections de protéines associées à l'ARN qui étaient communes aux deux compartiments (n=189), ou qui présentaient une association plus spécifique avec l'ARN dans les échantillons cellulaires (n= 866) ou EV (n=502). Nous avons constaté que les RBP du compartiment extracellulaire (ExRBP) avaient des signatures fonctionnelles distinctes (par exemple, le métabolisme cellulaire, la structure et la modification des cellules, le repliement des protéines) par rapport aux facteurs enrichis en cellules (par exemple, le processus métabolique de l'ARN non codant). Notamment, des RBP EV bien connus, tels que ALIX, ANXA1, hnRNPR, hnRNPQ (SYNCRIP), YBX1, ainsi que des marqueurs EV de tétraspanine (CD9, CD81, TSG101), étaient enrichis dans l'ExRBP, ce qui indique le succès de XRNAX dans la purification des RBP EV. En comparant notre collection d'ExRBP aux signatures MS des VE plus pures dérivées des cellules HMLE, nous avons également pu délimiter les ExRBP qui vi sont susceptibles d'être enrichies en VE (PureEVRBP) par rapport à celles trouvées dans le sécrétome non VE (SecRBP). Il est frappant de constater que le PureEVRBP étaient enrichies en protéines de jonction cellulaire, tandis que le secRBP étaient enrichies en facteurs spliceosomaux, ce qui implique un chargement sélectif des RBP dans les VE ou leur sécrétion dans l'espace extracellulaire. Cette recherche fournit des informations précieuses sur la composition des RBP dans les EV, servant d'ensembles de données protéomiques clés pour élucider davantage les mécanismes modulant le recrutement sélectif des ARN dans les EV et améliorant notre connaissance des rôles des RBP dans la biologie des VE. / Intercellular communication plays an important role in all organisms, as it enables the exchange of bioactive molecules between cells. Most cells can secrete membrane-delimited extracellular vesicles (EVs), which can mediate the selective transfer of genetic material, in particular RNA molecules, to recipient cells and modify their phenotypes. To facilitate the targeting of RNA to EVs, RNA binding proteins (RBPs) are thought to interact with RNAs, forming ribonucleoprotein complexes (RNPs) and guiding their localization to sites of EV production. While the facilitation of RNA transportation by RBPs is well-studied in cells, their mechanism in EVs remain poorly understood. To gain insights into the selective loading of RNAs into EVs, we conducted comprehensive RBP profiling on the secretome released by Human Mammary Epithelial (HMLE) cells, in comparison to whole cell material. We first employed UV cross-linking to covalently link RBPs and their associated RNAs, followed by secretome isolation through ultracentrifugation and purification of RBPs using Protein-Xlinked RNA Extraction (XRNAX) and mass spectrometry (MS). Through a comparative analysis of RBPs in cellular and extracellular environment, we identified collections of RNA-associated proteins that were common to both compartments (n=189), or which exhibited more specific RNA association in cellular (n= 866) or EV (n=502) specimens. We found that extracellular compartment RBPs (ExRBPs) had distinctive functional signatures (e.g. cellular metabolism, cell structure and modification, protein folding) compared to cellular-enriched factors (e.g. non-coding RNA metabolic process). Notably, well-known EV RBPs, such as ALIX, ANXA1, hnRNPR, hnRNPQ (SYNCRIP), YBX1, as well as tetraspanin EV markers (CD9, CD81, TSG101), were enriched in ExRBP, indicating the success of XRNAX in EV RBP purification. By comparing our ExRBP collection to the MS signatures of more pure HMLE cell derived EVs, we were also able to delineate ExRBPs that are likely to be EV-enriched enriched versus those found in the non-EV secretome. Strikingly, pure EV-RBPs were enriched for cell-junction proteins, while general secretome RBPs were enriched for spliceosomal factors, implying selective loading of RBPs into EVs or their secretion into the extracellular space. This research provides valuable insights into the composition of RBPs in EVs, serving as key proteomic datasets to further elucidate iv the mechanisms modulating the selective recruitment of RNAs into EVs and enhancing our knowledge of the roles of RBPs in EV biology.

