Orientador : Profª. Drª Daniela Parada Pavoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/08/2016 / Inclui referências : f. 106-114 / Resumo: A doença infecciosa da bursa (IBD) ou doença de Gumboro é uma doença viral de galinhas (Gallus gallus) relevante para o comércio internacional de animais e de seus produtos. Está associada à mortalidade e imunossupressão dos animais. Considerando a importância econômica da avicultura para o Brasil e o estado do Paraná, é obrigatório a tomada de medidas de controle em granjas comerciais, que visem a prevenção de surtos e a vigilância sobre o aparecimento de novas variantes, mais patogênicas, e que não respondem às vacinas. Testes diagnósticos confiáveis são ferramentas importantes no controle dessa infecção. A utilização de proteínas recombinantes como substrato de testes sorológicos é uma atraente alternativa para a produção nacional de reagentes, uma vez que os testes atualmente utilizados são importados. Sequências das proteínas antigênicas VP2 e VP3 de cepas brasileiras e estrangeiras, selvagens e vacinais foram buscadas no banco de dados do NCBI e alinhadas utilizando o programa ClustalW. Foram selecionadas 10 sequências nucleotídicas para síntese comercial clonadas no pUC57, das quais 9 da VP2 e uma da VP3. Os genes sintéticos foram clonados no vetor pET-28a (Novagen) para expressão em Escherichia coli e pMIB/V5-His (Invitrogen) para expressão em células de insetos. Fragmentos da VP3 foram obtidos por PCR fusionados à GFP para aumentar a massa molecular dos peptídeos. A expressão da VP2 em células de insetos e em E. coli não foi obtida. A VP3 e os fragmentos foram expressos na cepa BL 21 Star. A VP3 foi expressa em corpos de inclusão e solubilizada com 2 M de ureia. Os fragmentos foram obtidos na fração solúvel. A purificação das proteínas foi realizada por afinidade em resina de níquel. A reatividade da VP3 e fragmentos foi testada no teste de ELISA indireto. O teste de ELISA da VP3 com soros de animais vacinados e não vacinados apresentou 93,75% de sensibilidade e 85,19% de especificidade. Utilizando somente soros de animais imunizados o teste de ELISA apresentou 100% de sensibilidade e especificidade. O mapeamento das regiões antigênicas da VP3 mostrou duas regiões, fragmentos 2 e 7, que concentraram maior número de epitopos. Os fragmentos 5, 6, e 7 foram as regiões da VP3 mais reativas. Este estudo mostrou que a proteína recombinante VP3 pode ser utilizada para avaliar o status imunológico pós-vacinal das aves. A utilização da VP3 recombinante para diagnosticar a presença/ausência da doença em animais não vacinados deve ser melhor avaliada utilizando uma amostragem maior desses animais no teste de ELISA. Através dos resultados do mapeamento foi possível estabelecer regiões da proteína VP3 mais antigênicas, entretanto mais testes devem ser conduzidos antes de considerar a utilização dos fragmentos no diagnóstico do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV) em galinhas. Palavras-chave: doença infecciosa da bursa, doença de Gumboro, proteína recombinante, vírus da doença infecciosa da bursa, proteína VP2, proteína VP3, mapeamento de regiões antigênicas, teste de ELISA, diagnóstico da doença infecciosa da bursa. / Abstract: Infectious bursal disease (IBD) or Gumboro disease is a viral disease of chickens (Gallus gallus) relevant to international trade in animals and their products. It is associated with mortality and immunosuppression in animals. Considering the economic importance of poultry production to Brazil and to the state of Paraná, taking control measures on commercial farms is mandatory for the prevention of outbreaks and surveillance of the appearance of new more pathogenic variants that do not respond to vaccines. Reliable diagnostic tests are important tools in the control of this infection. The use of recombinant proteins as serological tests substrates is an attractive alternative to the domestic production of reagents, since the currently used tests are imported. Sequences of antigenic proteins VP2 and VP3 of Brazilian and foreign strains, wild and vaccine were sought in the NCBI database and aligned using the ClustalW program. Ten nucleotide sequences were selected, 9 sequences of VP2 and one of VP3. These sequences were commercially synthesized and cloned into pUC57. The synthetic genes were cloned into pET-28a vector (Novagen) for expression in Escherichia coli and into pMiB/V5-His (Invitrogen) for expression in insect cells. Fragments obtained by PCR using VP3 as template were used fused to GFP to increase the molecular weight of the peptides. Expression of VP2 in insect cells and E. coli was not obtained. The