Die leukozytäre alkalische Phosphatase (leukoAP) wird in der Humanmedizin zur Charakteristik stabkerniger neutrophiler Granulozyten und damit der Feststellung leukozytärer Reaktionen im Sinne der Linksverschiebung genutzt. Des weiteren dient die quantitative Erfassung der leukoAP der Funktionsbeschreibung dieser Zellart. Im Vergleich dazu liegen bisher beim Rind nur wenige Untersuchungen vor. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, entsprechende Grundlagen für diese Tierart zu erarbeiten, d.h., die Bestimmungsmethodik an Rindergranulozyten zu adaptieren, Referenzwerte zu definieren sowie klinische Bezüge bei ausgewählten Krankheiten zu prüfen. Die Untersuchungen wurden an gesunden weiblichen Kälbern im Alter von drei bis vier (n = 13), sechs bis acht (n = 13) und 12 bis 14 Wochen (n = 11), weiblichen Jugrindern im Alter von sechs (n = 9) und zwölf Monaten (n = 10) sowie dreijährigen Kühen in der Trockenstehperiode (n = 11), fünf bis sieben Wochen (n = 10) sowie 12 bis 14 Wochen post partum (n = 6) durchgeführt. Außerdem wurden Kühe mit Dislocatio abomasi (n = 8) und mit weiteren Erkrankungen (n = 8) analysiert. Zur Analytik der leukoAP wurde ein durchflußzytometrisches Verfahren für Rinder adaptiert, das eine schnellere und genauere Arbeit als das herkömmliche Verfahren der leukoAP-Index-Bestimmung ermöglicht. Weiterhin wurden die Aktivitäten der AP und dessen Knochenisoenzyms im Blutserum sowie das Leukogramm bestimmt. Die Bestimmung der leukoAP ist auf der Basis der Diazoniumfärbung auch beim Rind durchflußzytometrisch mit großer Präzision und hohem Probendurchsatz möglich. Die leukoAP-Aktivitäten (relative Fluoreszenzaktivitäten) zeigen eine Altersabhängigkeit. Sie bewegen sich bei drei bis vier Wochen alten gesunden Kälbern zwischen 2,2 bis 5,7 (Mittelwert: 3,8), sinken kontinuierlich bis in den Bereich 1,9 bis 4,3 (Mittelwert: 2,8) bei 12 bis 14 Wochen alten Kälbern ab (p£0,05), um bis auf 2,6 bis 5,5 (Mittelwert: 4,2) bei einjährigen Jungrindern wieder signifikant (p£0,05) anzusteigen. Bei gesunden, trockenstehenden dreijährigen Kühen sowie Kühen 12 bis 14 Wochen post partum schwanken die leukoAP-Aktivitäten zwischen 1,2 bis 9,7 (Mittelwerte bei 3,3 bzw. 3,6). Im Zeitraum fünf bis sieben Wochen post partum ist die leukoAP-Aktivität mit 2,1 bis 8,2 (Mittelwert: 5,3) signifikant (p£0,05) höher. Bei der Gesamtheit der untersuchten gesunden Rinder korreliert die leukoAP weder mit der Zahl der Leukozyten (gesamt), der stabkernigen neutrophilen Granulozyten, der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten, der Monozyten, noch mit der Zahl der Lymphozyten systematisch gesichert. Andererseits sind Beziehungen zu diesen Parametern für einzelne Alters- und Laktationsgruppen nachweisbar. Die leukoAP korreliert weder mit der Gesamtaktivität noch mit dem Knochenisoenzym der AP im Serum. Kühe haben einen Tag nach Reposition einer Dislocatio abomasi leukoAP-Aktivitäten von 2,4 bis 7,4 (1. und 3. Quartil). Innerhalb von drei Tagen post repositionem steigt die leukoAP-Aktivität in den Bereich 5,1 bis 11,5 signifikant an, während die Leukozytenzahl sinkt (p£0,05). Bei Kühen mit linksseitiger Dislocatio abomasi verlaufen die leukoAP-Aktivität sowie der Anteil stabkerniger neutrophiler Granulozyten postoperativ parallel. Bei Kühen mit entzündlichen Erkrankungen (Klauensohlengeschwüre, Retentio secundinarum, Pneumonie, Ekzem) sind z.T. stark erhöhte leukoAP-Aktivitäten feststellbar. Sie gehen tendenziell mit einem Anstieg der stabkernigen neutrophilen Granulozyten sowie mit Leukozytose einher, im Einzelfall besteht jedoch nicht immer dieser Trend. Die Bestimmung der leukoAP ist nur bei gegebenen technischen Voraussetzungen eine auch bei Rindern einfach durchführbare Methode zur Charakteristik der neutrophilen Granulozyten