Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O Vírus Respiratório Sincicial Humano (VRSH) é considerado o principal causador de infecções do trato respiratório inferior, principalmente bronquiolite e pneumonia em crianças e recém nascidos, e tem se mostrado também um importante agente de infecção respiratória aguda em imunocomprometidos. Há uma grande variedade de técnicas disponíveis para o diagnóstico do VRSH, diferindo em termos de sensibilidade, custo e tempo para obtenção dos resultados. Fatores pré-analíticos como coleta e processamento de amostras, podem interferir no resultado final. O presente estudo analisou alguns dos métodos diagnósticos disponíveis para VRSH e verificou se o serviço oferecido ao Hospital São Paulo (HSP) é satisfatório na identificação dos pacientes infectados. Foram analisados dois grupos distintos de pacientes com sintomas de infecção do trato respiratório, no ano de 2008, um composto por crianças da comunidade, menores de 12 anos, atendidas no Núcleo de Assistência a Saúde do Funcionário (NASF) e outro composto por pacientes em programa de transplante, atendidos na enfermaria ou ambulatório de Transplante de Medula Óssea (TMO) do HSP. As amostras de crianças foram submetidas aos métodos de isolamento viral (ISO), imunofluorescência direta (IFD) e reação em cadeia da polimerase precedida por transcrição reversa (RT-PCR), as amostras dos pacientes TMO foram submetidas ainda a teste imunocromatográfico (TI). A comparação entre as técnicas foi realizada utilizando a RT-PCR como padrão ouro. O pico de detecção do VRSH no grupo de crianças ocorreu em Abril, e no grupo de TMO o vírus foi detectado de forma homogênea entre os meses de Março e Junho. Das 128 amostras de crianças, 18 (14%) foram positivas para VRSH em ao menos uma técnica. A positividade para as técnicas de ISO, IFD e RT-PCR foi de 3,1%, 11,7% e 14% respectivamente. O valor do coeficiente kappa para a comparação entre RT-PCR e ISO foi de 0,32 e para a comparação entre RT-PCR e IFD foi de 0,89. Entre as 111 amostras do grupo TMO, 19 (17,1%) foram positivas para VRSH em ao menos uma técnica. A positividade para as técnicas de ISO, TI, IFD e RT-PCR foi de 0,96%, 4%, 10,8% e 12,6% respectivamente. O valor do coeficiente kappa para a comparação entre RT-PCR e ISO foi de 0,13, para a comparação entre RT-PCR e IFD foi de 0,48 e comparando RT-PCR e TI o valor do coeficiente foi de 0,46. Com este trabalho podemos concluir que a baixa sensibilidade da técnica de ISO e do TI não justifica sua utilização na rotina diagnóstica. No grupo de crianças a utilização da técnica de imunofluorescência direta para vigilância epidemiológica é suficiente. Para os pacientes imunossuprimidos a imunofluorescência direta deve ser utilizada para a realização de vigilância, porém, em situações específicas, a RT-PCR deve ser considerada como importante ferramenta para o aumento da taxa de detecção do VRSH. / The human respiratory syncytial virus (HRSV) is considered the main cause of lower respiratory tract infection, mainly bronchiolitis and pneumonia in children and newborn, and has been an important cause of acute respiratory infection in immunocompromised patients. There is much diversity of available techniques for diagnosis of HRSV differing in sensitivity, cost and time to obtain results. Pre-analytical factors such as samples collection and processing, may affect results. This study had analyzed some available methods for HRSV diagnosis and verified if the laboratory services offered to the Sao Paulo Hospital (HSP) are satisfactory in the identification of infected patients. We analyzed two patients groups with respiratory tract infection symptoms in the year 2008, the first one included community children under 12 years old, attended at “Núcleo de Assistência a Saúde do Funcionário (NASF)”, and the second one included patients on transplant program, attended on the bone marrow transplant (BMT) unit of HSP. Children samples were tested by viral isolation (ISO), direct immunofluorescence (DIF) and polymerase chain reaction preceded by reverse transcription (RT-PCR), the immunocompromised patients samples were also tested in a immunochromatographic assay (IT). The comparisons among the techniques were performed using the RT-PCR as gold standard. The detection peak of HRSV in children occurred in April, and in the BMT group the virus was detected evenly between the months of March and June. Of the 128 children samples, 18 (14%) were positive