Die leukozytäre alkalische Phosphatase (leukoAP) wird in der Humanmedizin zur Charakteristik stabkerniger neutrophiler Granulozyten und damit der Feststellung leukozytärer Reaktionen im Sinne der Linksverschiebung genutzt. Des weiteren dient die quantitative Erfassung der leukoAP der Funktionsbeschreibung dieser Zellart. Im Vergleich dazu liegen bisher beim Rind nur wenige Untersuchungen vor. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, entsprechende Grundlagen für diese Tierart zu erarbeiten, d.h., die Bestimmungsmethodik an Rindergranulozyten zu adaptieren, Referenzwerte zu definieren sowie klinische Bezüge bei ausgewählten Krankheiten zu prüfen. Die Untersuchungen wurden an gesunden weiblichen Kälbern im Alter von drei bis vier (n = 13), sechs bis acht (n = 13) und 12 bis 14 Wochen (n = 11), weiblichen Jugrindern im Alter von sechs (n = 9) und zwölf Monaten (n = 10) sowie dreijährigen Kühen in der Trockenstehperiode (n = 11), fünf bis sieben Wochen (n = 10) sowie 12 bis 14 Wochen post partum (n = 6) durchgeführt. Außerdem wurden Kühe mit Dislocatio abomasi (n = 8) und mit weiteren Erkrankungen (n = 8) analysiert. Zur Analytik der leukoAP wurde ein durchflußzytometrisches Verfahren für Rinder adaptiert, das eine schnellere und genauere Arbeit als das herkömmliche Verfahren der leukoAP-Index-Bestimmung ermöglicht. Weiterhin wurden die Aktivitäten der AP und dessen Knochenisoenzyms im Blutserum sowie das Leukogramm bestimmt. Die Bestimmung der leukoAP ist auf der Basis der Diazoniumfärbung auch beim Rind durchflußzytometrisch mit großer Präzision und hohem Probendurchsatz möglich. Die leukoAP-Aktivitäten (relative Fluoreszenzaktivitäten) zeigen eine Altersabhängigkeit. Sie bewegen sich bei drei bis vier Wochen alten gesunden Kälbern zwischen 2,2 bis 5,7 (Mittelwert: 3,8), sinken kontinuierlich bis in den Bereich 1,9 bis 4,3 (Mittelwert: 2,8) bei 12 bis 14 Wochen alten Kälbern ab (p£0,05), um bis auf 2,6 bis 5,5 (Mittelwert: 4,2) bei einjährigen Jungrindern wieder signifikant (p£0,05) anzusteigen. Bei gesunden, trockenstehenden dreijährigen Kühen sowie Kühen 12 bis 14 Wochen post partum schwanken die leukoAP-Aktivitäten zwischen 1,2 bis 9,7 (Mittelwerte bei 3,3 bzw. 3,6). Im Zeitraum fünf bis sieben Wochen post partum ist die leukoAP-Aktivität mit 2,1 bis 8,2 (Mittelwert: 5,3) signifikant (p£0,05) höher. Bei der Gesamtheit der untersuchten gesunden Rinder korreliert die leukoAP weder mit der Zahl der Leukozyten (gesamt), der stabkernigen neutrophilen Granulozyten, der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten, der Monozyten, noch mit der Zahl der Lymphozyten systematisch gesichert. Andererseits sind Beziehungen zu diesen Parametern für einzelne Alters- und Laktationsgruppen nachweisbar. Die leukoAP korreliert weder mit der Gesamtaktivität noch mit dem Knochenisoenzym der AP im Serum. Kühe haben einen Tag nach Reposition einer Dislocatio abomasi leukoAP-Aktivitäten von 2,4 bis 7,4 (1. und 3. Quartil). Innerhalb von drei Tagen post repositionem steigt die leukoAP-Aktivität in den Bereich 5,1 bis 11,5 signifikant an, während die Leukozytenzahl sinkt (p£0,05). Bei Kühen mit linksseitiger Dislocatio abomasi verlaufen die leukoAP-Aktivität sowie der Anteil stabkerniger neutrophiler Granulozyten postoperativ parallel. Bei Kühen mit entzündlichen Erkrankungen (Klauensohlengeschwüre, Retentio secundinarum, Pneumonie, Ekzem) sind z.T. stark erhöhte leukoAP-Aktivitäten feststellbar. Sie gehen tendenziell mit einem Anstieg der stabkernigen neutrophilen Granulozyten sowie mit Leukozytose einher, im Einzelfall besteht jedoch nicht immer dieser Trend. Die Bestimmung der leukoAP ist nur bei gegebenen technischen Voraussetzungen eine auch bei Rindern einfach durchführbare Methode zur Charakteristik der neutrophilen Granulozyten mit altersabhängigen Differenzen. Bei Dislocatio abomasi besteht eine Reduzierung der leukoAP-Aktivität, die post repositionem jedoch erheblich zunimmt. / Leukocyte alkaline phosphatase (leukoAP) is used in the human medicine to characterize unsegmented neutrophile granulocytes and thereby to diagnose leukocyte reactions in terms of a leftward shift. Furthermore, the quantitative capture of leukoAP serves as a functional description of this cell type. To our knowledge, only little investigation has been done on cattle. Therefore, this dissertation aimed to acquire an equal basis for this species, i.e. to adapt the methodology of determination, to define reference values, and to examine relevant relationship for selected diseases. Healthy female calves aged between three and four (n = 13), six and eight (n = 13), and between twelve and fourteen weeks (n = 11), cows aged six (n = 9) and twelve months (n = 10), three-year-old cows ante partum (n=11), and ten cows between five and seven as well as six cows between twelve and fourteen weeks post-partum were used