mit altersabhängigen Differenzen. Bei Dislocatio abomasi besteht eine Reduzierung der leukoAP-Aktivität, die post repositionem jedoch erheblich zunimmt. / Leukocyte alkaline phosphatase (leukoAP) is used in the human medicine to characterize unsegmented neutrophile granulocytes and thereby to diagnose leukocyte reactions in terms of a leftward shift. Furthermore, the quantitative capture of leukoAP serves as a functional description of this cell type. To our knowledge, only little investigation has been done on cattle. Therefore, this dissertation aimed to acquire an equal basis for this species, i.e. to adapt the methodology of determination, to define reference values, and to examine relevant relationship for selected diseases. Healthy female calves aged between three and four (n = 13), six and eight (n = 13), and between twelve and fourteen weeks (n = 11), cows aged six (n = 9) and twelve months (n = 10), three-year-old cows ante partum (n=11), and ten cows between five and seven as well as six cows between twelve and fourteen weeks post-partum were used in the study. In addition, eight cows with abomasal dislocation and another eight with other complications were examined. For analyzing leukoAP we adapted flow cytometry for cattle which delivers faster and more exact determination than the conventional method of leukoAP index determination. Moreover, the activity of alkaline phosphatase (AP) in blood serum and its iso-enzymes in the bone as well as leukogrammes were determined. The flow cytometrical determination of leukoAP activity was based upon the diazonium staining technique which also provides an accurate measurement in a large number of samples for cattle. The leukoAP activities (given as a relative fluorescence activity) showed age dependency: they ranged between 2.2 and 5.7 (mean value 3.8) in calves of 3 to 4 weeks in age, and decreased continuously and significantly (p£0,05) to 1.4 - 4.3 (mean value 2.8) in calves between 12 and 14 weeks of age, but increased again significantly (p£0,05) ranging between 2.6 - 5.5 (mean value 4.2) in one-year-old cattle. In healthy cows, ante partum and 12 to 14 weeks post-partum, differed the leukoAP activity between 1.2 and 9.7 (mean value 3.3 and 3.6, respectively), whereas in cows 5-7 weeks post-partum the leukoAP activity was significantly greater reaching 2.1 to 8.2 (mean value 5.3, p£0,05). For healthy cattle, leukoAP correlated neither with the total number of leukocytes, unsegmented neutrophile granulocytes, monocytes nor with the number of lymphocytes. In addition, leukoAP correlated neither total activity nor with serum AP and its iso-enzymes in the bone. One day after replacing the abomasal dislocation (between 1st and 3rd quartile) cows showed a significant decrease in leukoAP activity (2.4 - 7.4) vs. healthy cows after the same period of time post-partum. This parameter increased, however, significantly three days post-operative (5.1-11.5), whereas the number leukocytes decreased (p£0,05). In cows with left side abomasal dislocation, leukoAP activity and the number of unsegmented neutrophile granulocytes post-operative developed concomitantly. We found enhanced leukoAP activity in cows with different inflammatory disorders such as sole ulcer, placenta retention, pneumonia and eczema which provably (p£0,05) corresponded with an increased number of unsegmented neutrophile granulocytes and partly leukocytosis. However, for isolated cases this trend did not always show. Determining the leukoAP is, hence, a method for characterizing neutrophile granulocytes depending on age differences and is only practible for cattle if the required technical conditions are given. During abomasal dislocation, leukoAP activity decreased, but increased considerably after post-operative replacement.