for HRSV in at least one technique. The positivity for ISO, DIF, and RT-PCR was 3.1%, 11.7% and 14% respectively. The kappa coefficient from comparisons between RT-PCR and ISO was 0.32 and 0.89, from RT-PCR and DIF. Among the 111 samples of immunocompromised patients, 19 (17.1%) were positive for HRSV in at least one technique. The positivity for ISO, IT, DIF and RTPCR was 0.96%, 4%, 10.8% and 12.6% respectively. The kappa coefficient from comparison between RT-PCR and ISO was 0.13, 0.48 from RT-PCR and DIF and 0.46 from RT-PCR and IT comparisons. We conclude that the low sensitivity of both viral isolation and immunocromatographic assay do not support its use on routine practice. For the children group, DIF is considered sufficient for epidemiological surveillance. For immunocompromised patients, the DIF should be used for surveillance, but, in some special circumstances, RT-PCR should be considered as an important tool to increase the detection rates of HRSV. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-16Bitstream added on 2014-06-13T19:55:49Z : No. of bitstreams: 1 sabbag_mp_me_sjrp.pdf: 582990 bytes, checksum: a674199278bb87518fc43d93309aefd1 (MD5) / As infecções respiratórias agudas (IRAs) constituem a principal causa de mortalidade infantil no mundo, e o Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV – Human Respiratory Syncytial Virus) é um dos principais agentes etiológicos das IRAs. Este vírus pertencente à família Paramyxoviridae, é envelopado, de simetria helicoidal, cujo genoma é RNA de fita simples não segmentada. A infectividade do vírus está relacionada com suas proteínas de membrana e dentre elas a glicoproteína G, que é responsável pela ligação do vírus à célula hospedeira e conseqüente instalação da infecção. Esta glicoproteína exerce um importante papel como antígeno de reconhecimento, sendo alvo para identificação do RSV através de anticorpos. Existem evidências de que esta proteína se liga a receptores glicosilados na célula hospedeira, porém ainda não foi descrito um receptor para a proteína G na célula. Para elucidar estes mecanismos de interação, foram realizados estudos experimentais e teóricos desta proteína. Os domínios solúveis da região N-terminal (1 a 38 aa) e C-terminal (67 a 298 aa), com 231 aminoácidos da glicoproteína G do hRSV foram clonados e a região N-terminal foi expressa em bactéria BL21 pLysS. Em paralelo, foi realizada a caracterização teórica desta proteína, e foram avaliados os possíveis sítios de interação da mesma com glicosaminoglicanos (heparina). Foram obtidos dois modelos teóricos para a proteína G do hRSV, bem como dois modelos de interação com heparina, determinando portanto, um possível sítio de ocorrência de interação. O conhecimento da estrutura da proteína G é de grande importância para elucidar a composição da estrutura e os mecanismos de interação com potenciais ligantes e deste modo, em um passo posterior, propor mecanismos de reconhecimento celular pelo hRSV, através de glicosaminoglicanos / Acute Respiratory Infections (ARI) are the leading cause of infant mortality in the world, and the Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the main agents of ARI. This virus belongs to Paramyxoviridae family, has a lipidic envelope, helical symmetry and its genome is a single-stranded RNA. The viral infectivity is related to its membrane proteins and among them the G glycoprotein, which is responsible for binding the virus to the host cell and consequent infection. This glycoprotein plays an important role as antigen recognition, being the target for hRSV identification through antibodies. There are evidences that this protein binds to host cell glycosylated receptors, but it has not been described a receptor for G protein in the cell yet. To elucidate these interaction mechanisms and understand the process of viral infectivity, we performed experimental and theoretical studies of this protein. The soluble domains of the N-terminal (1-38 aa) and C-terminal regions (67-298 aa), with 231 amino acids of the hRSV G glycoprotein have been cloned and the N-terminal region was expressed in BL21 pLysS bacteria. In a later trial these peptides will be purified and biophysical tests will be done. It was also performed a theoretical characterization of this protein, to assess the possible interaction sites with glycosaminoglycan (heparin). It were obtained two theoretical models for the hRSV G protein as well as two interaction models with heparin, in order to determine a possible site of occurrence of interaction. Knowledge of G protein structure is of great importance to elucidate the mechanism of viral infectivity and interaction mechanisms with potential ligants, and the results obtained in this work will allow us, in a later step, to propose mechanisms of cellular recognition by hRSV through glycosaminoglycans