VP3 and the fragments were expressed in BL 21 Star strain. The VP3 was expressed in inclusion bodies and was solubilized with 2 M urea. The VP3 fragments were obtained in the soluble fraction. Purification of the protein was accomplished by nickel affinity resin. The reactivity of VP3 and fragments was tested by ELISA. The ELISA test with VP3 sera of animals vaccinated and non-vaccinated showed sensitivity of 93.75% and specificity of 85.19%. Using only the sera of immunized animals ELISA showed sensitivity and specificity of 100%. Mapping the antigenic regions of VP3 showed that two regions, fragments 2 and 7, present the highest proportion of epitopes. Fragments 5, 6, and 7 were the most reactive VP3 regions. This study showed that the recombinant protein VP3 can be used to assess post-vaccination immune status of the birds. The use of recombinant VP3 for diagnosing the presence / absence of the disease in non-vaccinated animals should be further evaluated using a larger sample of these animals in the ELISA test. Through the results of the mapping it was possible to establish regions of more antigenic protein VP3, though more tests should be conducted before considering the use of fragments in the diagnosis of IBDV in chickens. Keywords: infectious bursal disease, Gumboro disease, recombinant protein, infectious bursal disease vírus, VP2 protein, VP3 protein, mapping of antigenic regions ELISA test, diagnosis of infectious bursal disease.

Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 16.pdf: 27181026 bytes, checksum: 6dd85c661271ca63e8ec1eaa11f96d9b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral canina (LVC) e uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, principalmente por Leishmania infantum. A epidemiologia da doença varia de região para região e o entendimento dos fatores associados à infecção em cães pode ajudar na elaboração de medidas de controle mais específicas. O diagnóstico sorológico da infecção sofreu mudanças importantes nos últimos anos com a introdução do TR-DPP® e do estabelecimento de novos critérios de diagnóstico (TR-DPP® + EIE-LVC) pelo Ministério da Saúde. Dentro desse contexto, no presente estudo objetivou-se estudar a epidemiologia da LVC no município de Goiana, estado de Pernambuco, nordeste do Brasil. Para tal, realizaram-se testes sorológicos (TR-DPP® e EIE-LVC) e análise clínico-epidemiológica em 360 cães semi e domiciliados, de ambos os sexos, raças e idades variadas, nos distritos de Atapuz, Tejucupapo e Pontas de Pedra no referido município. No TR-DPP®47 (13,1 por cento) animais foram reagentes, onde se observou associação significativa dos resultados com os seguintes sinais clínicos: alopecia, lesões na pele paresia e linfonodomegalia. Já no EIE-LVC 21 (5,8 por cento) animais foram reagentes, havendo associação significativa entre a classificação clínica dos animais, condição corporal, alopecia, lesões na pele, secreção ocular, paresia e linfonodomegalia. Já de acordo com o critério do Ministério da Saúde do Brasil, apenas 15 (4,2 por cento) animais foram classificados como positivos. De fato, verificou-se uma fraca concordância (Kappa = 0,39) entre os dois testes sorológicos. Conclui-se que a LVC encontra-se estabelecida em Goiana e que o uso do TR-DPP® como teste de triagem e do EIE-LVC como teste confirmatório pode levar a perda de cães infectados, uma vez que cães positivos do TR-DPP® são negativos no EIE-LVC e vice-versa

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Diante do exposto, aliados ao fato de que o fígado é o órgão onde se observa as principais alterações provocadas pelo Virus Dengue (VDEN) em humanos, torna-se importante analisar o fígado de primatas do gênero Callithrix a fim de estudar a patogênese e a imunopatologia da infecção sequencial pelo VDEN. No total, 26 PNH da espécie Callithrix penicillata foram submetidos a infecção primária (IP) por via subcutânea com VDEN-3 (3,23 x 103 PFU/mL), sendo 13 destes animais anestesiados e sacrificados diariamente por sete dias pós-infecção (dpi) (fase aguda) e em intervalos aleatórios até 60 dpi (fase convalescente); a infecção secundária (IS) com VDEN-2 (4,47 x 104 PFU/mL) foi realizada dois meses após a IP nos demais 13 animais. Animais sentinelas não infectados foram reservados até o final do experimento. O fígado dos animais foram processados para histopatologia e imunohistoquímica usando anticorpos policlonais para VDEN e anticorpos para análises da resposta imune inata, celular e citocínica. Os PNH estudados foram suscetíveis à replicação sequencial do VDEN-3 e VDEN-2 no fígado, havendo expressão de antígenos virais em hepatócitos, células de Kupffer e nos