Die leukozytäre alkalische Phosphatase (leukoAP) wird in der Humanmedizin zur Charakteristik stabkerniger neutrophiler Granulozyten und damit der Feststellung leukozytärer Reaktionen im Sinne der Linksverschiebung genutzt. Des weiteren dient die quantitative Erfassung der leukoAP der Funktionsbeschreibung dieser Zellart. Im Vergleich dazu liegen bisher beim Rind nur wenige Untersuchungen vor. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, entsprechende Grundlagen für diese Tierart zu erarbeiten, d.h., die Bestimmungsmethodik an Rindergranulozyten zu adaptieren, Referenzwerte zu definieren sowie klinische Bezüge bei ausgewählten Krankheiten zu prüfen. Die Untersuchungen wurden an gesunden weiblichen Kälbern im Alter von drei bis vier (n = 13), sechs bis acht (n = 13) und 12 bis 14 Wochen (n = 11), weiblichen Jugrindern im Alter von sechs (n = 9) und zwölf Monaten (n = 10) sowie dreijährigen Kühen in der Trockenstehperiode (n = 11), fünf bis sieben Wochen (n = 10) sowie 12 bis 14 Wochen post partum (n = 6) durchgeführt. Außerdem wurden Kühe mit Dislocatio abomasi (n = 8) und mit weiteren Erkrankungen (n = 8) analysiert. Zur Analytik der leukoAP wurde ein durchflußzytometrisches Verfahren für Rinder adaptiert, das eine schnellere und genauere Arbeit als das herkömmliche Verfahren der leukoAP-Index-Bestimmung ermöglicht. Weiterhin wurden die Aktivitäten der AP und dessen Knochenisoenzyms im Blutserum sowie das Leukogramm bestimmt. Die Bestimmung der leukoAP ist auf der Basis der Diazoniumfärbung auch beim Rind durchflußzytometrisch mit großer Präzision und hohem Probendurchsatz möglich. Die leukoAP-Aktivitäten (relative Fluoreszenzaktivitäten) zeigen eine Altersabhängigkeit. Sie bewegen sich bei drei bis vier Wochen alten gesunden Kälbern zwischen 2,2 bis 5,7 (Mittelwert: 3,8), sinken kontinuierlich bis in den Bereich 1,9 bis 4,3 (Mittelwert: 2,8) bei 12 bis 14 Wochen alten Kälbern ab (p£0,05), um bis auf 2,6 bis 5,5 (Mittelwert: 4,2) bei einjährigen Jungrindern wieder signifikant (p£0,05) anzusteigen. Bei gesunden, trockenstehenden dreijährigen Kühen sowie Kühen 12 bis 14 Wochen post partum schwanken die leukoAP-Aktivitäten zwischen 1,2 bis 9,7 (Mittelwerte bei 3,3 bzw. 3,6). Im Zeitraum fünf bis sieben Wochen post partum ist die leukoAP-Aktivität mit 2,1 bis 8,2 (Mittelwert: 5,3) signifikant (p£0,05) höher. Bei der Gesamtheit der untersuchten gesunden Rinder korreliert die leukoAP weder mit der Zahl der Leukozyten (gesamt), der stabkernigen neutrophilen Granulozyten, der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten, der Monozyten, noch mit der Zahl der Lymphozyten systematisch gesichert. Andererseits sind Beziehungen zu diesen Parametern für einzelne Alters- und Laktationsgruppen nachweisbar. Die leukoAP korreliert weder mit der Gesamtaktivität noch mit dem Knochenisoenzym der AP im Serum. Kühe haben einen Tag nach Reposition einer Dislocatio abomasi leukoAP-Aktivitäten von 2,4 bis 7,4 (1. und 3. Quartil). Innerhalb von drei Tagen post repositionem steigt die leukoAP-Aktivität in den Bereich 5,1 bis 11,5 signifikant an, während die Leukozytenzahl sinkt (p£0,05). Bei Kühen mit linksseitiger Dislocatio abomasi verlaufen die leukoAP-Aktivität sowie der Anteil stabkerniger neutrophiler Granulozyten postoperativ parallel. Bei Kühen mit entzündlichen Erkrankungen (Klauensohlengeschwüre, Retentio secundinarum, Pneumonie, Ekzem) sind z.T. stark erhöhte leukoAP-Aktivitäten feststellbar. Sie gehen tendenziell mit einem Anstieg der stabkernigen neutrophilen Granulozyten sowie mit Leukozytose einher, im Einzelfall besteht jedoch nicht immer dieser Trend. Die Bestimmung der leukoAP ist nur bei gegebenen technischen Voraussetzungen eine auch bei Rindern einfach durchführbare Methode zur Charakteristik der neutrophilen Granulozyten mit altersabhängigen Differenzen. Bei Dislocatio abomasi besteht eine Reduzierung der leukoAP-Aktivität, die post repositionem jedoch erheblich zunimmt. / Leukocyte alkaline phosphatase (leukoAP) is used in the human medicine to characterize unsegmented neutrophile granulocytes and thereby to diagnose leukocyte reactions in terms of a leftward shift. Furthermore, the quantitative capture of leukoAP serves as a functional description of this cell type. To our knowledge, only little investigation has been done on cattle. Therefore, this dissertation aimed to acquire an equal basis for this species, i.e. to adapt the methodology of determination, to define reference values, and to examine relevant relationship for selected diseases. Healthy female calves aged between three and four (n = 13), six and eight (n = 13), and between twelve and fourteen weeks (n = 11), cows aged six (n = 9) and twelve months (n = 10), three-year-old cows ante partum (n=11), and ten cows between five and seven as well as six cows between twelve and fourteen weeks post-partum were used in the study. In addition, eight cows with abomasal dislocation and another eight with other complications were examined. For analyzing leukoAP we adapted flow cytometry for cattle which delivers faster and more exact determination than the conventional method of leukoAP index determination. Moreover, the activity of alkaline phosphatase (AP) in blood serum