Orientador : Profª. Drª Daniela Parada Pavoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/08/2016 / Inclui referências : f. 106-114 / Resumo: A doença infecciosa da bursa (IBD) ou doença de Gumboro é uma doença viral de galinhas (Gallus gallus) relevante para o comércio internacional de animais e de seus produtos. Está associada à mortalidade e imunossupressão dos animais. Considerando a importância econômica da avicultura para o Brasil e o estado do Paraná, é obrigatório a tomada de medidas de controle em granjas comerciais, que visem a prevenção de surtos e a vigilância sobre o aparecimento de novas variantes, mais patogênicas, e que não respondem às vacinas. Testes diagnósticos confiáveis são ferramentas importantes no controle dessa infecção. A utilização de proteínas recombinantes como substrato de testes sorológicos é uma atraente alternativa para a produção nacional de reagentes, uma vez que os testes atualmente utilizados são importados. Sequências das proteínas antigênicas VP2 e VP3 de cepas brasileiras e estrangeiras, selvagens e vacinais foram buscadas no banco de dados do NCBI e alinhadas utilizando o programa ClustalW. Foram selecionadas 10 sequências nucleotídicas para síntese comercial clonadas no pUC57, das quais 9 da VP2 e uma da VP3. Os genes sintéticos foram clonados no vetor pET-28a (Novagen) para expressão em Escherichia coli e pMIB/V5-His (Invitrogen) para expressão em células de insetos. Fragmentos da VP3 foram obtidos por PCR fusionados à GFP para aumentar a massa molecular dos peptídeos. A expressão da VP2 em células de insetos e em E. coli não foi obtida. A VP3 e os fragmentos foram expressos na cepa BL 21 Star. A VP3 foi expressa em corpos de inclusão e solubilizada com 2 M de ureia. Os fragmentos foram obtidos na fração solúvel. A purificação das proteínas foi realizada por afinidade em resina de níquel. A reatividade da VP3 e fragmentos foi testada no teste de ELISA indireto. O teste de ELISA da VP3 com soros de animais vacinados e não vacinados apresentou 93,75% de sensibilidade e 85,19% de especificidade. Utilizando somente soros de animais imunizados o teste de ELISA apresentou 100% de sensibilidade e especificidade. O mapeamento das regiões antigênicas da VP3 mostrou duas regiões, fragmentos 2 e 7, que concentraram maior número de epitopos. Os fragmentos 5, 6, e 7 foram as regiões da VP3 mais reativas. Este estudo mostrou que a proteína recombinante VP3 pode ser utilizada para avaliar o status imunológico pós-vacinal das aves. A utilização da VP3 recombinante para diagnosticar a presença/ausência da doença em animais não vacinados deve ser melhor avaliada utilizando uma amostragem maior desses animais no teste de ELISA. Através dos resultados do mapeamento foi possível estabelecer regiões da proteína VP3 mais antigênicas, entretanto mais testes devem ser conduzidos antes de considerar a utilização dos fragmentos no diagnóstico do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV) em galinhas. Palavras-chave: doença infecciosa da bursa, doença de Gumboro, proteína recombinante, vírus da doença infecciosa da bursa, proteína VP2, proteína VP3, mapeamento de regiões antigênicas, teste de ELISA, diagnóstico da doença infecciosa da bursa. / Abstract: Infectious bursal disease (IBD) or Gumboro disease is a viral disease of chickens (Gallus gallus) relevant to international trade in animals and their products. It is associated with mortality and immunosuppression in animals. Considering the economic importance of poultry production to Brazil and to the state of Paraná, taking control measures on commercial farms is mandatory for the prevention of outbreaks and surveillance of the appearance of new more pathogenic variants that do not respond to vaccines. Reliable diagnostic tests are important tools in the control of this infection. The use of recombinant proteins as serological tests substrates is an attractive alternative to the domestic production of reagents, since the currently used tests are imported. Sequences of antigenic proteins VP2 and VP3 of Brazilian and foreign strains, wild and vaccine were sought in the NCBI database and aligned using the ClustalW program. Ten nucleotide sequences were selected, 9 sequences of VP2 and one of VP3. These sequences were commercially synthesized and cloned into pUC57. The synthetic genes were cloned into pET-28a vector (Novagen) for expression in Escherichia coli and into pMiB/V5-His (Invitrogen) for expression in insect cells. Fragments obtained by PCR using VP3 as template were used fused to GFP to increase the molecular weight of the peptides. Expression of VP2 in insect cells and E. coli was not obtained. The VP3 and the fragments were expressed in BL 21 Star strain. The VP3 was expressed in inclusion bodies and was solubilized with 2 M urea. The VP3 fragments were obtained in the soluble fraction. Purification of the protein was accomplished by nickel affinity resin. The reactivity of VP3 and fragments was tested by ELISA. The ELISA test with VP3 sera of animals vaccinated and non-vaccinated showed sensitivity of 93.75% and specificity of 85.19%. Using only the sera of immunized animals ELISA showed sensitivity and specificity of 100%. Mapping the antigenic regions of VP3 showed that two regions, fragments 2 and 7, present the highest proportion of epitopes. Fragments 5, 6, and 7 were the most reactive VP3 regions. This study showed that the recombinant protein VP3 can be used to assess post-vaccination immune status of the birds. The use of recombinant VP3 for diagnosing the presence / absence of the disease in non-vaccinated animals should be further evaluated using a larger sample of these animals in the ELISA test. Through the results of the mapping it was possible to establish regions of more antigenic protein VP3, though more tests should be conducted before considering the use of fragments in the diagnosis of IBDV in chickens. Keywords: infectious bursal disease, Gumboro disease, recombinant protein, infectious bursal disease vírus, VP2 protein, VP3 protein, mapping of antigenic regions ELISA test, diagnosis of infectious bursal disease.