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-27Bitstream added on 2014-06-13T20:29:20Z : No. of bitstreams: 1 cravo_hlp_me_sjrp.pdf: 853824 bytes, checksum: 43cbe13f547f1fdf2dfdfbf56e696a9a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) foi identificado em 1957 e mesmo após vários anos de investigação, nenhuma vacina foi desenvolvida. Acredita-se que a chave de inibição da ação viral são suas glicoproteínas de membrana, em especial a proteína de fusão (F), que com auxílio da proteína de ligação (G), é responsável pela instalação do hRSV na célula hospedeira. Há evidências experimentais de que compostos como flavonóides e glicosaminoglicanos podem diminuir a infecção viral, sendo então a proteína F um bom alvo para a ação destes compostos. O presente estudo utilizou de ferramentas de bioinformática para verificar as possíveis regiões de interação da proteína F com a Heparina Sulfatada e Flavonóides. Os programas de bioinformática foram utilizados para: modelagem dos compostos, caracterização e previsão da estrutura secundária da proteína, modelagem da estrutura terciária e docking molecular entre o modelo da proteína F e as estruturas tridimensionais dos Flavonóides e da Heparina Sulfatada. Modelos válidos foram obtidos para as estruturas tridimensionais dos flavonóides e para o modelo completo da proteína F. As características da proteína incluem um alto nível de conservação na seqüência de aminoácidos e, especialmente, em seus sítios de ligação. O docking da proteína com a Heparina, e o virtual screening da biblioteca de Flavonóides e a estrutura da proteína, resultaram em sítios de interação com grande potencial de inibição, uma vez que concordam com evidências experimentais descritos na literatura. A Heparina liga-se ao sítio de clivagem II, importante região para obtenção da atividade de fusão da proteína. Os Flavonóides podem se ligar a região hidrofóbica que desestabiliza... / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) was identified in 1957 and even after several years of research, no vaccine has been developed yet. It is believed that the key to the inhibition of viral action is its membrane glycoproteins, including the Fusion Protein (F), responsible for the installation of the hRSV in the host cell. There are evidences that compounds such as flavonoids and glycosaminoglycans can decrease the viral infection, and F protein can be a good target for the action of these compounds. The present study checked the possible sites of interaction between F protein and heparin and flavonoids, using computational tools. Bioinformatics programs were used for: modeling compounds, characterization and prediction of protein secondary structure, tertiary structure modeling and the docking between the protein model and the structures of flavonoids and sulfated heparin. Valid models were obtained for flavonoids structures and the complete model of F protein. The characteristics of the protein include a high level of conservation in amino acid sequence and especially in its binding sites. The heparin docking and virtual screening of flavonoids resulted in interaction sites with great potential for inhibition, since they agree with other studies and experimental evidence of F protein inhibition. This study shows that compounds such as sulfated heparin and flavonoids interact in important sites of F protein. Heparin binds to the cleavage site II and flavonoids can bind to the hydrophobic site that destabilizes the formation of the six-helix-bundle region. Both regions are important for conformational changes that F protein undergoes to get its fusion activity. Docking showed that molecular interactions are likely to occur and selected the best candidates for a possible inhibitor. These evidences... