Processos celulares, incluindo crescimento celular, transporte de organelas, endocitose, exocitose e citocinese requerem um citoesqueleto intacto. A tropomiosina (Tpm1) é uma proteína dimérica de citoesqueleto altamente conservada, que forma polímeros que se associam aos filamentos de F-actina em células musculares e não musculares. Essa ligação estabiliza os filamentos de actina evitando a despolimerização por outros fatores. Assim, a tropomiosina desempenha um papel fundamental na integridade celular e também permite que processos como secreção, localização e função de muitas proteínas sejam exercidas, de acordo com a demanda celular exigida em diferentes situações. Em leveduras, Tpm1 participa da manutenção destes processos, assim como na integridade celular e morfologia da célula. Neste estudo, uma análise do gene que codifica para tropomiosina e a funcionalidade do produto codificado por ele foi realizada para a levedura Cryptococcus gattii. Foi realizada a construção de uma linhagem mutante de tropomiosina, que revelou que Tpm1 está envolvida na formação da cápsula polissacarídica, morfologia e virulência do fungo. Mutação no gene de Tpm1 leva a alterações no citoesqueleto celular, crescimento e morfologia, e, defeitos de citocinese. Estes resultados indicam um papel crucial para Tpm1 na formação de cápsula polissacarídica, morfologia e virulência de C. gattii. / Cellular processes including cell growth, organelle transport, endocytosis, exocytosis and cytokinesis require an intact cytoskeleton. Tropomyosin (Tpm1) is a dimeric protein of the highly conserved cytoskeleton forming polymers which are associated with the F-actin filaments in muscle and non-muscle cells. This binding stabilizes actin filaments preventing depolymerization by other factors. Thus, tropomyosin plays a key role in cellular integrity and also allows processes such as secretion, localization and function of many proteins to be performed according to the required cellular demand in different situations. In yeasts, Tpm1 participates in the integrity of these processes, cell integrity and cell morphology. Tropomyosin also plays an important role in the secretion, localization, and function of many proteins, in fungi. In this study we performed a construction of a Cryptococcus gattii tropomyosin mutant strain, which revealed that disruption of C. gattii tropomyosin gene leads to changes in cytoeskeleton, abnormal growth and morphology, defective cell separation, assembly of the polysaccharide capsule and virulence. Taken together, these results indicate a central role for Tpm1 in the assembly of the polysaccharide capsule, morphology and virulence of C. gattii.

Processos celulares, incluindo crescimento celular, transporte de organelas, endocitose, exocitose e citocinese requerem um citoesqueleto intacto. A tropomiosina (Tpm1) é uma proteína dimérica de citoesqueleto altamente conservada, que forma polímeros que se associam aos filamentos de F-actina em células musculares e não musculares. Essa ligação estabiliza os filamentos de actina evitando a despolimerização por outros fatores. Assim, a tropomiosina desempenha um papel fundamental na integridade celular e também permite que processos como secreção, localização e função de muitas proteínas sejam exercidas, de acordo com a demanda celular exigida em diferentes situações. Em leveduras, Tpm1 participa da manutenção destes processos, assim como na integridade celular e morfologia da célula. Neste estudo, uma análise do gene que codifica para tropomiosina e a funcionalidade do produto codificado por ele foi realizada para a levedura Cryptococcus gattii. Foi realizada a construção de uma linhagem mutante de tropomiosina, que revelou que Tpm1 está envolvida na formação da cápsula polissacarídica, morfologia e virulência do fungo. Mutação no gene de Tpm1 leva a alterações no citoesqueleto celular, crescimento e morfologia, e, defeitos de citocinese. Estes resultados indicam um papel crucial para Tpm1 na formação de cápsula polissacarídica, morfologia e virulência de C. gattii. / Cellular processes including cell growth, organelle transport, endocytosis, exocytosis and cytokinesis require an intact cytoskeleton. Tropomyosin (Tpm1) is a dimeric protein of the highly conserved cytoskeleton forming polymers which are associated with the F-actin filaments in muscle and non-muscle cells. This binding stabilizes actin filaments preventing depolymerization by other factors. Thus, tropomyosin plays a key role in cellular integrity and also allows processes such as secretion, localization and function of many proteins to be performed according to the required cellular demand in different situations. In yeasts, Tpm1 participates in the integrity of these processes, cell integrity and cell morphology. Tropomyosin also plays an important role in the secretion, localization, and function of many proteins, in fungi. In this study we performed a construction of a Cryptococcus gattii tropomyosin mutant strain, which revealed that disruption of C. gattii tropomyosin gene leads to changes in cytoeskeleton, abnormal growth and morphology, defective cell separation, assembly of the polysaccharide capsule and virulence. Taken together, these results indicate a central role for Tpm1 in the assembly of the polysaccharide capsule, morphology and virulence of C. gattii.