Orientadores: Clarice Weis Arns, Isabela Cristina Simoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MariaJuditeBittencourt_D.pdf: 1711625 bytes, checksum: d2876be51222b1ba7526b13ab7a72795 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A doença infecciosa da bursa (IBD), denominada também doença de Gumboro, é uma doença aguda, imunossupressora, altamente contagiosa de aves jovens e de grande importância econômica para a avicultura. O vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), sorotipo 1, pode ser classificado de acordo com sua antigenicidade e patogenicidade em amostras clássicas virulentas (cv), atenuadas, variantes antigênicas ou muito virulentas (vv). Estas diferenças antigênicas são encontradas na região hipervariável do gene VP2, que é responsável pela indução de anticorpos neutralizantes e também dos possíveis marcadores de virulência que ainda não estão bem estabelecidos. O gene VP1 parece também apresentar um papel na virulência do vírus. Primeiramente, o objetivo do presente trabalho foi a identificação e caracterização molecular de 66 amostras brasileiras de IBDV através da RT-PCR de um fragmento do gene VP2 seguida pela digestão por enzimas de restrição (RE) e posterior confirmação pelo sequenciamento. A análise da RT-PCR/RE classificou 25 isolados como cepas vv e 16 como cepas cv além da classificação de 6 grupo moleculares. O sequenciamento também confirmou esta classificação com a presnça dos aminoácidos (aa) típicos das amostras vv (222A, 242I, 256I e 294I). Em 3 destes amostras vv também se observou mutações únicas que mostram pequenas, mas contínuas alterações dos vvIBDV circulantes nas granjas brasileiras. A arvore filogenética confirmou a origem comum das nossas amostras vv com os isolados de outros países assim como a origem monofilética destas amostras. Posteriormente foi feito a RT-PCR de um fragmento representativo do gene VP1 das amostras positivas para IBDV e a análise das sequências e filogenética. Quatorze amostras vv e três cv tiveram êxito nas sequências analisadas. Treze amostras vv apresentaram as substituições de aa comuns para as amostras vv (145T, 146D, 147N e 242E), exceto um que apresentou a sequência das amostras cv e na filogenia agrupou-se com estas amostras. A árvore a partir da VP1 pressupõe um rearranjo genético deste gene. Esta amostra com perfil do segmento A de amostra vv e do segmento B de cv seria o primeiro relato no Brasil de um rearranjo genético natural. Estes rearranjos de segmentos que também foram observados em amostras de outros países ou que podem ser produzidos em laboratório (quimeras) mostram que o segmento B pode estar contribuindo para a patogênese deste vírus. A origem destes rearranjos pode ser de troca genética com o uso de vacinas vivas ou se aceita a hipótese de que o segmento VP1 dos vvIBDV se originaram de um rearranjo genético de fonte desconhecida, estes rearranjos com segmento vvVP2 e cvVP1, seriam descendentes dos ancentrais dos vvVP1. Apenas um seqüenciamento completo das duas sequências e estudos in vivo poderão caracterizar o papel da VP1 na virulência desta amostra. Assim, o monitoramento contínuo das amostras de IBDV através da caracterização molecular pela análise das sequências dos genes e a detecção de alterações genéticas que possam influenciar a patogenicidade do vírus são de extrema importância, pois geram informações fundamentais que possibilitam e subsidiam o controle desta doença no Brasil / Abstract: Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a disease among young chickens of great economic importance to the poultry industry worldwide both for the both mortality as the immunosuppression. Two distinct serotypes, 1 and 2, of IBDV are recognized. Only the serotype 1 is pathogenic for chickens and classified according to the antigenicity and/or pathogenicity in classical virulent (cv) strains, very virulent (vv) strains, antigenic variant strains, and attenuated strains. This classification has been based mainly on the VP2 gene sequence, more specifically on the hypervariable region corresponding to the induction of neutralizing antibodies and the serotype specificity. However, the fundamental molecular basis for pathogenicity is not yet clear. Studies with the VP1 gene have also shown its possible role in this virulence and pathogenicity. Firstly, the aim of the present paper was the molecular characterization of sixty-six Brazilian IBDV isolates from broiler and layers flocks during the period from 1997 to 2005 by RT-PCR followed by restriction enzyme analysis of a fragment from VP2 gene variable region. Sequence and phylogenetic analysis of the positive isolates were also carried out. Twenty-five of the isolates were identified as very virulent (vv) and sixteen as classic virulent (cv). All of vv isolates had the typical amino acid (aa) residues and clustered in a phylogenetic tree with the vvIBDV strains. Three vv isolates presented four common aa substitutions and differed from other vv strains indicating that the vvIBDVs circulating on Brazilian farms are undergoing slight but continuous exchanges. Furthermore, the Brazilian IBDV isolates characterized by the VP2 sequence in cv and vv strains were analyzed by the sequence and phylogeny of the VP1 gene fragment. Our vv isolates maintained clustered with the other vvIBDVs in phylogenetic tree obtained from the VP1 gene and presented the common aa too. The same occurred with the cv isolates. However, one isolate vv showed both characters, cv and vv into VP1 sequence and clustered with the ours and other cv isolates in the tree. This isolate has similar type of a reassortment / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular