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The Leishmania donovani complex comprises four described species: L. donovani, L. archibaldi, L. infantum and L. chagasi. L. chagasi is the only New World species and has been considered similar to L. infantum, although some authors insist on maintenance of its independent species status. L. donovani has at least two major epidemiological subgroups whose relationships are poorly understood. In this thesis, molecular biological techniques were used to investigate the taxonomy and phylogenetic relationships within the L. donovani complex, with isoenzyme analysis (lEA) as reference technique. Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) was used to provide anonymous genetic markers which allowed overall comparisons of genomes. Selected target genes and intergenic regions were also amplified by the polymerase chain reaction (PCR), namely the major surface protease (msp or gp63), the mini-exon and the ribosomal internal transcribed spacer (ITS). PCR products of intergenic regions between msp genes (ITG/CS and ITG/L), mini-exon and ITS were analysed by restriction fragment length polymorphism (RFLP). Phylogenies generated from each of the methods were compared with that of IEA. L. infantum and L. chagasi were found to be synonymous, whilst L. donovani was found to be more polymorphic than L. infantum and a fourth possible species in the complex, L. archibaldi, was not supported. Six genetic groups of strains were identified in the L. donovani complex, based on all DNA based analyses, which agreed with IEA typing. Pooled data from RFLP and RAPD analyses generated robust phylogenies which were congruent with ITG/CS RFLP and msp DNA sequence based phylogenies, but not with lEA phylogenies. The evolutionary history of the L. donovani complex is analysed in the light of the present results. The diverse typing methods were also evaluated and genetic markers suggested, that are applicable to classification and typing of L. donovani species and strains.

Abstract Collagen prolyl 4-hydroxylases catalyze the hydroxylation of proline residues in collagens. The vertebrate enzymes are α2β2 tetramers in which the β subunit is identical to protein disulphide isomerase (PDI). Two isoforms of the catalytic α subunit have been identified in vertebrates, forming type I [α(I)]2β2 and type II [α(II)]2β2 collagen prolyl 4-hydroxylase tetramers. This thesis reports on the cloning and characterization of a third vertebrate α subunit isoform, α(III). The recombinant human α(III) isoform associates with PDI to form an active type III collagen prolyl 4-hydroxylase tetramer, and its Km values for the cosubstrates are very similar to those of the type I and II enzymes, those for a peptide substrate and an inhibitor being found to lie between the two. The α(III) mRNA is expressed in all tissues studied but at much lower levels than the α(I) mRNA. A novel mixed tetramer PHY-1/PHY-2/(PDI-2)2 was found to be the main collagen prolyl 4-hydroxylase form produced in the nematode Caenorhabditis elegans in vivo and in vitro. However, mutant nematodes can compensate for the lack of the mixed tetramer by increasing the assembly of PHY-1/PDI-2 and PHY-2/PDI-2 dimers, these forms also being unique. The catalytic properties of the recombinant mixed tetramer were characterized, and it was shown by the analysis of mutant worms that PHY-1 and PHY-2 represent the only catalytic subunits needed for the hydroxylation of cuticular collagens. The roles of the two catalytic sites in a collagen prolyl 4-hydroxylase tetramer were studied by using the C. elegans mixed tetramer and a hybrid C. elegans PHY-1/human PDI dimer. An increase in the chain length of the peptide substrate led to an identical decrease in the Km values in both enzyme forms. It is thus clear that two catalytic sites are not required for efficient hydroxylation of long peptides, and their low Km values most probably result from more effective binding to the peptide-substrate-binding domain. Inactivation of one catalytic site in the mixed tetramer reduced the activity by more than 50%, indicating that the remaining wild-type subunit cannot function fully independently.

Die alkalische Phosphatase (AP) ist in Form von verschiedenen Isoenzymen in fast allen Geweben und Flüssigkeiten des Organismus vorhanden. Durch die Auftrennung der Gesamt-AP in ihre Isoenzyme ist eine Lokalisation von krankhaften Prozessen möglich. Da in der Veterinärmedizin die AP-Isoenzymdiagnostik bisher nicht praktisch zum Einsatz kommt, wurde in der vorliegenden Arbeit die Aussagekraft der Isoenzym-Aktivitäten bei verschiedenen Krankheitsbildern und die Eignung dieses Verfahren für den Einsatz in Klinik und Praxis untersucht. Die Untersuchungen wurden an insgesamt 106 Rindern durchgeführt. 25 gesunde Rinder bildeten eine Kontrollgruppe. 69 an Diarrhoe erkrankte Kühe wurden gemäß ihrer Primärerkrankung in 6 Gruppen eingeteilt: Labmagenverlagerung nach links (LMV li) (n=28), Labmagenverlagerung nach rechts (LMV re) (n=20), Enteritis (n=5), Strangulationsileus (n=4), Labmagenulcera (n=5) und Endometritis / Mastitis (n=7). Zwei weitere Gruppen bildeten Rinder mit einer Leberfunktionsstörung (n=20) und Rinder mit einer hochgradigen Aktivitätserhöhung der Gesamt-AP ≥ 300 U/l (n=12). Zudem wurden Blutproben vom Tag der Aufnahme und der Entlassung verglichen. Die AP-Isoenzyme im Blutserum wurden mit Hilfe des Testkits HYDRAGEL ISO-PAL K20 der Firma Sebia, Fulda elektrophoretisch auf Agarosegel aufgetrennt in die Leber-1-, Leber-2-, Knochen- und intestinalen Isoenzyme. Außerdem wurden bestimmt: Gesamt-Alkalische-Phosphatase, Glutamat-Dehydrogenase, Aspartat-Amino-Transferase (ASAT), Gamma-Glutamyl-Transferase, Alanin-Amino-Trans-ferase, Gesamtbilirubin, Gesamteiweiß, Harnstoff, Beta-Hydroxybuttersäure, Cholesterol, Calcium, anorganisches Phosphat und Leukozyten. Bei den gesunden Kühen beträgt die mediane Aktivität der Gesamt-AP 122 U/l, die der intestinalen AP 22,7 U/l und die der Leber-1-AP 51,0 U/l. Bei den Kühen mit Diarrhoe ist die intestinale AP-Aktivität bei Erkrankung signifikant erhöht (M=28,2 U/l). Bei der Unterteilung in verschiedene Erkrankungen weist sie bei den Tieren mit Strangulationsileus eine signifikant höhere Aktivität als bei den anderen Krankheiten auf (M=71,4 U/l). Die Gesamt-AP-Aktivität ist jedoch in keinem Fall signifikant erhöht und gibt somit keinen Hinweis auf einen Aktivitätsanstieg der intestinalen AP. Nach Abklingen der Diarrhoe ist die Wiederherstellung der Darmfunktion anhand einer Normalisierung der intestinalen AP-Aktivität nachvoll-ziehbar, da zwischen den gesunden Kühen und den rekonvaleszenten Tieren (M=24,2 U/l) kein signifikanter Unterschied besteht. Jedoch lässt die Aktivität des intestinalen Isoenzyms keine Rückschlüsse auf die zu Grunde liegende Grund-erkrankung zu, weil auch bei den anderen Erkrankungen ähnlich hohe Aktivitäten der intestinalen AP wie beim Ileus existieren. Auffällig ist auch eine Hypocholesterolämie bei den Kühen mit LMV li (M=1,86 mmol/l), LMV re (M=1,92 mmol/l) und besonders bei den Tieren mit Ileus (M=1,36 mmol/l) gegenüber den Gesunden (M=3,45 mmol/l). Die Untersuchung von Gesamt-AP-Aktivität und Leber-1-AP-Aktivität bei den Patien-ten mit einer Leberfunktionsstörung ergibt, dass der Grad der Erhöhung dieser Parameter einen Rückschluss auf die Schwere der Erkrankung zulässt. Bei den später verstorbenen Kühen sind für die Gesamt-AP (M=178 U/l) und für das Leber-1-Isoenzym (M=116,5 U/l) die hochgradigsten Aktivitätsanstiege zu verzeichnen. Eine Prognose hinsichtlich des Ausgangs der Erkrankung ist allerdings nicht zu treffen, weil keine signifikanten Aktivitätsunterschiede zwischen Kühen mit Exitus letalis und Heilung bestehen. Aber die ASAT-Aktivitäten (M=278,1 U/l) und die Bilirubinkonzen-trationen (M=20,5 µmol/l) sind bei den Tieren mit Exitus letalis deutlich höher als bei den rekonvaleszenten Kühen (M=145,6 U/l bzw. 12,5 µmol/l) und sind somit prognostisch verwertbar. Auf Grund dieser Ergebnisse erscheint die Aussagekraft der AP-Isoenzymdiagnostik als zu gering, um diese Methodik in Praxis und Klinik zur Zeit anzuwenden.