in the study. In addition, eight cows with abomasal dislocation and another eight with other complications were examined. For analyzing leukoAP we adapted flow cytometry for cattle which delivers faster and more exact determination than the conventional method of leukoAP index determination. Moreover, the activity of alkaline phosphatase (AP) in blood serum and its iso-enzymes in the bone as well as leukogrammes were determined. The flow cytometrical determination of leukoAP activity was based upon the diazonium staining technique which also provides an accurate measurement in a large number of samples for cattle. The leukoAP activities (given as a relative fluorescence activity) showed age dependency: they ranged between 2.2 and 5.7 (mean value 3.8) in calves of 3 to 4 weeks in age, and decreased continuously and significantly (p£0,05) to 1.4 - 4.3 (mean value 2.8) in calves between 12 and 14 weeks of age, but increased again significantly (p£0,05) ranging between 2.6 - 5.5 (mean value 4.2) in one-year-old cattle. In healthy cows, ante partum and 12 to 14 weeks post-partum, differed the leukoAP activity between 1.2 and 9.7 (mean value 3.3 and 3.6, respectively), whereas in cows 5-7 weeks post-partum the leukoAP activity was significantly greater reaching 2.1 to 8.2 (mean value 5.3, p£0,05). For healthy cattle, leukoAP correlated neither with the total number of leukocytes, unsegmented neutrophile granulocytes, monocytes nor with the number of lymphocytes. In addition, leukoAP correlated neither total activity nor with serum AP and its iso-enzymes in the bone. One day after replacing the abomasal dislocation (between 1st and 3rd quartile) cows showed a significant decrease in leukoAP activity (2.4 - 7.4) vs. healthy cows after the same period of time post-partum. This parameter increased, however, significantly three days post-operative (5.1-11.5), whereas the number leukocytes decreased (p£0,05). In cows with left side abomasal dislocation, leukoAP activity and the number of unsegmented neutrophile granulocytes post-operative developed concomitantly. We found enhanced leukoAP activity in cows with different inflammatory disorders such as sole ulcer, placenta retention, pneumonia and eczema which provably (p£0,05) corresponded with an increased number of unsegmented neutrophile granulocytes and partly leukocytosis. However, for isolated cases this trend did not always show. Determining the leukoAP is, hence, a method for characterizing neutrophile granulocytes depending on age differences and is only practible for cattle if the required technical conditions are given. During abomasal dislocation, leukoAP activity decreased, but increased considerably after post-operative replacement.

Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene, angeborene Knochen- und Systemerkrankung, welche Patienten allen Alters betrifft. Verursacht wird die Erkrankung durch Mutationen im ALPL-Gen, welches für die gewebeunspezifische Alkalische Phosphatase codiert und mit einem Funktionsverlust des Enzyms einhergeht. Die Ausprägung der klinischen Symptomatik ist sehr heterogen und reicht von milden und unspezifischen bis hin zu potenziell lebensbedrohlichen Symptomen, was die korrekte Diagnose zusätzlich erschwert und verzögert. Um das Verständnis der pädiatrischen HPP zu verbessern und die Dauer von Symptombeginn bis zur korrekten Diagnose zu verkürzen, haben wir den Verlauf der Erkrankung anhand einer retrospektiven Aufarbeitung der Daten von 50 pädiatrischen HPP Patienten, die in den letzten 25 Jahren an der Universitäts-Kinderklinik in Würzburg vorstellig waren, untersucht. Diese Ergebnisse bestätigen den klinischen Eindruck der HPP als chronische Systemerkrankung, welche aufgrund ihrer unspezifischen klinischen Präsentation oftmals nur mit zeitlicher Verzögerung diagnostiziert wird. Dieser Verzögerung kommt insbesondere im Hinblick auf die 2015 zur Behandlung der pädiatrischen HPP zugelassenen Enzymersatztherapie mit dem Wirkstoff Asfotase alfa eine besondere Bedeutung zu, da die Patienten von einer frühzeitigen Diagnose und einem damit einhergehenden frühzeitigen Beginn der Behandlung profitieren können. Diese Ergebnisse tragen einen Teil dazu bei, das Bewusstsein und die Kenntnis der Erkrankung zu verbessern, um so die die Zeitspanne zwischen Symptombeginn und Diagnosestellung zu verkürzen und die medizinische Versorgung der Patienten zu verbessern. / Hypophosphatasia (HPP) is a rare, inherited metabolic disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene that encodes the tissue-nonspecific alkaline phosphatase TNAP (ORPHA 436). Its clinical presentation is highly heterogeneous with a remarkably wide-ranging severity. HPP affects patients of all age. Therefore, diagnosis is often difficult and delayed. To improve the understanding of HPP in children and in order to shorten the diagnostic