Processos celulares, incluindo crescimento celular, transporte de organelas, endocitose, exocitose e citocinese requerem um citoesqueleto intacto. A tropomiosina (Tpm1) é uma proteína dimérica de citoesqueleto altamente conservada, que forma polímeros que se associam aos filamentos de F-actina em células musculares e não musculares. Essa ligação estabiliza os filamentos de actina evitando a despolimerização por outros fatores. Assim, a tropomiosina desempenha um papel fundamental na integridade celular e também permite que processos como secreção, localização e função de muitas proteínas sejam exercidas, de acordo com a demanda celular exigida em diferentes situações. Em leveduras, Tpm1 participa da manutenção destes processos, assim como na integridade celular e morfologia da célula. Neste estudo, uma análise do gene que codifica para tropomiosina e a funcionalidade do produto codificado por ele foi realizada para a levedura Cryptococcus gattii. Foi realizada a construção de uma linhagem mutante de tropomiosina, que revelou que Tpm1 está envolvida na formação da cápsula polissacarídica, morfologia e virulência do fungo. Mutação no gene de Tpm1 leva a alterações no citoesqueleto celular, crescimento e morfologia, e, defeitos de citocinese. Estes resultados indicam um papel crucial para Tpm1 na formação de cápsula polissacarídica, morfologia e virulência de C. gattii. / Cellular processes including cell growth, organelle transport, endocytosis, exocytosis and cytokinesis require an intact cytoskeleton. Tropomyosin (Tpm1) is a dimeric protein of the highly conserved cytoskeleton forming polymers which are associated with the F-actin filaments in muscle and non-muscle cells. This binding stabilizes actin filaments preventing depolymerization by other factors. Thus, tropomyosin plays a key role in cellular integrity and also allows processes such as secretion, localization and function of many proteins to be performed according to the required cellular demand in different situations. In yeasts, Tpm1 participates in the integrity of these processes, cell integrity and cell morphology. Tropomyosin also plays an important role in the secretion, localization, and function of many proteins, in fungi. In this study we performed a construction of a Cryptococcus gattii tropomyosin mutant strain, which revealed that disruption of C. gattii tropomyosin gene leads to changes in cytoeskeleton, abnormal growth and morphology, defective cell separation, assembly of the polysaccharide capsule and virulence. Taken together, these results indicate a central role for Tpm1 in the assembly of the polysaccharide capsule, morphology and virulence of C. gattii.

Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar alterações na resposta clínica e imunológica ao camarão após a imunoterapia com Dermatophagoides pteronyssinus. Métodos: Selecionou-se 35 indivíduos alérgicos a Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), os quais foram submetidos a testes cutâneos de leitura imediata para ácaros, baratas, camarão, tropomiosina recombinante, além de cão, gato e fungos. A detecção de IgE espcífica in vitro foi feita para o ácaro, camarão, barata americana e para suas tropomiosinas. Em todos, avaliou-se reatividade clínica ao camarão através de provocação oral. Dez pacientes foram alocados para o grupo controle, e 25 foram submetidos à imunoterapia alérgeno específica para o ácaro. Os testes cutâneos e a dosagem de IgE sérica específica foram repetidas após a indução da imunoterapia, e após 1 ano do início. A reatividade clínica ao camarão foi reavaliada no final do estudo pela provocação oral. Resultados: No grupo dos pacientes que foram submetidos à imunoterapia, observamos diminuição na reatividade nos testes cutâneos e dosagem de IgE específica para Der p, camarão e tropomiosina recombinante. Dos 10 pacientes com testes cutâneos positivos para camarão, 4 foram negativos na dosagem após um ano de imunoterapia (p= 0,04). Quanto à dosagem sérica de IgE para camarão, dos 9 positivos no início, 6 ficaram negativos (p= 0,014). Nenhum paciente submetido a imunoterapia desenvolveu nova sensibilização para camarão. Não houve alteração na reatividade clínica ao camarão após imunoterapia. Conclusão: A imunoterapia para Dermatophagoides pteronyssinus foi acompanhada de diminuição da reatividade imunológica para camarão e clinicamente não houve alteração da sensibilidade a camarão / Objective: The objective of this study was to determine changes in clinical and immunological response to shrimp after immunotherapy with Dermatophagoides pteronyssinus. Methods: We studied 35 allergic subjects to Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), submitted to skin tests to mites, cockroach, shrimp, recombinant tropomyosin, and dog, cat and fungi. The detection of serum specific IgE was performed to mite, shrimp, and tropomyosin from American cockroach. In all patients, the clinical reactivity to shrimp was assessed through oral challenge. Ten patients were allocated to the control group, and 25 were submitted to immunotherapy for mite. Skin tests and determination of serum specific IgE were repeated after the induction of immunotherapy (3-4 months) and 1 year after of beginning of the treatment. The clinical reactivity to shrimp was assessed again at the end of the study by oral challenge. Results: In the group of patients who were undergoing immunotherapy, we observed decreased reactivity in the skin tests and specific IgE levels to Der p, shrimp and recombinant tropomyosin. Among the 10 patients with positive skin tests to shrimp, 4 were negative when assessed after one year of immunotherapy (p = 0.04). About serum specific IgE to shrimp, from the 9 positive reactors in the beginning of treatment, 6 became negative (p= 0.014). There was no change in clinical reactivity to shrimp after immunotherapy. Conclusion: The immunotherapy for Dermatophagoides pteronyssinus was accompanied by decreased immune reactivity to shrimp and clinically there was no change in sensitivity to shrimp

Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar alterações na resposta clínica e imunológica ao camarão após a imunoterapia com Dermatophagoides pteronyssinus. Métodos: Selecionou-se 35 indivíduos alérgicos a Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), os quais foram submetidos a testes cutâneos de leitura imediata para ácaros, baratas, camarão, tropomiosina recombinante, além de cão, gato e fungos. A detecção de IgE espcífica in vitro foi feita para o ácaro, camarão, barata americana e para suas tropomiosinas. Em todos, avaliou-se reatividade clínica ao camarão através de provocação oral. Dez pacientes foram alocados para o grupo controle, e 25 foram submetidos à imunoterapia alérgeno específica para o ácaro. Os testes cutâneos e a dosagem de IgE sérica específica foram repetidas após a indução da imunoterapia, e após 1 ano do início. A reatividade clínica ao camarão foi reavaliada no final do estudo pela provocação oral. Resultados: No grupo dos pacientes que foram submetidos à imunoterapia, observamos diminuição na reatividade nos testes cutâneos e dosagem de IgE específica para Der p, camarão e tropomiosina recombinante. Dos 10 pacientes com testes cutâneos positivos para camarão, 4 foram negativos na dosagem após um ano de imunoterapia (p= 0,04). Quanto à dosagem sérica de IgE para camarão, dos 9 positivos no início, 6 ficaram negativos (p= 0,014). Nenhum paciente submetido a imunoterapia desenvolveu nova sensibilização para camarão. Não houve alteração na reatividade clínica ao camarão após imunoterapia. Conclusão: A imunoterapia para Dermatophagoides pteronyssinus foi acompanhada de diminuição da reatividade imunológica para camarão e clinicamente não houve alteração da sensibilidade a camarão / Objective: The objective of this study was to determine changes in clinical and immunological response to shrimp after immunotherapy with Dermatophagoides pteronyssinus. Methods: We studied 35 allergic subjects to Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), submitted to skin tests to mites, cockroach, shrimp, recombinant tropomyosin, and dog, cat and fungi. The detection of serum specific IgE was performed to mite, shrimp, and tropomyosin from American cockroach. In all patients, the clinical reactivity to shrimp was assessed through oral challenge. Ten patients were allocated to the control group, and 25 were submitted to immunotherapy for mite. Skin tests and determination of serum specific IgE were repeated after the induction of immunotherapy (3-4 months) and 1 year after of beginning of the treatment. The clinical reactivity to shrimp was assessed again at the end of the study by oral challenge. Results: In the group of patients who were undergoing immunotherapy, we observed decreased reactivity in the skin tests and specific IgE levels to Der p, shrimp and recombinant tropomyosin. Among the 10 patients with positive skin tests to shrimp, 4 were negative when assessed after one year of immunotherapy (p = 0.04). About serum specific IgE to shrimp, from the 9 positive reactors in the beginning of treatment, 6 became negative (p= 0.014). There was no change in clinical reactivity to shrimp after immunotherapy. Conclusion: The immunotherapy for Dermatophagoides pteronyssinus was accompanied by decreased immune reactivity to shrimp and clinically there was no change in sensitivity to shrimp

O Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) causa doença respiratória principalmente em recém-nascidos e bebês. A infecção por HRSV exerce forte interferência sobre a localização de actina, fenômeno que propomos estar relacionado à interação de TPM com M e P, levando ao rearranjo dos microtúbulos. Os objetivos gerais do projeto são de analisar interações in vitro, em bactéria e em célula entre TPM com M e P. Os dados obtidos indicam que ocorre a interação in vitro entre M e TPM 3 mas não ocorre entre P e TPM 3. Os estudos realizados em célula indicam a interação de M e P com TPM 3. Com siRNA para TPM 3 os dados não foram conclusivos e para a super expressão de TPM 3 verificamos que ocorre inibição da replicação viral. Testamos uma droga que desacopla TPM 3 dos filamentos de actina e os resultados indicam inibição da replicação viral. Concluímos com esses dados que TPM 3 tem papel fundamental no ciclo replicativo do vírus e que sua interação com M tem potencial para ser explorada como alvo terapêutico no desenvolvimento de antivirais contra HRSV. / Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) causes respiratory disease in newborns and babies. The HRSV infection exerts strong interference on intracellular location of actin, a phenomenon that we propose to be connected to the interaction of TPM with M and P, leading to the rearrangement of microtubules. In this project we propose to analyze interactions in vitro, in bacteria and in cells between TPM and P or M. The obtained data indicate that an in vitro interaction between M and TPM occurs but does not occur between P and TPM. Cell studies indicate an interaction of M and P with TPM. With siRNA fot TPM 3 the data were not conclusive, and for overexpression of TPM 3 an inhibition of virus replication was shown. Also, in cell, we obtained results indicating that the use of a cytoskeletal destabilizing drug is affecting viral replication. These data indicate that Tropomyosin plays a key role in the virus cycle and therefore has the potential to be exploited as a therapeutic target in the development of antiviral drugs against HRSV.