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Prof. Dr. Nelson A. Rosário Filho / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente. Defesa: Curitiba, 12/12/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Alergia, imunologia e pneumonia pedátrica / Resumo: O vírus sincicial respiratório humano (VSR) é considerado o principal agente isolado de infecções respiratórias na infância. Quase a totalidade das crianças aos 2 ano de idade já foram infectadas pelo VSR. Prematuros, crianças com broncodisplasia pulmonar e os cardiopatas compõe os grupos de risco para infecções mais graves, hospitalizações e óbito em infecções agudas pelo VSR. Fatores ambientais e sociais como desmame precoce, tabagismo passivo, permanência em creches, aglomerações domiciliares, convívio com crianças escolares e baixo nível de escolaridade dos pais, aumentam a gravidade da infecção. O estudo tem por objetivo verificar a incidência de infecções graves pelo VSR em crianças prematuras. Acompanhou-se 103 prematuros durante 1 ano após a alta da unidade de terapia intensiva (UTI) neonatal do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná As avaliações clínicas foram mensais. Contatos telefônicos com as famílias ocorriam semanalmente e toda vez que fosse identificada uma intercorrência respiratória realizava-se um consulta não programada. Nos quadros de infecções do trato respiratório inferior (ITRI) a pesquisa de vírus respiratórios (VSR, adenovírus, metapneumovírus, influenza A e B, parainfluenza 1,2,3, bocavírus e coronavírus) no lavado nasofaríngeo (LNF) era realizada pelo método de reação em cadeia de polimerase (PCR). Foram avaliados 136 episódios de ITRI. Em 20 episódios houve necessidade de internamento sendo 8 em UTI. Foi pesquisado vírus em 125 amostras do LNF. O VSR foi o mais frequentemente encontrado em 33,4% das amostras isoladamente ou em co-detecções. O Bocavírus foi o segundo vírus mais detectado (23,4%). O VSR foi detectado em amostras de 45% das crianças que internaram em enfermaria e na UTI. As variáveis sociais, econômicas e ambientais não mostraram-se significativas para ITRI grave no grupo estudado. Houve codetecção em 36% das amostras. Cerca de 10% dos pacientes acompanhados apresentaram sibilância recorrente (mais que 3 episódios) durante o período. A incidência de infecções graves pelo VSR na população estudada foi de 8,73%. Não comprovou-e a associação de variáveis ambientais e sociais com a gravidade do quadros respiratórios causados pelo VSR. Palavras-chave: Infecções por vírus respiratório sincicial. Vírus respiratórios. Infecções respiratórias. Prematuro. / Abstract: The human respiratory syncytial virus (RSV) is the main agent isolated from respiratory infections in childhood. Almost all children 2 years of age have been infected with RSV. Premature infants, children with bronchopulmonary dysplasia and heart disease are the risk groups for severe infections, hospitalizations and death in acute RSV infections. Environmental and social factors such as cessation of breastfeeding, passive smoking, stay in daycare, home crowded, contact with school siblings and low levels of parental education, increase the severity of infection. The study aims to determine the incidence of severe RSV infections in premature infants. Followed up 103 premature infants for 1 year after discharge from the intensive care unit (ICU) of the Clinics Hospital of the Federal University of Paraná. Clinical assessments were monthly. Telephone contacts with families occurred weekly and every time it was identified a respiratory complication a non-scheduled visit was realized. In lower respiratory tract infections (LRTI) the research of respiratory viruses (RSV, adenovirus, metapneumovirus, influenza A and B, parainfluenza 1,2,3, bocavirus and coronavirus) in nasopharyngeal lavage (LNF) was performed by the method polymerase chain reaction (PCR) There were 136 episodes of LRTI. Hospitalization was need in 20 episodes of LRTI and in 8 cases need ICU admission. Viruses were screened in 125 samples of LNF. The RSV was most often found in 33.4% of samples alone or in co-detections. Bocavirus was the second most frequently detected virus (23.4%). RSV was detected in samples from 45% of children who were hospitalized. Social, economic and environmental variables were not significant for severe LRTI in the group studied. There was co-detection in 36% of samples. About 10% of patients had recurrent wheezing (more than 3 episodes) during the period. The incidence of severe RSV infections in the study population was 8.73%. The association of environmental and social variables with the severity of respiratory symptoms caused by RSV was not confirmed. Keywords: Respiratory syncytial virus infections. Respiratory viruses. Respiratory tract infections. Infant, Premature.