time span in the future we studied the natural history of the disease in our large cohort of pediatric patients. In light of the enzyme replacement therapy (Asfotase alfa, a recombinant mineral-targeted TNAP), HPP patients may benefit from early treatment in the course of the disease. This single centre retrospective chart review included longitudinal data from 50 patients with HPP diagnosed and followed at the University Children`s Hospital Wuerzburg, Germany over the last 25 years. Reported findings support our clinical impression of a chronic multi-systemic disease with often delayed diagnosis. Our natural history information provides detailed insights into the prevalence of different symptoms which can help to improve and to shorten diagnostics and thereby lead to an optimised medical care, especially with promising therapeutic options like enzyme-replacement-therapy with Asfotase alfa in mind.

Aufgrund mangelnder Aktivität der Gewebe-unspezifischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) kommt es zum Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP). Neben skelettalen und neuronalen Symptomen leiden Patienten mit HPP häufig an einem vorzeitigen Verlust der Milchzähne und weiteren dentalen Manifestationen, wie Zahnhartsubstanzdefekten, Eruptionsstörungen, erweiterte Pulpenkammern oder einer verringerten alveolären Knochenhöhe. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss der TNAP auf die Zahnentwicklung von Zebrafischlarven zu untersuchen, um ein neues in-vivo Modell für die dentalen Auswirkungen bei Hypophosphatasie etablieren zu können. Um die sehr kleinen Zähne der Zebrafischlarven auch in frühen Entwicklungsstadien darzustellen, wurden mittels verschiedener histologischer Färbungen die Zahnstrukturen angefärbt und die Larven danach in JB4®, einen polymeren Kunststoff, eingebettet. Im Anschluss wurden histologische Schnitte angefertigt und am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Einerseits konnte durch In-situ-Hybridisierung die Expression verschiedener Gene, wie z.B. alpl (welches für die Tnap im Zebrafisch kodiert), im Bereich von dentalen Strukturen in verschiedenen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden. Außerdem zeigte die Analyse der dentalen Strukturen nach Inhibition der Tnap mittels Levamisol bei fünf Tage alten Zebrafischlarven eine Veränderung von Form, Größe und Struktur der ersten Zähne. Die TNAP-Inhibition führte auch zur quantitativ nachweisbaren Steigerung des Fluoreszenzsignals von ß-Catenin, welches eine zentrale Funktion im Wnt/ß-Catenin-Signalweg besitzt und essenziell in verschiedenen zellulären Prozessen während der Embryogenese ist. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Arbeit, dass der Zebrafisch großes Potenzial als in-vivo Modell für die dentalen Symptome bei HPP bietet. Außerdem eröffnen sich neue interessante Fragen in Bezug auf den Einfluss von ß-Catenin bei den frühen pathophysiologischen Prozessen der Erkrankung. / Lack of activity of the tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP, can result in the clinical manifestation of hypophosphatasia (HPP). Besides skeletal and neuronal symptoms, patients with HPP often suffer from premature loss of deciduous teeth and other dental manifestations, e.g. defects in tooth structure, eruption disorders, widened pulp chambers, or decreased alveolar bone height. The aim of this work was to investigate the influence of TNAP (Tnap) on tooth development in zebrafish larvae and to investigate the possibility to establish a new in-vivo model for the dental effects in hypophosphatasia. To visualize the very small teeth of zebrafish even at early developmental stages, tooth structures were stained with different histological staining methods and larvae were subsequently embedded in JB4®, a polymeric resin. Afterwards, histological sections were prepared from embedded specimen and evaluated on the fluorescence microscope. Coloration of mRNA transcripts by in-situ-hybridization marked the expression of different genes, e.g. alpl (which encodes Tnap in zebrafish), within the area of dental structures at different developmental stages. Further analysis of dental structures after inhibition of Tnap by levamisole incubation showed changes in the shape, size and structure of teeth in five-day-old zebrafish larvae. In addition, after inhibition of Tnap there was a quantitatively detectable increase in the fluorescent signal of ß-catenin, which has a central function in the Wnt/ß-catenin signaling pathway and in a wide number of cellular processes during embryogenesis. In summary, the presented results of this work show that the zebrafish offers great potential as an in-vivo model for dental symptoms in HPP. It also raises interesting questions regarding the influence of ß-catenin in the early pathophysiological processes of the disease.