Abstract The collagens are a family of extracellular matrix proteins with a widespread tissue distribution. Collagen biosynthesis requires the hydroxylation of a number of proline residues by prolyl 4-hydroxylase. This posttranslational modification is essential for the synthesis of all collagens, as 4-hydroxyproline deficient collagens cannot form stable triple helices at body temperature. The genes for the human and mouse prolyl 4-hydroxylase α(II) subunits were cloned and characterized in this study. The human and mouse genes are 34.6 and 30.3 kb in size, respectively, consisting of 16 exons and 15 introns. The intron sizes vary from 48-49 bp to over 8 kb in both genes. The 5' flanking regions contain no TATA box, but there are several motifs that may act as transcription factor binding sites. A novel mutually exclusively spliced exon 12a was identified in both genes. Both variants of the α(II) subunit were found to be expressed in a variety of tissues and both formed a fully active recombinant tetramer with the β subunit when expressed in insect cells. Tissue distribution of the type I and type II prolyl 4-hydroxylase isoenzymes was studied in developing, mature, and malignant cells and tissues by immunofluorescence and Western blotting. The results indicate that the type I isoenzyme is the main form in many cell types. Skeletal myocytes and smooth muscle cells appeared to have the type I isoenzyme as their only prolyl 4-hydroxylase form, whereas the type II isoenzyme was clearly the main form in chondrocytes. A strong signal for the type II enzyme was detected in cultured umbilical and capillary endothelial cells, whereas the type I isoenzyme could not be detected in these cells by immunostaining or Western blotting. Similar studies on primary chondro- and osteosarcomas and benign bone tumours indicated that the type I isoenzyme is the predominant form in both types of bone sarcoma, whereas the type II isoenzyme was more abundantly expressed in benign tumours. In chondrosarcomas, the type II isoenzyme was expressed in the nonmalignant chondrocytes, whereas their malignant counterparts switched their expression pattern to that of the type I isoenzyme. Two isoforms of the catalytic prolyl 4-hydroxylase α subunit, PHY-1 and PHY-2, have previously been characterized from Caenorhabditis elegans. This study reports the cloning and characterization of a third C. elegans α subunit isoform, PHY-3, which is much shorter than the previously characterized vertebrate and C. elegans α subunits. Nematodes homozygous for a phy-3 deletion were phenotypically wild type and fertile, but the 4-hydroxyproline content of their early embryos was reduced by about 90%. The expression of PHY-3 was found to be restricted to spermatheca of late larvae and adult nematode, indicating that PHY-3 is likely to be involved in the synthesis of collagens of the early embryo egg shells.

Die alkalische Phosphatase (AP) ist in Form von verschiedenen Isoenzymen in fast allen Geweben und Flüssigkeiten des Organismus vorhanden. Durch die Auftrennung der Gesamt-AP in ihre Isoenzyme ist eine Lokalisation von krankhaften Prozessen möglich. Da in der Veterinärmedizin die AP-Isoenzymdiagnostik bisher nicht praktisch zum Einsatz kommt, wurde in der vorliegenden Arbeit die Aussagekraft der Isoenzym-Aktivitäten bei verschiedenen Krankheitsbildern und die Eignung dieses Verfahren für den Einsatz in Klinik und Praxis untersucht. Die Untersuchungen wurden an insgesamt 106 Rindern durchgeführt. 