Respiratory syncytial virus is well recognized as the most important pathogen accounting for acute respiratory disease in infants and young children, mainly bronchiolitis and pneumonia. Two major antigenic subgroups, A and B, have been identified; however, there is a disagreement between the severity of the disease caused by them. This study investigated a possible association between RSV subgroups and severity of the cases. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction was used to characterize 128 RSV nasopharyngeal specimens from children less than five years old experiencing acute respiratory disease. It was possible to subgroup 64.1% samples in RSV A (64) and RSV B (18). Severity was measured by clinical evaluation associated with demographic factors. For RSV A-infected patients, 53.1% were hospitalized, whereas for RSV B it was 27.8%. Around 35.0% of the patients presented risk factors for severity. The hospitalization happened for 47.6% of RSV A patients and for 18.2% of RSV B, for children without risk factors. It was observed a trend for RSV B infection to be milder than RSV A. Even though RSV A infected patients were more likely to require hospitalization than those infected by RSV B, including cases without underlying condition and prematurity, the disease severity could not to be attributed to the RSV subgroups. / O vírus respiratório sincicial (VRS) é referido como o principal agente viral de doença respiratória aguda (DRA) em recém nascidos e lactentes, causando principalmente bronquiolite e pneumonia. Dois subgrupos antigênicos, A e B, são conhecidos, entretanto há divergências a respeito da gravidade da doença causada por esses subgrupos. Para tentar caracterizar 128 amostras de VRS obtidas de crianças menores de cinco anos de idade com DRA, foi utilizada a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR). Desta maneira, foram subgrupadas 64,1% (82/128) das amostras, sendo 64 VRS A e 18 VRS B. No período de estudo o VRS A predominou sobre o B e em quatro anos observou-se a cocirculação alternada de ambos, sendo o VRS B mais detectado em dois deles. O critério de gravidade foi definido com base nas informações clínicas e nos dados demográficos obtidos das crianças infectadas. Dentre os pacientes com infecção pelo VRS A, a taxa de hospitalização foi de 53,1% (34/64) e para o VRS B de 27,8% (5/18) (p=0,067; OR=2,947; RR=1,250; IC 95%=0,940-9,235; mediana de idade: 2,1 e 3 meses, respectivamente). Das crianças infectadas pelo VRS A, 59,4% (38/64) eram <6 meses de idade, enquanto que para o VRS B esse percentual foi de 55,6% (10/18). Todavia, dentre os infectados pelo VRS B nenhum era <1 mês. Aproximadamente 35,0% (29/82) das crianças apresentaram doença de base e prematuridade. Quando se excluiu esses fatores de risco e procedeu à uma análise, observou-se uma taxa de hospitalização de 47,6% (20/42) e 18,2% (2/11), respectivamente para os casos de VRS A e B (p=0,097, OR=4,091; RR=1,281; IC 95%=0,788-21,249). Concluindo, não foi observada diferença estatística para gravidade clínica entre os subgrupos do VRS, mas apenas uma tendência de doença mais branda pelo VRS B. Embora pacientes infectados pelo VRS A tenham sido mais hospitalizados do que os infectados pelo VRS B, inclusive os casos sem doença de base e prematuridade, a gravidade da doença não pôde ser atribuída aos subgrupos do VRS. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Neste projeto caracterizamos a interação da nucleoproteína viral (N) do Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) com as proteínas PRMT5 e WDR77, que constituem o metilosomo celular. Confirmamos que essa interação ocorre através de co-imunoprecipitação em células humanas, e de interação in vitro dessas proteínas purificadas. Demonstramos a co-localização dessas proteínas na célula através de microscopias de imunofluorescência e confocal. Inibindo ou aumentando a expressão de PRMT5 não observamos impacto na replicação viral. Verificamos que ocorre metilação em N tanto em resíduos de argininas como de lisinas, com anticorpos