Die Gebärparese gehört trotz umfangreicher pathophysiologischer Kenntnisse immer noch zu den häufigsten und wirtschaftlich bedeutensten peripartalen Erkrankungen bei Milchkühen. Ziel dieser retrospektiven Studie war, zu untersuchen, ob es bereits im antepartalen Zeitraum möglich ist, anhand von Blut- und Harnparametern eine mögliche Prädisposition für Hochleistungskühe, an Gebärparese zu erkranken, festzustellen. Zur Verfügung standen Blut- und teilweise Harnproben von Beginn des Trockenstehens bis kurz nach dem Abkalben von insgesamt 53 post partum (p.p.) festliegenden Kühen (VT). Untersucht wurden Parameter des Energie- und Fettstoffwechsels, des Leber-, Muskel- und Knochenstoffwechsels, des Eiweißstoffwechsels und des Mineral- und Spurenelementstoffwechsels. Zusätzlich wurde bei 20 dieser Kühe die fraktionelle Elimination (FE) von Calcium, Phosphat, Magnesium, Natrium und Kalium berechnet. Signifikante Differenzen ergaben sich vor allem bei der Alkalischen Phosphatase (AP), die im gesamten antepartalen Meßzeitraum signifikant erniedrigte Aktivitäten bei den VT aufwies. Desweiteren wurde eine im entsprechenenden Zeitraum durchweg erhöhte Calcium-Ausscheidung bei gleichzeitig erhöhter FE Calcium bei den VT beobachtet. Nach der ROC (Receiver Operator Characteristics)-Analyse weisen AP-Aktivitäten im Blut unter 45 U/L in der Trockenstehphase mit einer Sensitivität von etwa 80 % auf ein erhöhtes Gebärpareserisiko p.p. hin. Anhand dieser Ergebnisse kann die AP-Aktivität im Blut während der Trockenstehperiode als frühdiagnostischer Indikator für eine p.p. bestehende Gebärparesegefährdung genutzt werden.

Die alkalische Phosphatase (AP) ist in Form von verschiedenen Isoenzymen in fast allen Geweben und Flüssigkeiten des Organismus vorhanden. Durch die Auftrennung der Gesamt-AP in ihre Isoenzyme ist eine Lokalisation von krankhaften Prozessen möglich. Da in der Veterinärmedizin die AP-Isoenzymdiagnostik bisher nicht praktisch zum Einsatz kommt, wurde in der vorliegenden Arbeit die Aussagekraft der Isoenzym-Aktivitäten bei verschiedenen Krankheitsbildern und die Eignung dieses Verfahren für den Einsatz in Klinik und Praxis untersucht. Die Untersuchungen wurden an insgesamt 106 Rindern durchgeführt. 25 gesunde Rinder bildeten eine Kontrollgruppe. 69 an Diarrhoe erkrankte Kühe wurden gemäß ihrer Primärerkrankung in 6 Gruppen eingeteilt: Labmagenverlagerung nach links (LMV li) (n=28), Labmagenverlagerung nach rechts (LMV re) (n=20), Enteritis (n=5), Strangulationsileus (n=4), Labmagenulcera (n=5) und Endometritis / Mastitis (n=7). Zwei weitere Gruppen bildeten Rinder mit einer Leberfunktionsstörung (n=20) und Rinder mit einer hochgradigen Aktivitätserhöhung der Gesamt-AP ≥ 300 U/l (n=12). Zudem wurden Blutproben vom Tag der Aufnahme und der Entlassung verglichen. Die AP-Isoenzyme im Blutserum wurden mit Hilfe des Testkits HYDRAGEL ISO-PAL K20 der Firma Sebia, Fulda elektrophoretisch auf Agarosegel aufgetrennt in die Leber-1-, Leber-2-, Knochen- und intestinalen Isoenzyme. Außerdem wurden bestimmt: Gesamt-Alkalische-Phosphatase, Glutamat-Dehydrogenase, Aspartat-Amino-Transferase (ASAT), Gamma-Glutamyl-Transferase, Alanin-Amino-Trans-ferase, Gesamtbilirubin, Gesamteiweiß, Harnstoff, Beta-Hydroxybuttersäure, Cholesterol, Calcium, anorganisches Phosphat und Leukozyten. Bei den gesunden Kühen beträgt die mediane Aktivität der Gesamt-AP 122 U/l, die der intestinalen AP 22,7 U/l und die der Leber-1-AP 51,0 U/l. Bei den Kühen mit Diarrhoe ist die intestinale AP-Aktivität bei Erkrankung signifikant erhöht (M=28,2 U/l). Bei der Unterteilung in verschiedene Erkrankungen weist sie bei den Tieren mit Strangulationsileus eine signifikant höhere Aktivität als bei den anderen Krankheiten auf (M=71,4 U/l). Die Gesamt-AP-Aktivität ist jedoch in keinem Fall signifikant