Les exosomes apoptotiques (ApoExo) sont des vésicules extracellulaires (EVs) dérivées de lésions vasculaires et libérées par des cellules endothéliales (ECs) apoptotiques dont la taille, les protéines, le profil en ARN et l'activité enzymatique sont différents de ceux des corps apoptotiques classiques. Notre groupe a montré que les ApoExos accéléreraient le rejet vasculaire en association avec les anti-LG3 circulants, des auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre le LG3, le fragment 5' du perlécan. Nous avons également démontré le rôle de biomarqueur et le rôle effecteur des anti-LG3 dans les lésions vasculaires rénales, à la fois dans les reins natifs et transplantés. La néphrite lupique (NL) est une manifestation fréquente et grave du lupus érythémateux disséminé (LED). Il n'existe pas de biomarqueurs du dysfonctionnement rénal progressif dans la NL. Nous émettons l'hypothèse que les ApoExos stimulent des cellules B spécifiques qui existent dans le répertoire immunitaire normal et que les conditions pro-inflammatoires prévalant chez les patients atteints de LED, telles que l'activation accrue des récepteurs Toll-like (TLRs), amplifient cette réponse, conduisant à la production d'anti-LG3, un auto-Ac important dans l'établissement de la NL. Des cellules B productrices d’anti-LG3 ont été trouvées dans la cavité péritonéale de souris saines et ont produit des anti-LG3 suite à une stimulation in vitro avec des agonistes des TLR1/2, TLR4, TLR7 et TLR9. Il est intéressant de noter que ces cellules sont absentes de la cavité péritonéale de souris saines ayant reçu une injection d'ApoExos. En explorant l'importance fonctionnelle des TLRs dans le déclenchement d'une réponse auto-immune dans un modèle murin lupique, nous montrons que les agonistes de TLRs connus pour contribuer à la pathogenèse du LED (TLR2, 4, 7 et 9) déclenchent une production significativement plus élevée d'IgM anti-LG3, alors que la stimulation des TLRs qui ne sont pas associés à la pathogenèse du LED (TLR3 et 5) ne le fait pas. L’injection d'ApoExo a également déclenché l'axe auto-immun IL-23/IL-17 (mesuré par ELISA et essai cytokinique), augmenté les cellules B de centres germinatifs spléniques (mesuré par cytométrie de flux), augmenté les taux circulants d’IgG totaux, d’anti-LG3 et d’auto-Ac classiques du LED (mesuré par micropuce et ELISA) par rapport à l’injection de véhicule. Des niveaux élevés d'IgG anti-LG3 circulants sont observés chez les souris prédisposées au LED par rapport aux souris saines (mesurés par ELISA), ainsi qu'une proportion accrue de cellules B1 spléniques et de cavité péritonéale (mesurés par cytométrie de flux) augmentant avec l’établissement de la maladie. Ces observations suggèrent un rôle spécifique des ApoExos dans la modulation de la production d'auto-Ac qui, à son tour, déclenche l'involution microvasculaire importante dans les maladies auto-immunes et le rejet de greffe. Ces observations suggèrent également que les cellules B spécifiques de LG3 peuvent être modulées dans des conditions pro-inflammatoires telles que celles qui prévalent chez les patients atteints de LED, conduisant à la production d'auto-Ac. Une meilleure compréhension de l'impact de ces mécanismes permettra d'améliorer l'identification, la prédiction et la prise en charge de la NL. / Apoptotic exosomes (ApoExo) are vascular injury derived extracellular vesicles (EVs) released by apoptotic endothelial cells (ECs) with distinct size, protein, RNA profile and enzymatic activity from classical apoptotic bodies. Our group showed that ApoExo accelerated vascular rejection in association with circulating anti-LG3, autoantibodies (autoAb) against LG3, the 5’ fragment of the perlecan. We have also unravelled biomarkers and effector roles of anti-LG3 in kidney vascular damage in both native and transplanted kidneys. Lupus Nephritis (LN) is a common and serious manifestation of systemic lupus erythematosus (SLE). Biomarkers of progressive renal dysfunction in LN, are lacking. We hypothesize that ApoExo stimulate specific B cells that exist in the normal immune repertoire and that the pro-inflammatory conditions prevalent in SLE patients, such as increased Toll-like Receptors (TLRs) activation, amplify this response, leading to anti-LG3 production, autoAb of importance in LN development. B cells producing anti-LG3 were found in the peritoneal cavity of healthy mice and produced anti-LG3 AutoAb when stimulated in vitro with TLR 1/2, 4, 7 and 9 agonists. Interestingly, these cells disappeared from the peritoneal cavity of healthy mice infused with ApoExo. ApoExo infusion also triggered circulating IL-23/IL-17 autoimmune axis (measured by cytokines assay), increased splenic germinal centre B cells (measured by flow cytometry), increased total circulating IgG, anti-LG3 and classical autoAb (measured by microarray and ELISA) compared to vehicle infusion. Elevated circulating anti-LG3 IgG levels are found in SLE prone mice compared to healthy ones (measured by ELISA) as well as an increased proportion of splenic and peritoneal cavity B1 cells (measured by flow cytometry). Exploring the functional importance of TLRs in triggering such a response, we show that while TLR agonists known to contribute to SLE pathogenesis (TLR2, 4, 7 and 9) triggered significantly higher IgM anti-LG3 production, stimulation of TLR that are not associated with SLE pathogenesis (TLR3 and 5) did not. These observations suggest a specific role for ApoExo in modulating the production of autoAb which, in turn, trigger microvascular involution of importance in autoimmune diseases and transplant rejection. These observations also suggest that LG3-specific B cells may be modulated under pro-inflammatory conditions such as those prevalent in lupus patients, leading to production of autoAb. A better understanding of the impact of these mechanisms will lead to improved identification, prediction, and management of LN.