Tropomiosina (Tm) é uma das proteínas que compõe o filamento fino (actina, Tm, Troponina) do sistema muscular esquelético e desempenha um importante papel na regulação da contração muscular. Tm é um coiled-coil de 284 resíduos que forma longos homopolímeros lineares através da sobreposição de onze resíduos entre os terminais de Tms adjacentes (Interação cabeça-cauda) em condições de baixa força iônica. A presença de vários resíduos carregados (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) nas extremidades da Tm sugere que contatos intermoleculares eletrostáticos entre estes aminoácidos podem ter um importante papel na estabilidade dos polímeros. Entretanto, a estrutura do complexo cabeça-cauda demonstra que a maioria dos contatos intermoleculares na interface é de natureza hidrofóbica. A fim de analisarmos a contribuição dos grupos carregados para a estabilidade do complexo cabeça-cauda, construímos fragmentos recombinantes correspondentes à metade amino (ASTm1-142 ) e carboxi (Tm143-284(5OHW269)) terminais da proteína contendo mutações pontuais daqueles resíduos para alanina, e adicionalmente H276 para Glu. Medimos a afinidade entre todas as possíveis combinações destes fragmentos na ausência e presença de íons Mg2+, visto que este cátion está sempre presente em condições fisiológicas e é importante para estabilizar a interação entre Tm e actina. Os efeitos das mutações foram analisados por simulações de docking, desnaturações térmicas e ciclos de duplos mutantes. Os resultados demonstram que os aminoácidos K5, K7 e D280 presentes na interface formam contatos intermoleculares essenciais para a estabilidade do complexo. Enquanto, D2, K6, D275 e H276 não participam na formação de contatos intermoleculares, no entanto, contribuem para a estabilidade da interação cabeça- cauda através de suas interações intramoleculares que atuam na estabilidade das hélices individuais. Os aumentos na estabilidade da metade C-terminal da Tm (Tm143-284(5OHW)) induzidos por Mg2+ foram dependentes das mutações neste trecho da proteína sugerindo a presença de um sítio de ligação para este íon na extremidade carboxi terminal da molécula no trecho que forma a interação cabeça- cauda. Construímos um fragmento menor do C-terminal (Tm259-284(W269)) para acompanharmos mudanças no deslocamento químico induzidas pela ligação do íon usando ressonância magnética nuclear. Os resultados obtidos comprovaram nossa hipótese e nos permitiram definir pela primeira vez que a estrutura da Tm tem um ou mais sítios de ligação Mg2+ em uma região próxima ao resíduo H276 que está localizado entre vários resíduos carregados negativamente que participam da interação cabeça-cauda. Por último, estudamos os efeitos de solventes cosmótropicos (TFE e glicerol) nas estabilidades dos fragmentos da Tm, uma vez que a instabilidade (flexibilidade) da extremidade C-terminal é importante para a formação do complexo cabeça-cauda. Observamos que TFE, porém não glicerol, reduziu a afinidade entre os terminais. Ambos os co-solventes induziram aumentos na estabilidade dos fragmentos, no entanto, apenas TFE induziu um aumento no conteúdo de α-hélice e causou uma redução significativa na cooperatividade de desenovelamento das proteínas. Estes resultados indicam que estes compostos orgânicos estabilizam as estruturas dos fragmentos individuais da Tm de maneiras diferentes e que estas diferenças podem estar relacionadas aos diferentes efeitos observados na formação da interação cabeça-cauda. / Tropomyosin (Tm) is a protein component of the skeletal muscle thin filament (actin, Tm, Troponin) which has an important role in the regulation of muscle contraction. Tm is a dimeric coiled-coil (284 aminoacids) which forms long linear homopolymers through the overlap of eleven residues of adjacent Tm termini (Head- to-tail interaction) in low ionic strength conditions. The presence of several charged amino acids (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) in Tm extremities suggests that electrostatic contacts among those residues may have an important role in the stability of the polymers. Nevertheless, the solution structure of the head-to-tail complex demonstrated that most of the contacts in the interface are hydrophobic. In order to study the contribution of these charged residues to the stability of the head- to-tail complex, we built recombinant fragments corresponding to the amino (ASTm1-142) and carboxy (Tm143-284(5OHW269)) termini containing single mutations of those amino acids to alanine, and additionally a substitution of H276 for Glu. We measured the binding affinities among all possible combinations of wild-type and mutant fragments in the absence or presence of Mg2+ ions. This cation is always physiologically present in the muscle and it is known to strengthen the binding of Tm to actin. The effects of the mutations were analyzed by protein-protein docking, thermodynamic cycles and thermal denaturations. The results show that residues K5, K7 and D280 are essential to the stability of the complex. Though D2, K6, D275 and H276 are exposed to the solvent and do not participate in intermolecular contacts in the NMR structure, they may contribute to the complex