25 gesunde Rinder bildeten eine Kontrollgruppe. 69 an Diarrhoe erkrankte Kühe wurden gemäß ihrer Primärerkrankung in 6 Gruppen eingeteilt: Labmagenverlagerung nach links (LMV li) (n=28), Labmagenverlagerung nach rechts (LMV re) (n=20), Enteritis (n=5), Strangulationsileus (n=4), Labmagenulcera (n=5) und Endometritis / Mastitis (n=7). Zwei weitere Gruppen bildeten Rinder mit einer Leberfunktionsstörung (n=20) und Rinder mit einer hochgradigen Aktivitätserhöhung der Gesamt-AP ≥ 300 U/l (n=12). Zudem wurden Blutproben vom Tag der Aufnahme und der Entlassung verglichen. Die AP-Isoenzyme im Blutserum wurden mit Hilfe des Testkits HYDRAGEL ISO-PAL K20 der Firma Sebia, Fulda elektrophoretisch auf Agarosegel aufgetrennt in die Leber-1-, Leber-2-, Knochen- und intestinalen Isoenzyme. Außerdem wurden bestimmt: Gesamt-Alkalische-Phosphatase, Glutamat-Dehydrogenase, Aspartat-Amino-Transferase (ASAT), Gamma-Glutamyl-Transferase, Alanin-Amino-Trans-ferase, Gesamtbilirubin, Gesamteiweiß, Harnstoff, Beta-Hydroxybuttersäure, Cholesterol, Calcium, anorganisches Phosphat und Leukozyten. Bei den gesunden Kühen beträgt die mediane Aktivität der Gesamt-AP 122 U/l, die der intestinalen AP 22,7 U/l und die der Leber-1-AP 51,0 U/l. Bei den Kühen mit Diarrhoe ist die intestinale AP-Aktivität bei Erkrankung signifikant erhöht (M=28,2 U/l). Bei der Unterteilung in verschiedene Erkrankungen weist sie bei den Tieren mit Strangulationsileus eine signifikant höhere Aktivität als bei den anderen Krankheiten auf (M=71,4 U/l). Die Gesamt-AP-Aktivität ist jedoch in keinem Fall signifikant erhöht und gibt somit keinen Hinweis auf einen Aktivitätsanstieg der intestinalen AP. Nach Abklingen der Diarrhoe ist die Wiederherstellung der Darmfunktion anhand einer Normalisierung der intestinalen AP-Aktivität nachvoll-ziehbar, da zwischen den gesunden Kühen und den rekonvaleszenten Tieren (M=24,2 U/l) kein signifikanter Unterschied besteht. Jedoch lässt die Aktivität des intestinalen Isoenzyms keine Rückschlüsse auf die zu Grunde liegende Grund-erkrankung zu, weil auch bei den anderen Erkrankungen ähnlich hohe Aktivitäten der intestinalen AP wie beim Ileus existieren. Auffällig ist auch eine Hypocholesterolämie bei den Kühen mit LMV li (M=1,86 mmol/l), LMV re (M=1,92 mmol/l) und besonders bei den Tieren mit Ileus (M=1,36 mmol/l) gegenüber den Gesunden (M=3,45 mmol/l). Die Untersuchung von Gesamt-AP-Aktivität und Leber-1-AP-Aktivität bei den Patien-ten mit einer Leberfunktionsstörung ergibt, dass der Grad der Erhöhung dieser Parameter einen Rückschluss auf die Schwere der Erkrankung zulässt. Bei den später verstorbenen Kühen sind für die Gesamt-AP (M=178 U/l) und für das Leber-1-Isoenzym (M=116,5 U/l) die hochgradigsten Aktivitätsanstiege zu verzeichnen. Eine Prognose hinsichtlich des Ausgangs der Erkrankung ist allerdings nicht zu treffen, weil keine signifikanten Aktivitätsunterschiede zwischen Kühen mit Exitus letalis und Heilung bestehen. Aber die ASAT-Aktivitäten (M=278,1 U/l) und die Bilirubinkonzen-trationen (M=20,5 µmol/l) sind bei den Tieren mit Exitus letalis deutlich höher als bei den rekonvaleszenten Kühen (M=145,6 U/l bzw. 12,5 µmol/l) und sind somit prognostisch verwertbar. Auf Grund dieser Ergebnisse erscheint die Aussagekraft der AP-Isoenzymdiagnostik als zu gering, um diese Methodik in Praxis und Klinik zur Zeit anzuwenden.