erhöht und gibt somit keinen Hinweis auf einen Aktivitätsanstieg der intestinalen AP. Nach Abklingen der Diarrhoe ist die Wiederherstellung der Darmfunktion anhand einer Normalisierung der intestinalen AP-Aktivität nachvoll-ziehbar, da zwischen den gesunden Kühen und den rekonvaleszenten Tieren (M=24,2 U/l) kein signifikanter Unterschied besteht. Jedoch lässt die Aktivität des intestinalen Isoenzyms keine Rückschlüsse auf die zu Grunde liegende Grund-erkrankung zu, weil auch bei den anderen Erkrankungen ähnlich hohe Aktivitäten der intestinalen AP wie beim Ileus existieren. Auffällig ist auch eine Hypocholesterolämie bei den Kühen mit LMV li (M=1,86 mmol/l), LMV re (M=1,92 mmol/l) und besonders bei den Tieren mit Ileus (M=1,36 mmol/l) gegenüber den Gesunden (M=3,45 mmol/l). Die Untersuchung von Gesamt-AP-Aktivität und Leber-1-AP-Aktivität bei den Patien-ten mit einer Leberfunktionsstörung ergibt, dass der Grad der Erhöhung dieser Parameter einen Rückschluss auf die Schwere der Erkrankung zulässt. Bei den später verstorbenen Kühen sind für die Gesamt-AP (M=178 U/l) und für das Leber-1-Isoenzym (M=116,5 U/l) die hochgradigsten Aktivitätsanstiege zu verzeichnen. Eine Prognose hinsichtlich des Ausgangs der Erkrankung ist allerdings nicht zu treffen, weil keine signifikanten Aktivitätsunterschiede zwischen Kühen mit Exitus letalis und Heilung bestehen. Aber die ASAT-Aktivitäten (M=278,1 U/l) und die Bilirubinkonzen-trationen (M=20,5 µmol/l) sind bei den Tieren mit Exitus letalis deutlich höher als bei den rekonvaleszenten Kühen (M=145,6 U/l bzw. 12,5 µmol/l) und sind somit prognostisch verwertbar. Auf Grund dieser Ergebnisse erscheint die Aussagekraft der AP-Isoenzymdiagnostik als zu gering, um diese Methodik in Praxis und Klinik zur Zeit anzuwenden.

Techn. Universiẗat, Diss., 2002--Berlin.

Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend fünf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivitätsmessungen (CSPD Assay) und TNAP Färbungen zeigten einen signifikanten Rückgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivität und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Phänotyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdrückt. Mögliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabhängiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenhänge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergründen und daraus gegebenenfalls neue Therapieansätze abzuleiten. / Hypophosphatasia (HPP) is a rare inherited disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene encoding the Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP). Besides skeletal symptoms, some patients also present dental abnormalities like for example the premature loss of deciduous teeth. Here we generated and characterized five different TNAP-deficient periodontal ligament (PDL) derived cell lines using the method of CRISPR-Cas9. The mutations varied from a moderate heterozygous point mutation to a severe homozygous deletion leading to a premature stop codon. Analysis of the ALPL expression and TNAP activity measurements in CSPD Assays and TNAP stainings revealed a decrease for all TNAP-deficient cell lines with a strong correlation between the residual activity and the extend of the mutation. The already limited differentiation capacity of immortalized hTERT (human telomerase reverse transcriptase) PDL cells is completely abolished in the homozygously mutated cell line. Putative key mechanisms for the premature exfoliation in HPP are the restricted formation and mineralization of the cementum and the impaired insertion of elastic dental fibers. The newly generated TNAP-deficient cell lines provide a promising and donor independent in vitro model to gain better understanding of the molecular mechanisms of dental problems in HPP.