and its iso-enzymes in the bone as well as leukogrammes were determined. The flow cytometrical determination of leukoAP activity was based upon the diazonium staining technique which also provides an accurate measurement in a large number of samples for cattle. The leukoAP activities (given as a relative fluorescence activity) showed age dependency: they ranged between 2.2 and 5.7 (mean value 3.8) in calves of 3 to 4 weeks in age, and decreased continuously and significantly (p£0,05) to 1.4 - 4.3 (mean value 2.8) in calves between 12 and 14 weeks of age, but increased again significantly (p£0,05) ranging between 2.6 - 5.5 (mean value 4.2) in one-year-old cattle. In healthy cows, ante partum and 12 to 14 weeks post-partum, differed the leukoAP activity between 1.2 and 9.7 (mean value 3.3 and 3.6, respectively), whereas in cows 5-7 weeks post-partum the leukoAP activity was significantly greater reaching 2.1 to 8.2 (mean value 5.3, p£0,05). For healthy cattle, leukoAP correlated neither with the total number of leukocytes, unsegmented neutrophile granulocytes, monocytes nor with the number of lymphocytes. In addition, leukoAP correlated neither total activity nor with serum AP and its iso-enzymes in the bone. One day after replacing the abomasal dislocation (between 1st and 3rd quartile) cows showed a significant decrease in leukoAP activity (2.4 - 7.4) vs. healthy cows after the same period of time post-partum. This parameter increased, however, significantly three days post-operative (5.1-11.5), whereas the number leukocytes decreased (p£0,05). In cows with left side abomasal dislocation, leukoAP activity and the number of unsegmented neutrophile granulocytes post-operative developed concomitantly. We found enhanced leukoAP activity in cows with different inflammatory disorders such as sole ulcer, placenta retention, pneumonia and eczema which provably (p£0,05) corresponded with an increased number of unsegmented neutrophile granulocytes and partly leukocytosis. However, for isolated cases this trend did not always show. Determining the leukoAP is, hence, a method for characterizing neutrophile granulocytes depending on age differences and is only practible for cattle if the required technical conditions are given. During abomasal dislocation, leukoAP activity decreased, but increased considerably after post-operative replacement.

Trois dérivés d'amino acides sont reconnus d'une manière stéréo sélective par l'albumine du sérum bovin. Cette propriété a été observée dans le cas de la phosphatase alcaline de tissu non spécifique, (TNAP). Des inhibiteurs agissant à trois niveaux distincts sur les processus de minéralisation ont été cherchés: 1) TNAP ; 2) Formation de l'hydroxyapatite (HA); 3) Vésicules maticielles (VMs). Nous avons trouvé que des dérivés de benzothiophènes et de tétramisoles, solubles dans l'eau, sont des inhibiteurs spécifiques de TNAP. Un modèle qui permet de produire du HA, a été développé et a confirmé que les nucléotides sont des inhibiteurs de formation de HA. Nous avons montré que le médicament anti-rhumatisme sinomenine, n'ayant aucun effet sur le TNAP, ainsi que la théophylline ralentissaient tous les deux la formation de HA induits par les VMs. Ces modèles de minéralisation présentent un grand potentiel lors du criblage de médicaments pour le traitement de l'ostéoarthrose

Trois dérivés d’amino acides sont reconnus d’une manière stéréo sélective par l’albumine du sérum bovin. Cette propriété a été observée dans le cas de la phosphatase alcaline de tissu non spécifique, (TNAP). Des inhibiteurs agissant à trois niveaux distincts sur les processus de minéralisation ont été cherchés: 1) TNAP ; 2) Formation de l’hydroxyapatite (HA); 3) Vésicules maticielles (VMs). Nous avons trouvé que des dérivés de benzothiophènes et de tétramisoles, solubles dans l’eau, sont des inhibiteurs spécifiques de TNAP. Un modèle qui permet de produire du HA, a été développé et a confirmé que les nucléotides sont des inhibiteurs de formation de HA. Nous avons montré que le médicament anti-rhumatisme sinomenine, n’ayant aucun effet sur le TNAP, ainsi que la théophylline ralentissaient tous les deux la formation de HA induits par les VMs. Ces modèles de minéralisation présentent un grand potentiel lors du criblage de médicaments pour le traitement de l’ostéoarthrose / Three amino acid derivatives were stereoselectively recognized by bovine serum albumin. Such property was also observed in the case of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), a marker in mineral formation. Inhibitors acting at three distinct levels on mineral formation were searched: 1) TNAP; 2) Hydroxyapatite (HA) formation; 3) Matrix vesicle (MV). We found that benzothiophene derivative of tetramisole are water soluble inhibitors of TNAP. A model producing HA as MVs was developed and served to screen HA inhibitors, confirming that several nucleotides inhibited HA formation. We demonstrated that the anti-rheumatic Chinese medicine sinomenine, having no effect on TNAP and theophylline, slowed down HA induced by MVs. The mineralization models presented a great potential to screen putative drugs to cure ostoarthritis.

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