corpúsculos de Councilman; o comprometimento histopatológico do fígado foi caracterizado por: presença de apoptose; focos de necrose lítica; esteatose; tumefação cellular; inflamação acinar, no espaço porta (EP) e na veia hepática central (VHC); hiperplasia/hipertrofia em células de Kupffer, bem como, hemossiderina em células de Kupffer; e dilatação dos sinusóides. A intensidade da lesão hepática foi proeminente na fase aguda da IP e IS, apresentando discreta hepatite aguda. A apoptose foi a forma predominante de morte em hepatócitos; bem como, necrose lítica e o infiltrado inflamatório apresentaram padrão de distribuição predominante em Z2. Observou-se aumento na expressão acinar de macrófagos ativados, células NK, proteína S-100 e linfócitos B durante as fases da IP e IS; houve ainda, aumento da expressão acinar de linfócitos TCD4+ durante a fase aguda da IP; observou-se aumento na expressão acinar de IFN- durante as fases da IP e IS, TNF-α e IL-8 com maior prevalência na IS, TGF-β e IL-10 mais expressas na fase aguda da IP, proteína Fas durante a fase aguda da IP e IS e VCAM na fase aguda da IS e aumento na expressão nos EP. Esses achados foram semelhantes aos observados em fígados de casos fatais de dengue em humanos, porém com intensidade e amplitude menor, sugerindo que PNH da espécie Callithrix penicillata é um bom modelo experimental para o estudo da infecção pelo VDEN, especialmente os aspectos imunopatológicos. / Dengue is one of most important public health problem in the world, and one of the factors that contribute with this situation is the lack of an effective vaccine against the disease, and in part, this difficulty to obtain is due clinical the lack of an experimental model that mimic the infection and manifestation of the disease as those observed in humans. Then, the Evandro Chagas Institute showed the presence of dengue antigens using the Immunohistochemistry assay, in the liver of a non-human primate (NHP) of the species Callithrix jacchus, with a fatal outcome following dengue hemorrhagic fever. Based in the above considerations and in addition to the fact that the liver is the targetb organ for Dengue Virus (DENV) in humans, it is important to analyze the liver of primates of the genus Callithrix in order to study the pathogenesis and the immunopathology of sequential infection by DENV. A total of 26 NHP Callithrix penicillata were submitted to primary infection (PI) subcutaneously with DENV-3 (3.23 x 103 PFU/mL), and 13 of these animals anesthetized and sacrificed daily for seven days post-infection (dpi) (acute phase) and in random intervals until 60 dpi (convalescent phase); the secondary infection (SI) with DENV-2 (4.47 x 104 PFU/mL) was performed two months after the PI in the remaining 13 animals. Uninfected sentinels animals were reserved up ending of the experiment. The liver of the animals were processed for histopathology and Immunohistochemical assay using polyclonal antibodies to DENV and antibodies for analyses of the innate and cellular immune response as well as the cytokine expression . The NHP were susceptible to sequential infection by DENV-3 and DENV-2; in the liver viral antigens were expressed in hepatocytes, Kupffer cells and Councilman bodies; the histopathological changes in liver was characterized by the presence of apoptosis, focal lytic necrosis, steatosis, swelling cellular, inflammation (acinar, EP and HCV), hyperplasia/hypertrophy in Kupffer cells, hemosiderin in Kupffer cells and sinusoidal dilatation; the intensity of the liver damage was prominent in the acute phase of PI and SI resulting in acute hepatitis. In addition the apoptosis was the most frequent mechanism of death of hepatocytes; lytic necrosis and inflammatory infiltrate showed predominant distribution pattern in Z2. An increase of the acinar expression of activated macrophages, NK cells, S-100 protein and B-lymphocytes during the stages of PI and SI; as well as, increased acinar expression of TCD4 + lymphocytes during the acute phase of PI; as to the quantification of cytokines and molecules, was observed an increase in acinar expression of: IFN- during the stages of PI and SI, TNF-α and IL-8 with higher prevalence in SI, TGF-β and IL-10 with prevalence in acute phase of PI, Fas protein during the acute phase of PI and SI and VCAM in acute phase of SI, as well as increase in expression in the EP. These findings were similar to those observed in livers from fatal cases of dengue fever in humans, but with lower intensity and amplitude, thus indicating that NHP Callithrix penicillata species is a good experimental model for infection by DENV, involving immunopathologic studies.