Hypophosphatasie (HPP) beschreibt eine seltene Erbkrankheit, die hauptsächlich durch heterozygote Mutationen im ALPL-Gen verursacht wird. Diese führen zu einer verminderten Aktivität der gewebeunspezifischen alkalischen Phosphatase (TNAP). Neben skelettalen Symptomen sind Zahnanomalien wie der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ohne resorbierte Wurzel sowie eine gestörte Mineralisierung der Zahnhart-substanzen ein typisches Merkmal der HPP. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden Zelllinien des parodontalen Ligaments mit Mutationen im ALPL-Gen charakterisiert, um anschließend mögliche Therapiestrategien für die HPP auf molekularer Ebene zu untersuchen. Im Rahmen der basalen Charakterisierung wurden die Zelllinien hinsichtlich der TNAP-Expression (Immunhistochemie, Western Blot), des Stoffwechselprofils (ATP-Assay) und des osteogenen Differenzierungspotenzials (Alizarin-Färbung) analysiert. Von Interesse war auch, ob durch CRISPR/Cas9-basiertes Genediting Off-Target Mutationen entstanden sind. Zur Untersuchung der molekularen Auswirkungen von PTH, welches die ALPL-Expression steigern kann, wurden zwei Protokolle etabliert, die eine kontinuier-liche, kurzzeitige bzw. intermittierende Präsenz von PTH in-vitro imitieren. Anschließend wurde die ALPL-Expression (qPCR) sowie TNAP-Aktivität (CSPD-Assay) ermittelt. Die basale TNAP-Expression war variabel und reichte vom völligen Fehlen in den Zell-linien mit Deletionen bis hin zu einer starken TNAP-Expression in der Zelllinie mit einer heterogenen Punktmutation. Eine niedrige Expression ging mit einer verringerten Zell-proliferation sowie extrazellulären ATP einher. Es zeigte sich ein unterschiedliches Mineralisierungspotenzial, das hauptsächlich das TNAP-Expressionsniveau in den verschiedenen Zelllinien widerspiegelt, während die PTH-Stimulation keine Wirkung auf die Differenzierung hatte. Im Gegensatz zu klinischen Beobachtungen deuten die Ergebnisse auf eine hohe Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp in-vitro hin, die in-vivo noch bestätigt werden müssen. Die Sequenzierung bestätigte, dass durch die Geneditierung keine Off-Target Mutationen aufgetreten sind, welche somit keinen limitierenden Faktor hinsichtlich der Differenzierungskapazität darstellen können. Die Stimulation mit PTH führte zwar nicht zu einer gesteigerten ALPL-Expression, doch konnte die TNAP-Aktivität in den ALPL-defizienten Zelllinien punktuell gesteigert werden und bildet somit eine solide Basis für weitere Experimente, die zur Therapieentwicklung für die Odonto-HPP beitragen können. / Hypophosphatasia (HPP) describes a rare inherited disorder caused mainly by heterozygous mutations in the ALPL gene. These lead to impaired activity of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP). In addition to skeletal symptoms, dental abnormalities such as premature loss of deciduous teeth without resorption of the roots and impaired mineralization of tooth hard tissues are typical features of HPP. The underlying molecular mechanisms are not yet fully understood. In the present study, cell lines of the periodontal ligament with mutations in the ALPL gene were characterized to subsequently investigate potential therapeutic strategies for HPP at the molecular level. As part of the basal characterization, the cell lines were analyzed with respect to TNAP expression (immunohistochemistry, Western blot), metabolic profile (ATP assay) and osteogenic differentiation potential (alizarin staining). Also of interest was whether off-target mutations resulted from CRISPR/Cas9-based gene editing. To investigate the molecular effects of Parathyroid Hormone (PTH), which can increase ALPL expression, two protocols were established that mimic continuous, short-term, and intermittent presence of PTH in-vitro. ALPL gene expression (qPCR), as well as TNAP activity (CSPD assay) were then determined. Basal TNAP expression was variable, ranging from complete absence in the cell lines with deletions to strong TNAP expression in the cell line with a heterogeneous point mutation. Low expression was associated with decreased cell proliferation as well as extracellular ATP. There was a differential mineralization potential mainly reflecting the TNAP expression level in the different cell lines, whereas PTH stimulation had no effect on differentiation. In contrast to clinical observations, the results indicate a high correlation between genotype and phenotype in-vitro, which remains to be confirmed in-vivo. Sequencing confirmed that no off-target mutations occurred as a result of gene editing, which thus cannot be a limiting factor with respect to differentiation capacity. Although stimulation with PTH did not result in increased ALPL expression, TNAP activity was selectively increased in the ALPL-deficient cell lines, providing a solid basis for further experiments that may contribute to therapy development for Odonto-HPP.

Tübingen, Univ., Diss., 2003.