stability by modulating the stability of the helices at the Tm termini. Mg2+-induced increases in stability of the C- terminal were sensitive to mutations in residues located in the head-to-tail overlap region, suggesting that Mg2+ ions may bind specifically to the carboxy extremity of the protein. We produced a small peptide (Tm259-284(W269)) to follow amide chemical shift perturbations upon Mg2+ binding by nuclear magnetic resonance measurements. The results obtained with this peptide allowed us to define for the first time that the Tm structure has one or more Mg2+ binding sites in a region centered in the vicinity of H276 in which are located several negatively charged residues that participate in the head-to-tail interaction. We also studied the effects of kosmotropic co-solvents (TFE and glycerol) in the stability of Tm fragments, as the instability (flexibility) of the C- terminal region has been pointed as important for the formation of the head-to-tail complex. We observed that TFE, but not glycerol, reduces the affinity between the termini. Both TFE and glycerol increased the stability of the isolated N- and C- terminal fragments; however, only TFE caused an increase in the helical content and a significant reduction in the cooperativity of unfolding of the proteins. Our results show that these two co-solvents stabilize the structures of individual Tm fragments in different manners and that these differences may be related to their different effects on head-to-tail complex formation.

Tropomiosina (Tm) é uma das proteínas que compõe o filamento fino (actina, Tm, Troponina) do sistema muscular esquelético e desempenha um importante papel na regulação da contração muscular. Tm é um coiled-coil de 284 resíduos que forma longos homopolímeros lineares através da sobreposição de onze resíduos entre os terminais de Tms adjacentes (Interação cabeça-cauda) em condições de baixa força iônica. A presença de vários resíduos carregados (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) nas extremidades da Tm sugere que contatos intermoleculares eletrostáticos entre estes aminoácidos podem ter um importante papel na estabilidade dos polímeros. Entretanto, a estrutura do complexo cabeça-cauda demonstra que a maioria dos contatos intermoleculares na interface é de natureza hidrofóbica. A fim de analisarmos a contribuição dos grupos carregados para a estabilidade do complexo cabeça-cauda, construímos fragmentos recombinantes correspondentes à metade amino (ASTm1-142 ) e carboxi (Tm143-284(5OHW269)) terminais da proteína contendo mutações pontuais daqueles resíduos para alanina, e adicionalmente H276 para Glu. Medimos a afinidade entre todas as possíveis combinações destes fragmentos na ausência e presença de íons Mg2+, visto que este cátion está sempre presente em condições fisiológicas e é importante para estabilizar a interação entre Tm e actina. Os efeitos das mutações foram analisados por simulações de docking, desnaturações térmicas e ciclos de duplos mutantes. Os resultados demonstram que os aminoácidos K5, K7 e D280 presentes na interface formam contatos intermoleculares essenciais para a estabilidade do complexo. Enquanto, D2, K6, D275 e H276 não participam na formação de contatos intermoleculares, no entanto, contribuem para a estabilidade da interação cabeça- cauda através de suas interações intramoleculares que atuam na estabilidade das hélices individuais. Os aumentos na estabilidade da metade C-terminal da Tm (Tm143-284(5OHW)) induzidos por Mg2+ foram dependentes das mutações neste trecho da proteína sugerindo a presença de um sítio de ligação para este íon na extremidade carboxi terminal da molécula no trecho que forma a interação cabeça- cauda. Construímos um fragmento menor do C-terminal (Tm259-284(W269)) para acompanharmos mudanças no deslocamento químico induzidas pela ligação do íon usando ressonância magnética nuclear. Os resultados obtidos comprovaram nossa hipótese e nos permitiram definir pela primeira vez que a estrutura da Tm tem um ou mais sítios de ligação Mg2+ em uma região próxima ao resíduo H276 que está localizado entre vários resíduos carregados negativamente que participam da interação cabeça-cauda. Por último, estudamos os efeitos de solventes cosmótropicos (TFE e glicerol) nas estabilidades dos fragmentos da Tm, uma vez que a instabilidade (flexibilidade) da extremidade C-terminal é importante para a formação do complexo cabeça-cauda. Observamos que TFE, porém não glicerol, reduziu a afinidade entre os terminais. Ambos os co-solventes induziram aumentos na estabilidade dos fragmentos, no entanto, apenas TFE induziu um aumento no conteúdo de α-hélice e causou uma redução significativa na cooperatividade de desenovelamento das proteínas. Estes resultados indicam que estes compostos orgânicos estabilizam as estruturas dos fragmentos individuais da Tm de maneiras diferentes e que estas diferenças podem estar relacionadas aos diferentes efeitos observados na formação da interação cabeça-cauda. / Tropomyosin (Tm) is a protein component of the skeletal muscle thin filament (actin, Tm, Troponin) which has an important role in the regulation of muscle contraction. Tm is a dimeric coiled-coil (284 aminoacids) which forms long linear homopolymers through the overlap of eleven residues of adjacent Tm termini (Head- to-tail interaction) in low ionic strength conditions. The presence of several charged amino acids (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) in Tm extremities suggests that electrostatic contacts among those residues may have an important role in the stability of the polymers. Nevertheless, the solution structure of the head-to-tail complex demonstrated that most of the contacts in the interface are hydrophobic. In order to study the contribution of these charged residues to the stability of the head- to-tail complex, we built recombinant fragments corresponding to the amino (ASTm1-142) and carboxy (Tm143-284(5OHW269)) termini containing single mutations of those amino acids to alanine, and additionally a substitution of H276 for Glu. We measured the binding affinities among all possible combinations of wild-type and mutant fragments in the absence or presence of Mg2+ ions. This cation is always physiologically present in the muscle and it is known to strengthen the binding of Tm to actin. The effects of the mutations were analyzed by protein-protein docking, thermodynamic cycles and thermal denaturations. The results show that residues K5, K7 and D280 are essential to the stability of the complex. Though D2, K6, D275 and H276 are exposed to the solvent and do not participate in intermolecular contacts in the NMR structure, they may contribute to the complex stability by modulating the stability of the helices at the Tm termini. Mg2+-induced increases in stability of the C- terminal were sensitive to mutations in residues located in the head-to-tail overlap region, suggesting that Mg2+ ions may bind specifically to the carboxy extremity of the protein. We produced a small peptide (Tm259-284(W269)) to follow amide chemical shift perturbations upon Mg2+ binding by nuclear magnetic resonance measurements. The results obtained with this peptide allowed us to define for the first time that the Tm structure has one or more Mg2+ binding sites in a region centered in the vicinity of H276 in which are located several negatively charged residues that participate in the head-to-tail interaction. We also studied the effects of kosmotropic co-solvents (TFE and glycerol) in the stability of Tm fragments, as the instability (flexibility) of the C- terminal region has been pointed as important for the formation of the head-to-tail complex. We observed that TFE, but not glycerol, reduces the affinity between the termini. Both TFE and glycerol increased the stability of the isolated N- and C- terminal fragments; however, only TFE caused an increase in the helical content and a significant reduction in the cooperativity of unfolding of the proteins. Our results show that these two co-solvents stabilize the structures of individual Tm fragments in different manners and that these differences may be related to their different effects on head-to-tail complex formation.

A prevalência de doenças alérgicas incluindo asma e dermatite atópica aumentou nos últimos anos. A asma é uma doença crônica caracterizada por hiper-responsividade das vias aéreas e limitação variável ao fluxo aéreo, reversível espontaneamente ou com tratamento. A elevada prevalência, mortalidade e custos associados tornam a doença um importante problema de saúde pública que requer atenção. A dermatite atópica (DA) é uma doença inflamatória crônica da pele, caracterizada por prurido intenso, eritema, escoriações, liquenificação na pele entre outras características. A DA causa profundo impacto na vida do indivíduo e da família e geralmente mostra os primeiros sintomas durante a infância. Ambas as doenças podem ser associadas a sensibilização a alérgenos. Nosso grupo mostrou que entre pacientes com rinite e/ou asma alérgicos a barata a tropomiosina da barata Periplaneta americana é um alérgeno principal. Em invertebrados, a tropomiosina induz resposta IgE e reatividade cruzada entre invertebrados incluindo ácaros, barata, camarão e parasitas. No presente estudo, produzimos tropomiosina recombinante de barata (alérgeno Per a 7) com elevado grau de pureza e com quantidades mínimas de endotoxina. Em modelo experimental de asma em camundongos, com sensibilização e desencadeamento com Per a 7 recombinante, houve aumento do número de células totais, e de eosinófilos, neutrófilos e linfócitos no lavado broncoalveolar. Alérgeno Per a 7 recombinante foi também utilizado em ELISA quimérico para investigar a resposta IgE a este alérgeno em 112 pacientes com dermatite atópica. A idade dos pacientes variou de 3 a 67 anos com média de 24,9 (± 15,4) anos, com 75 indivíduos do sexo feminino (67%). Nos 112 pacientes, o SCORAD apresentou média de 43,1 (± 18,1) e foram relatadas asma e rinite em 42 e 85 indivíduos, respectivamente. Níveis de IgE total apresentaram ampla variação, de 14,2 a 63.000 UI/mL, com média geométrica de 2.193 UI/mL. A idade de início dos sintomas e o tempo de doença apresentaram médias, respectivamente, de 9,5 (± 12,9) e 15,4 (± 12,3) anos. Trinta pacientes (26,8%) apresentaram níveis detectáveis de IgE para Per a 7 