específicos para essas modificações, e por espectrometria de massas, indicando significado funcional. Com essa evidência testamos o efeito de inibidores de metilação e demetilação, em argininas e lisinas. Obtivemos efeito inibitório significativo da replicação do HRSV com um inibidor de metilação de lisina, UNC0646, indicando que a interação N-metilossomo tem potencial como alvo terapêutico contra HRSV. / In this project we had as objective to characterize the interaction observed previously in the laboratory of viral nucleoprotein (N) with PRMT5 and WDR77 proteins that constitute the cell metilosome. We confirmed that this interaction occurs through co-imunoprecipitation in human cells and in vitro interaction of these purified proteins. We also demonstrated the co-localization of these proteins in inclusion bodies, by immunofluorescence and confocal microscopy. Inhibiting or enhancing PRMT5 expression we didnt see effect on viral replication. Our results show that methylation occurs in both arginine and lysine residues, through reactivity with antibodies specific to these modifications, and analysis by mass spectrometry. We tested the effect of arginine and lysine methylation and de-methylation inhibitors in viral replication. We obtained significant inhibitory effect on HRSV replication with a lysine methylation inhibitor, UNC0646, indicating that N-metilossome interaction has the potential to be exploited as a therapeutic target in developing antiviral drugs.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) causa doença respiratória principalmente em recém-nascidos e bebês. A infecção por HRSV exerce forte interferência sobre a localização de actina, fenômeno que propomos estar relacionado à interação de TPM com M e P, levando ao rearranjo dos microtúbulos. Os objetivos gerais do projeto são de analisar interações in vitro, em bactéria e em célula entre TPM com M e P. Os dados obtidos indicam que ocorre a interação in vitro entre M e TPM 3 mas não ocorre entre P e TPM 3. Os estudos realizados em célula indicam a interação de M e P com TPM 3. Com siRNA para TPM 3 os dados não foram conclusivos e para a super expressão de TPM 3 verificamos que ocorre inibição da replicação viral. Testamos uma droga que desacopla TPM 3 dos filamentos de actina e os resultados indicam inibição da replicação viral. Concluímos com esses dados que TPM 3 tem papel fundamental no ciclo replicativo do vírus e que sua interação com M tem potencial para ser explorada como alvo terapêutico no desenvolvimento de antivirais contra HRSV. / Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) causes respiratory disease in newborns and babies. The HRSV infection exerts strong interference on intracellular location of actin, a phenomenon that we propose to be connected to the interaction of TPM with M and P, leading to the rearrangement of microtubules. In this project we propose to analyze interactions in vitro, in bacteria and in cells between TPM and P or M. The obtained data indicate that an in vitro interaction between M and TPM occurs but does not occur between P and TPM. Cell studies indicate an interaction of M and P with TPM. With siRNA fot TPM 3 the data were not conclusive, and for overexpression of TPM 3 an inhibition of virus replication was shown. Also, in cell, we obtained results indicating that the use of a cytoskeletal destabilizing drug is affecting viral replication. These data indicate that Tropomyosin plays a key role in the virus cycle and therefore has the potential to be exploited as a therapeutic target in the development of antiviral drugs against HRSV.