Bei der adulten Form der Hypophosphatasie (HPP) handelt es sich um eine seltene genetisch bedingte Erkrankung des Knochen- und Mineralstoffwechsels, welche laborchemisch durch eine persistierende Verminderung der Alkalischen Phosphatase (AP) im Serum gekennzeichnet ist. Die Differentialdiagnosen einer verminderten AP-Serumaktivität sind zahlreich und eine HPP als Ursache wird nur selten in Betracht gezogen. In der Literatur finden sich mehrere Fallberichte über Insuffizienzfrakturen bei bestehender HPP. Diese Patienten wiesen AP-Serumkonzentrationen < 0,35 µkat/L auf. Daraus ergab sich das Primärziel der vorliegenden Arbeit, Patienten mit einer adulten Form der Hypophosphatasie im Patientenkollektiv eines Krankenhauses der Maximalversorgung (Universitätsklinikum Leipzig, UKL) zu identifizieren. Der Studienschwellenwert von 0,35 µkat/L wurde zur Erhöhung der diagnostischen Spezifität von Patienten mit einer HPP und möglichen Frakturen in der Anamnese gewählt (Leung et al. 2008; Iqbal et al. 2017). Hierfür wurden die Labordaten der Jahre 2000 bis 2015 des UKL analysiert. Bei 0,1 % der Patienten mit mindestens einer AP-Messung konnte eine Serumkonzentration ≤0,35 µkat/L gemessen werden. Dies entspricht 204 Patienten, welche in die Studie eingeschlossen wurden. Von diesen wiesen 11 % (N=22) eine persistierende Hypophosphatasämie und 24 % (N=48) eine einmalige Bestimmung der AP-Serumaktivität, welche dabei unter dem Studienschwellenwert lag, auf. 66 % (N=134) der Fälle wiesen in der AP-Historie AP-Serumaktivitäten im Referenzbereich auf, sodass eine HPP mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden konnte. 20 Patienten von 70 Verdachtsfällen waren bereit, an der Studie teilzunehmen. Die Bestimmung des Studienwertes für die AP ergab in 90 % (N=18) dieser Fälle erneut eine verminderte AP-Serumaktivität. Da diese zudem klinische Symptome einer HPP zeigten, wurde die Diagnose einer HPP gestellt. Lediglich in einem Fall der nachuntersuchten Patienten erfolgte im Vorfeld der Studie eine HPP-spezifische Diagnostik, welche die Diagnose einer HPP ergab. Die Ergebnisse bestätigen die Literatur dahingehend, dass die Diagnose einer HPP bei unerklärter HPÄ oft nicht in Betracht gezogen wird, jedoch bei gezielter Diagnostik bestätigt werden kann. Eine einmalige Verminderung der AP-Serumaktivität sollte nicht per se als HPP gewertet werden. Eine Beurteilung der AP-Serumaktivität im Hinblick auf eine HPP sollte unter Berücksichtigung der klinischen Diagnose und weiterer Biomarker anderer Organfunktionen erfolgen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die AP-Serumaktivität, die Hämoglobin-, Kalzium-, Albumin- und Gesamteiweißkonzentration im Rahmen einer transienten HPÄ signifikant niedriger und die CRP-Serumkonzentration signifikant höher im Vergleich zu Patienten mit einer gesicherten HPP sind. Daher wurden diese als relevante Biomarker bei der Beurteilung der AP im Hinblick auf eine HPP bewertet. Zunächst ist eine Therapie infrage kommender Differentialdiagnosen zur Normalisierung der relevanten Biomarker angezeigt. Nachfolgend sollte eine Verlaufskontrolle der AP-Serumaktivität inklusive der Bestimmung der relevanten Biomarker (Hb-, Kalzium-, Albumin-, Gesamteiweiß- und CRP-Konzentration) durchgeführt werden. Bei persistierender HPÄ sollte eine HPP-spezifische Diagnostik mittels Bestimmung der BAP- und PLP-Serumkonzentration erfolgen. Als „Basis-Profil Hypophosphatasie“ kann anhand der Ergebnisse das verwendete Follow-up-Labor vorgeschlagen werden. Im Vergleich mit der Literatur war der Anteil der identifizierten HPP-Patienten mit rezidivierenden Beschwerden des Muskel-Skelettapparates in der Anamnese in der vorliegenden Arbeit mit 94% erhöht bei im Vergleich niedrigerer durchschnittlicher AP-Serumaktivität von 0,37 µkat/L. Dies unterstützt veröffentlichte Berichte über einen möglichen Zusammenhang von Beschwerdehäufigkeit und der Höhe der AP-Serumaktivität. Für die kindliche Form der HPP konnte solch ein Zusammenhang dargestellt werden, für die adulten Formen ist dies jedoch noch nicht abschließend geklärt. Zusammenfassend sollte im Rahmen einer unerklärten HPÄ eine initiale Diagnostik mit dem verwendeten Follow-up-Labor im Hinblick auf eine Hypophosphatasie, insbesondere zur Vermeidung einer