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Os agricultores tradicionais da região sul do Estado de São Paulo têm se mostrado mantenedores de um grande repositório de diversidade genética e de conhecimento a respeito das peculiaridades de manejo desta diversidade. A cultura do inhame (Dioscorea spp.) é mantida e manejada nesta região em roças que empregam o sistema de coivara. Esta pesquisa teve como objetivos coletar etnovariedades de inhame nas roças/quintais dos agricultores tradicionais do Vale do Ribeira, visando manter um banco de conservação ex situ na Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz" em Piracicaba – SP e estimar a diversidade morfológica e isoenzimática de inhames mantidos em sistemas agrícolas autóctones. Visitou-se 91 agricultores que ainda praticam a agricultura tradicional no Vale do Ribeira dos quais 45 cultivavam o inhame. Desses, 31% o cultivavam em roças itinerantes e 69% em quintais. Quatro espécies de inhame foram encontradas: D. trifida, D. bulbifera, D. alata e D. cayenensis. As etnovariedades foram caracterizadas por meio de marcadores isoenzimáticos, utilizando géis de poliacrilamida (seis sistemas) e amido (um sistema), e por marcadores morfológicos, num total de 24 caracteres. Para ambos os marcadores, foram calculados o índice de similaridade de Jaccard entre pares de indivíduos. Análises de agrupamento foram realizadas para variedades, roças e comunidades, a partir dos índices de similaridade de Jaccard e do critério aglomerativo UPGMA. Outro parâmetro analisado foi a correlação entre as matrizes de distância genética (isoenzimática e morfológica) e geográfica pela correlação de Pearson (r) e teste de Mantel, para verificar se a diversidade genética encontrava-se estruturada no espaço. Além disso, realizou-se a análise de variância molecular (AMOVA) para se verificar a distribuição da variabilidade nos diferentes níveis hierárquicos: entre e dentro das unidades evolutivas biológicas (roças) e culturais (comunidades). Os resultados revelaram que os agricultores tradicionais do Vale do Ribeira manejam grande diversidade genética, tanto isoenzimática como morfológica, em suas roças e que essa diversidade não está estruturada no espaço para todas as espécies cultivadas. A AMOVA indicou que para as espécies D. trifida, D. bulbifera e D. cayenensis a distribuição da variabilidade concentra-se entre roças dentro de comunidades, enquanto que para D. alata concentra-se dentro de roças para os marcadores isoenzimáticos. Para os marcadores morfológicos, a maior parte da variabilidade concentra-se entre roças dentro de comunidades para D. bulbifera e D. cayenensis e dentro de roças para D. alata e D. trifida, ressaltando-se a seleção humana para os aspectos visuais. Conclui-se que os agricultores tradicionais do Vale do Ribeira cultivam grande diversidade de etnovariedades e espécies de Dioscorea, além de possuírem grande conhecimento a respeito das peculiaridades de manejo desta cultura. Contudo, as pressões que esses agricultores estão sofrendo poderá no futuro provocar perda de diversidade genética. Recomenda-se novos estudos na região para verificar os danos causados por essas pressões aos processos evolutivos presentes nas roças dos agricultores tradicionais do Vale do Ribeira. / Traditional agriculturists of the south region of the State of São Paulo have been maintainers of a great repository of genetic diversity and knowledge regarding the management peculiarities of this diversity. The yam (Dioscorea spp.) culture is maintained and cultivated in this region in swiddens that use the system of “coivara". This research had the objective of collecting ethnovarieties of yam in the swiddens/home gardens of the traditional agriculturists of the Ribeira River Valley, aiming at maintaining a germplasm bank for ex situ conservation at the Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" in Piracicaba, SP and estimating the morphological and isoenzymatic diversity of yams kept in authoctone agricultural systems. Ninety-one agriculturists that still practice traditional agriculture were visited in the Ribeira River Valley, of which 45 cultivated yam. Of these, 31% cultivated this crop on itinerant swiddens and 69% in home gardens. Four yam species were found: D. trifida, D. bulbifera, D. cayenensis and D. alata. The ethnovarieties of each species were characterized with isoenzymatic markers, using polyacrilamide gels (six systems) and starch gels (one system), and with morphological markers, in a total of 24 characters. For both markers, the Jaccard similarity indices between pairs of individuals were obtained. Cluster analyses were conducted for varieties, swiddens and communities using the Jaccard similarity indices and the UPGMA method. Another parameter analyzed was the correlation between the genetic distances (isoenzymatic and morphological) and the geographic distance matrices using the Pearson correlation and Mantel test, to verify if the genetic diversity was structured in space. An analysis of molecular variance (AMOVA) was carried out to verify the distribution of the variability in the different hierarchic levels: within and between the biological evolutionary units (swiddens) and cultural units (communities). Results showed that the traditional agriculturists of the Ribeira River Valley maintain a great genetic diversity, both isoenzymatic and morphological, in their swiddens and home gardens, and that this diversity is not structured in space for the four species cultivated. The AMOVA results for D. trifida, D. bulbifera and D. cayenensis showed that the isoenzymatic variability is mainly concentrated among swiddens within communities, and within swiddens for D. alata. For the morphological markers, where visual aspects are an important issue in human selection, most of the variability is concentrated among swiddens within communities for D. bulbifera and D. cayenensis, and within swiddens for D. alata and D. trifida. It is concluded that the traditional agriculturists of the Ribeira River Valley cultivate great diversity of ethnovarieties and species of Dioscorea, also possessing great knowledge concerning the management peculiarities of this crop. However, the pressures that these agriculturists are suffering may cause a loss of genetic diversity in the future. Further studies are recommended in this region to verity the damage caused by these pressures in the evolutionary processes that occur in the swiddens of the Ribeira River Valley traditional agriculturists.