recombinante, com variação de 2,3 a 3.191 UI/mL. A razão de IgE específica para Per a7/IgE total nestes pacientes variou de 0,03% a 33,8%. Dividindo os pacientes em sensibilizados e não sensibilizados ao alérgeno de barata, observamos que não houve diferença significante entre os grupos com relação à idade de início dos sintomas, tempo de doença, SCORAD, presença de rinite ou asma e níveis de IgE total. Nossos resultados mostraram que o alérgeno Per a 7 recombinante induziu resposta inflamatória com caraterísticas semelhante à observada em humanos, em modelo experimental de asma em camundongos. Frequência menor de reatividade IgE ao alérgeno Per a 7 foi observada entre pacientes com dermatite atópica em nosso meio, quando comparada à observada previamente em pacientes com asma e/ou rinite. Não houve associação entre a presença de sensibilização IgE ao alérgeno Per a 7 e a gravidade da dermatite atópica, presença de asma ou rinite, idade de início e tempo de doença, e níveis de IgE total. Entretanto, a investigação do perfil de sensibilização IgE tem importância ao se considerar o uso de imunoterapia alérgenoespecífica em pacientes com dermatite atópica. / The prevalence of allergic diseases has increased in recent years, including asthma and atopic dermatitis. Asthma is a chronic disease resulting from airway hyperresponsiveness and variable airflow limitation, reversible spontaneously or with treatment. The high prevalence, mortality, and associated costs make the disease an important public health problem which requires attention. Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease, as asthma has high prevalence, and it is characterized by intense itching, erythema, excoriations, lichenification in the skin among other characteristics. The AD causes profound impact on individual and family´s life and usually shows the first symptoms during childhood. Both diseases could be related and associated with sensitization to allergens. In the case of asthma, allergy to cockroach is well known to be related with the disease. In 1999, a Brazilian study in our group has shown that among patients with allergic rhinitis and /or asthma the tropomyosin of the American cockroach Periplaneta americana (Per a 7) is a major allergen. This protein is present in vertebrates and invertebrates, and was related to induction of IgE response and cross-reactivity against among invertebrates, including mites, cockroaches, shrimp and parasites. In the present study, we produced recombinant tropomyosin from cockroach (Per a 7 allergen) with high purity and minimal amounts of endotoxin. In an experimental model of asthma in mice, with sensitization and triggering with recombinant Per a 7, there was an increase in the number of total cells, and eosinophils, neutrophils and lymphocytes in the bronchoalveolar lavage. Per a 7 allergen was also used in chimeric ELISA to investigate IgE response to this allergen in 112 patients with atopic dermatitis. Patients\' ages ranged from 3 to 67 years, mean of 24.9 (± 15.4) years, 75 female subjects (67%). In the 112 patients, a mean of SCORAD presented 43.1 (± 18.1) and asthma and rhinitis were reported in 42 and 85 individuals, respectively. Total IgE levels varied from 14.2 to 63.000 IU / mL, with a geometric mean of 2,193 IU / mL. The age at onset of symptoms and disease time presented averages, respectively, of 9.5 (± 12.9) and 15.4 (± 12.3) years. Thirty patients (26.8%) had detectable IgE recombinant Per a 7 levels, ranging from 2.3 to 3191 IU / mL. The ratio of IgA specific for Per a7 / total IgE in these patients ranged from 0.03% to 33.8%. Dividing the patients into sensitized and not sensitized to the cockroach allergen, we observed that there was no significant difference between the groups regarding the age of onset of symptoms, disease time, SCORAD, presence of rhinitis or asthma, and total IgE levels. Our results showed that recombinant Per a 7 allergen induced an inflammatory response with characteristics similar to that observed in humans in an experimental model of asthma in mice. Minor frequency reactivity of IgE Per a 7 allergen was observed among patients with atopic dermatitis in our group, when compared to that previously observed in patients with asthma and / or rhinitis. There was no association between the presence of IgE sensitization to the Per 7 allergen and the severity of atopic dermatitis, presence of asthma or rhinitis, age at onset and disease time, and total IgE levels. However, the investigation of the IgE sensitization profile is important when considering the use of allergen-specific immunotherapy in patients with atopic dermatitis