Fehltherapie, erfolgen. Betroffene Patienten sollten in einem spezialisierten Zentrum individuell beurteilt und therapiert werden. Eine Therapie von Begleiterkrankungen sollte unter Berücksichtigung der HPP-spezifischen Biomarker und Pathomechanismen durchgeführt werden.:1.Einleitung 8 Definition und Begriffserklärung 8 Definition Hypophosphatasie 8 Definition der Hypophosphatasämie und deren Verläufe 8 Epidemiologie 9 Hypophosphatasämie 9 Hypophosphatasie 10 Struktur der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) 10 Ätiologie 11 Funktion der TNAP im Knochenstoffwechsel 13 Pathomechanismus der Hypophosphatasie, ossäre und extraossäre Manifestation 14 Ossäre Manifestation 14 Extraossäre Manifestation 15 Klinische Manifestation der adulten Hypophosphatasie 16 Klinische Manifestation am Muskel-Skelett-Apparat 16 Klinische Manifestation außerhalb des Muskel-Skelett-Apparates 17 Klinische Manifestation der Odontohypophosphatasie 17 Diagnostik der adulten Hypophosphatasie 17 Laborchemische Untersuchung 18 Genetische Untersuchung 19 Bildgebung 20 Weitere Diagnostik 20 Differentialdiagnosen der verminderten AP-Serumaktivität 20 2.Zielstellung 23 3.Patienten und Methodik 24 Studiendesign 24 Identifizierung von Patienten mit einer Hypophosphatasie am UKL 24 Retrospektive Analyse am UKL vorhandener Biomarker in Hinblick auf eine Hypophosphatasämie 24 4.Gruppe I oder persistierende Hypophosphatasämie: Fälle mit mehrfachen Bestimmungen der AP-Serumaktivität, welche ausschließlich unter dem Referenzbereich (siehe belle 1, (Beck et al. 2009b)) lagen. 25 5.Gruppe II oder einmalige Hypophosphatasämie: In dieser Gruppe wurden alle Fälle mit einer einmaligen AP-Bestimmung am UKL mit einer Aktivität ≤0,35 µkat/L zusammengefasst. 25 6.Gruppe III oder transiente Hypophosphatasämie („Kontrollgruppe“): Diese Gruppe umfasste Fälle mit transienten oder akuten Hypophosphatasämien. In diesen Fällen lagen am UKL AP-Serumaktivitäten im Referenzbereich vor, was eine HPP mit hoher Wahrscheinlichkeit ausschloss. Diese wurde somit als „Kontrollgruppe“ definiert. 25 Nachuntersuchung (Follow-up) von Patienten mit einer Hypophosphatasie 25 Ablauf der Nachuntersuchung („Follow-up-Studie“) 26 Biomarker der Follow-up-Studie 27 Analytik 27 Definition Follow-up-Labor und Basis-Labor 29 Genetische Diagnostik 30 Dual-Röntgen-Absorptiometrie (Knochendichtemessung) 31 Statistische Methoden 32 7.Ergebnisse 33 Retrospektive Analyse, deskriptive Statistik der AP-Serumaktivitäten der Gesamtkohorte 33 Follow-up-Studie, deskriptive Statistik der Gruppe I + II 35 Deskriptive Darstellung der Hypophosphatasie-Patienten 36 Frakturanamnese der Hypophosphatasie-Patienten 39 Statistische Analyse der Biomarker der Hypophosphatasie-Patienten 42 Basisprofil der Hypophosphatasie-Patienten 42 Gibt es Unterschiede der Serumlevel der Biomarker zwischen HPP-Patienten und Patienten mit einer transienten Hypophosphatasämie „Kontrollgruppe“? 45 Könnte mit dem HPP-Profil retrospektiv eine Hypophosphatasie vermutet werden? 48 Darstellung der Biomarker des Nadir-Labors der Hypophosphatasie-Patienten 49 Einordnung der AP-Serumaktivität des Follow-up-Labors in die Hypophosphatasie-spezifischen Biomarker 49 Einordnung der Follow-up-AP in die osteologischen Basisprofil-Biomarker der HPP-Patienten 54 Der Einfluss der Hypophosphatasie auf die Messwerte der DXA 55 Genetische Diagnostik 57 8.Diskussion 60 Epidemiologische Daten der Gesamtkohorte, Häufigkeit einer Hypophosphatasämie 60 Häufigkeit der HPP 63 Relevante Biomarker bei der Bewertung der AP-Serumaktivität im Kontext einer Hypophosphatasämie 64 Erneute retrospektive Beurteilung der Gruppe I und II in Hinblick auf eine HPP unter Berücksichtigung der identifizierten relevanten Biomarker 67 HPP-Labor 67 Manifestation der HPP am Muskel-Skelett-Apparat und Korrelation dieser mit den HPP-spezifischen Biomarkern 70 Hypophosphatasie im Kontext möglicher osteologischer Differentialdiagnosen 73 Der Einfluss der Hypophosphatasie auf die Messwerte der DXA 75 HPP-Mutationen 76 Einordnung der erhobenen Befunde in die aktuellen Therapieoptionen und Falldiskussion 79 Limitationen 86 9.Schlussfolgerungen 88 10.Zusammenfassung der Arbeit 89 11.Literaturverzeichnis 92 12.Tabellenverzeichnis 101 13.Abbildungsverzeichnis 101 14.Anlagenverzeichnis 101 15.Anlagen 101