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano, do inglês human Respiratory Syncytial Virus (hRSV), é uma das maiores causas de doenças respiratórias agudas, principalmente em crianças e bebês entre seis meses e dois anos de idade. Não há drogas eficazes ou vacina aprovada até o momento para esse vírus, apesar das décadas de intensa pesquisa e grande quantidade de dados sobre ele acumulados. O genoma do hRSV codifica onze proteínas e a compreensão das interações entre essas proteínas virais e as proteínas do hospedeiro é essencial para que possíveis alvos terapêuticos contra o hRSV sejam identificados. No laboratório, anteriormente, foi dado enfoque às interações entre as proteínas celulares e as proteínas virais de matriz (M), nucleoproteína (N) e fosfoproteína (P). Neste trabalho, analisamos as interações da proteína viral M2-1 (cofator essencial para a transcrição) através da mesma estratégia utilizada naqueles experimentos, de fusão a FLAG (gerando FLAG-M2-1) e imunoprecipitação com anticorpos contra esse peptídeo. As proteínas co-imunoprecipitadas, identificadas por espectrometria de massas, foram: poly(A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), e Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 é capaz de integrar-se ao complexo chamado de semelhante a corpúsculos de inclusão (IB like, do inglês), formado por N e P, que é similar estruturalmente aos corpúsculos de inclusão encontrados em células infectadas (IBs). Essa propriedade foi usada para analisar que proteínas celulares seriam recrutadas para esse outro nível de organização dessas três proteínas virais, envolvidas na transcrição. O complexo FLAG-N/P/M2-1 co-imunoprecipitou as proteínas celulares: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 e 90), Npm (Nucleophosmin), que podemos agrupar como chaperonas; PABPC1, YBX1, YBX3, ligantes de RNA; e sub-unidade pICIn do metilossomo, associada a modificação pós-tradução. Detalhamos a análise para YBX3, obtendo evidências adicionais de sua interação com M2-1 em ensaios de complementação de proteína fragmentada (Split-NanoLuc), e de co-localização por imunofluorescência indireta. Finalmente, utilizamos a metodologia de expressão em bactérias para demonstrar a interação entre M2-1 e os domínios funcionais de PABPC1, porém esses ensaios não foram conclusivos. / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the leading causes of acute respiratory diseases, especially in children and infants between six months and two years of age. There is no effective drug or vaccine approved so far for this virus, despite decades of intensive research and large amount of data on it. The genome of hRSV encodes 11 proteins and the understanding of the interactions between these viral proteins and host proteins is essential to identify possible therapeutic targets against hRSV. In the lab, previously, was given focus to the interactions between cellular proteins and viral proteins matrix (M), nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P). In this paper, we analyze the viral M2-1 (cofactor essential for transcription) protein interactions through the same strategy used in those experiments: fusion with FLAG (generating FLAG-M2-1) and immunoprecipitation with antibodies against this peptide. The co-immunoprecipitated proteins, identified by mass spectrometry, were: Poly (A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), and Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 is able to integrate the complex called similar to inclusion bodies (IB like), formed by N and P, which is similar structurally to the inclusion bodies found in infected cells (IBs). This property has been used to analyze which cellular proteins would be recruited for this new level of organization of these three viral proteins involved in transcription. The cellular proteins co-immunoprecipitated with the complex FLAG-N/P/M2-1, were: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 and 90), Npm (Nucleophosmin), that we can group as chaperones; PABPC1, YBX1, YBX3, RNA ligands; and the methylosome sub-unit pICIn, post-translational modification-associated. We detailed the analysis for YBX3, obtaining additional evidence of its interaction with M2-1 in fragmented protein complementation tests (Split-NanoLuc), and co-localization by indirect immunofluorescence. Finally, we used the methodology of expression in bacteria to demonstrate the interaction between M2-1 and functional domains of PABPC1, but these tests were not conclusive.