INTRODUÇÃO: A alergia a camarão é causa comum e potencialmente grave de alergia alimentar IgE mediada, incluindo anafilaxia. Ao contrário de outras alergias alimentares, a alergia a camarão afeta predominantemente adultos e geralmente é vitalícia. Até o momento, não existe terapia específica para a alergia a camarão. Os pacientes necessitam excluir o crustáceo de sua dieta e portar adrenalina auto-injetável, para uso em reações por exposição acidental. A complexidade do perfil alergênico do camarão tem sido cada vez mais reconhecida nos últimos dez anos. A proteína muscular tropomiosina foi o primeiro alérgeno do camarão identificado e é considerada o seu principal alérgeno. Alguns estudos indicam que a tropomiosina apresenta alta especificidade na alergia a camarão, sendo apontada como uma possível e importante ferramenta diagnóstica. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo da tropomiosina em pacientes brasileiros em restrição alimentar por suspeita de alergia a camarão. MÉTODOS: Selecionou-se 32 indivíduos com suspeita de alergia a camarão, os quais foram submetidos a testes cutâneos de leitura imediata para camarão (extrato) e \"in natura\" (cru e cozido), ácaros e barata. Também foram realizadas dosagens séricas de IgE específica para camarão, tropomiosina de camarão, ácaros e barata americana. Avaliou-se reatividade clínica a camarão através de testes de provocação oral. O camarão utilizado nos testes cutâneos e nos testes de provocação oral foi o Xiphopenaeus kroyeri (sete barbas). Foi realizado Western Blot 1 D dos pacientes alérgicos. Foram realizados cálculos de valor de corte para teste cutâneo de leitura imediata e IgE sérica específica através da utilização da curva ROC. RESULTADOS: Alergia a camarão foi confirmada em 17 pacientes. A IgE sérica específica para tropomiosina de camarão neste estudo apresentou sensibilidade de 58,8%, especificidade de 60%, valor preditivo positivo de 62,5% e valor preditivo negativo 56%. Em comparação com a IgE especifica para camarão e os testes cutâneos para camarão com extrato e \"in natura\", a IgE específica para tropomiosina apresentou a menor sensibilidade e menor valor preditivo positivo. Em sete pacientes alérgicos, a tropomiosina não foi detectada, apontando a importância de outros alérgenos do camarão, avaliados no Western blot. Os testes cutâneos apresentaram diferença estatística significativa entre alérgicos e não alérgicos e foi possível definir um ponto de corte, útil na distinção entre ambos. Os resultados dos valores de corte do teste cutâneo (média) para extrato comercial foram 5,75 mm, para camarão cru 6,75 mm e para camarão cozido 5,00 mm. Todos os pacientes são atópicos. CONCLUSÃO: A IgE específica para tropomiosina neste estudo não apresentou superioridade diagnóstica quando comparada aos testes cutâneos com camarão \"in natura\" e extrato, e a IgE específica para o camarão. Outros alérgenos, além da tropomiosina, devem ser considerados na avaliação diagnóstica para a alergia a camarão / INTRODUCTION: Shrimp allergy is a common and potentially serious cause of food allergy-mediated IgE, including anaphylaxis. Unlike other food allergies, shrimp allergy affects predominantly adults and is usually lifelong. To date, there is no specific therapy for shrimp allergy. Patients need to exclude the crustacean from their diet and carry selfinjectable adrenaline to be used if the reaction begins after accidental exposure. The complexity of the allergenic profile of shrimp has been increasingly recognized in the last ten years. The tropomyosin muscle protein was the first identified shrimp allergen and is considered its main allergen. Some studies indicate that tropomyosin presents high specificity in shrimp allergy, being pointed out as a possible and important diagnostic tool. OBJECTIVE: The objective of this study was to evaluate sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of tropomyosin in Brazilian patients under food restriction due to the suspicion of allergy to shrimp. METHODS: Thirty-two individuals with suspected allergy to shrimp were selected, who underwent immediate skin tests for shrimp (extract) and \"in natura\" (raw and cooked), mites and cockroaches. Serum dosages of IgE specific for shrimp, shrimp tropomyosin, mites and American cockroach were also performed. Clinical reactivity to shrimp was assessed by oral challenge tests. Shrimp used in skin tests and oral challenge tests was Xiphopenaeus kroyeri (seabob). Western Blot 1 D of the allergic patients was performed. Cut-off calculations were performed for immediate-reading skin test and specific serum IgE using the ROC curve. RESULTS: Shrimp allergy was confirmed in 17 patients. Serum IgE specific for shrimp tropomyosin in this study showed sensitivity of 58.8%, specificity of 60%, positive predictive value of 62.5% and negative predictive value of 56%. Compared to shrimp-specific IgE and cutaneous shrimp skin tests with extract and \"in natura\", tropomyosin was not detected, indicating the importance of other shrimp allergens evaluated in the Western blot. The skin tests presented a statistically significant difference between allergic and non-allergic and it was possible to define a cutoff point, useful in distinguishing between both. The results of the cutoff values of the skin test (average) for commercial extract were 5.75 mm, for raw shrimp 6.75 mm and for cooked shrimp 5.00 mm. All patients are atopic. CONCLUSION: The tropomyosin-specific IgE in this study did not present diagnostic superiority when compared to cutaneous tests with in natura shrimp and extract, and shrimp specific IgE. Other allergens, in addition to tropomyosin, should be considered in the diagnostic evaluation for shrimp allergy