O vírus respiratório sincicial humano (HRSV) é um dos agentes patogênicos respiratórios de grande importância clínica, tendo em vista que acomete 64 milhões de crianças por ano em todo o mundo. A resposta imune do hospedeiro e a variabilidade genética do HRSV podem interferir na produção de uma vacina eficaz, tal como a presença de quasispecies na população viral. O objetivo deste trabalho foi detectar quasispecies em amostras de HRSV e verificar se soros obtidos da criança na fase convalescente da doença e de sua respectiva mãe selecionam estes mutantes. Uma alteração não sinonímia foi detectada no gene F em um dos clones seqüenciados, enquanto duas alterações sinonímias e duas não sinonímias foram encontradas no gene G do HRSV, sendo as últimas no mesmo nucleotídeo. Um dos clones pré-selecionados com soro humano apresentou a mesma alteração não-sinonímia, encontrada na ausência de anticorpos no gene G. Os resultados sugerem que diferentes sequencias virais presentes em menor quantidade na população podem ser selecionadas pelo sistema imunológico do hospedeiro. / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is one of the most important clinical respiratory pathogens, since 64 millions children in the world are infected by this agent every year. Host immunity and viral genetic variability are important factors to a vaccine development, besides quasispecies presence in the viral population. In this work, HRSV quasispecies were detected in clinical samples in absence and presence of human polyclonal serum collected by children in the convalescent phase and mother serum. A non-synonymy variation was found in the F gene in antibodies absence. Four mutations were found at HRSV G2 in polyclonal serum absence. Two were synonymy and two were non-synonymy variation, the last in the same nucleotide. A non-synonymy mutation was found in the G2 region in presence of polyclonal serum collected from child convalescent phase. This alteration was the same of the observed in absence of polyclonal serum so it is possible that host antibodies can selected different viral minority sequences present in the population.

O vírus respiratório sincicial humano (HRSV) é o principal agente viral causador de doença respiratória em bebês e crianças em idade pré-escolar. A fim de estudar a variabilidade genética de HRSV, grupo B, com inserção de 60 nucleotídeos no gene G, selecionamos amostras de aspirado de nasofaringe de crianças menores de 5 anos de idade, com doença respiratória aguda, admitidas no hospital universitário da Universidade de São Paulo. Testamos 521 amostras, das quais 35,3% foram positivas para HRSV. A região G2 da glicoproteína G foi utilizada para genotipar essas amostras. Todas as amostras do grupo B apresentaram a inserção de 60 nucleotídeos no gene da proteína G, como descrito anteriormente em Buenos Aires, em 1999. As modificações de aminoácidos e nucleotídeos dessas amostras foram comparadas com outras amostras com inserção de 2001-2005. A seqüência de nucleotídeos duplicados foi a cópia exata dos 60 nucleotídeos precedentes em vírus mais antigos, mas as cópias do segmento duplicado acumularam substituições de nucleotídeos em vírus mais recentes. / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is the leading viral cause of respiratory illness in infants and young children. In order to study the genetic variability of HRSV group B, with 60-nucleotide duplication in the gene G, we selected nasopharyngeal aspirates samples of children less than five years of age, with acute respiratory illness admitted in the university hospital of São Paulo (USP). We tested 521 samples and the HRSV-detection test positivity rate was 35.3%. The G2 region of glycoprotein G was used as genotyping default. All type B HRSV had a 60-nucleotide duplication in the attachment protein gene like previously described in Buenos Aires, in 1999. Changes in aminoacids and nucleotides in these samples were compaired with other samples with duplication from 2001-2005. The duplicated nucleotide sequence was an exact copy of the preceding 60 nucleotides in early viruses, but copies of the duplicated segment accumulated nucleotide substituions in more recent viruses.