Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar alterações na resposta clínica e imunológica ao camarão após a imunoterapia com Dermatophagoides pteronyssinus. Métodos: Selecionou-se 35 indivíduos alérgicos a Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), os quais foram submetidos a testes cutâneos de leitura imediata para ácaros, baratas, camarão, tropomiosina recombinante, além de cão, gato e fungos. A detecção de IgE espcífica in vitro foi feita para o ácaro, camarão, barata americana e para suas tropomiosinas. Em todos, avaliou-se reatividade clínica ao camarão através de provocação oral. Dez pacientes foram alocados para o grupo controle, e 25 foram submetidos à imunoterapia alérgeno específica para o ácaro. Os testes cutâneos e a dosagem de IgE sérica específica foram repetidas após a indução da imunoterapia, e após 1 ano do início. A reatividade clínica ao camarão foi reavaliada no final do estudo pela provocação oral. Resultados: No grupo dos pacientes que foram submetidos à imunoterapia, observamos diminuição na reatividade nos testes cutâneos e dosagem de IgE específica para Der p, camarão e tropomiosina recombinante. Dos 10 pacientes com testes cutâneos positivos para camarão, 4 foram negativos na dosagem após um ano de imunoterapia (p= 0,04). Quanto à dosagem sérica de IgE para camarão, dos 9 positivos no início, 6 ficaram negativos (p= 0,014). Nenhum paciente submetido a imunoterapia desenvolveu nova sensibilização para camarão. Não houve alteração na reatividade clínica ao camarão após imunoterapia. Conclusão: A imunoterapia para Dermatophagoides pteronyssinus foi acompanhada de diminuição da reatividade imunológica para camarão e clinicamente não houve alteração da sensibilidade a camarão / Objective: The objective of this study was to determine changes in clinical and immunological response to shrimp after immunotherapy with Dermatophagoides pteronyssinus. Methods: We studied 35 allergic subjects to Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), submitted to skin tests to mites, cockroach, shrimp, recombinant tropomyosin, and dog, cat and fungi. The detection of serum specific IgE was performed to mite, shrimp, and tropomyosin from American cockroach. In all patients, the clinical reactivity to shrimp was assessed through oral challenge. Ten patients were allocated to the control group, and 25 were submitted to immunotherapy for mite. Skin tests and determination of serum specific IgE were repeated after the induction of immunotherapy (3-4 months) and 1 year after of beginning of the treatment. The clinical reactivity to shrimp was assessed again at the end of the study by oral challenge. Results: In the group of patients who were undergoing immunotherapy, we observed decreased reactivity in the skin tests and specific IgE levels to Der p, shrimp and recombinant tropomyosin. Among the 10 patients with positive skin tests to shrimp, 4 were negative when assessed after one year of immunotherapy (p = 0.04). About serum specific IgE to shrimp, from the 9 positive reactors in the beginning of treatment, 6 became negative (p= 0.014). There was no change in clinical reactivity to shrimp after immunotherapy. Conclusion: The immunotherapy for Dermatophagoides pteronyssinus was accompanied by decreased immune reactivity to shrimp and clinically there was no change in sensitivity to shrimp

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:21:25Z No. of bitstreams: 1 TES_BIANCA_BARBIERI_COGNATO_COMPLETO.pdf: 2150300 bytes, checksum: 6c0ebf29cb36a3ae7a825cf9c0060dc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T17:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_BIANCA_BARBIERI_COGNATO_COMPLETO.pdf: 2150300 bytes, checksum: 6c0ebf29cb36a3ae7a825cf9c0060dc4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-21 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Two nematode species belonging to the Metastrongyloidea superfamily are capable to produce disease in humans: Angiostrongylus cantonensis and Angiostrongylus costaricensis. Both are rodent parasites and human infection is considered accidental. Eosinophilic meningoencephalitis, caused by A. cantonensis, raises concern due to the expanding number of cases and geographical area of occurrence. Molecular and immunological methods for the diagnosis are crucial, however, after many studies with different antigenic molecules, has a specific and sensitive test to discriminate the angiostrongyliasis to others parasitoses is lacking. Cross-reactivity with other helminthes, which may cause similar symptoms, and eosinophilic meningitis, has been a problem for the satisfactory performance of specificity in serological tests. In order to improve the diagnosis of angiostrongyliasis, a comparative analysis of protein recognition from different extracts from A. cantonensis, Toxocara canis, Schistosoma mansoni and Strongyloides stercoralis against positive serum for Angiostrongylus.spp was performed. Through extraction kit, one-dimensional and two-dimensional electrophoresis, western blot and mass spectrometry, 149 proteins were identified. Among these, 34 were exclusive to A. cantonensis, COI being present only in the A. cantonensis extract, having no similarities with any other parasite compared in NCBI (nr database) and WormBase Database. Additionally, nine proteins were recognized by more than one parasite and extract, being important cross reactivity markers in parasitic infections. With the data obtained in this study, we suggest the use of the follow proteins as cross-reactivity markers: Galectin 1, HSPA-5 and Ifa1. In addition, immunogenic proteins of A. cantonensis ES-7, Lec-5 and 14-3-3, were recombinant expressed in two cell types, CHO and HEK. Their potential diagnostic values were verified by uni and bidimensional electrophoresis, western and dot blot, and N-glycosidase F (PNGase F) treatment using serum from patients infected with A. cantonensis, negative serum for parasites, and positive for other parasites. ES7 protein expressed in HEK and CHO cells and Lec-5 expressed in CHO were recognized only by Angiostrongylus-positive serum and not by negative control and specificity control in 2D and 1D tests, respectively. In the 2D analyzes Lec-5 showed a weak recognition with negative serum. However, the 14-3-3 protein didn?t show any specificity against A. cantonensis serum, since it was recognized by all tested sera. Antigen-antibody recognition was found to be dependent on the glycogenic portions, since when treated with N-glycosidase F (PNGase F), recognition between proteins and serum disappeared. The heterologous expression, using mammalian cells, as well as the identification of shared and/or specific molecules, may represent a promising source of antigens for the diagnosis of eosinophilic meningoencephalitis, and molecular diagnostic tests become necessary. / Duas esp?cies de nemat?deos pertencentes a superfam?lia Metastrongyloidea, s?o capazes de produzir doen?a em humanos: Angiostrongylus cantonensis e Angiostrongylus costaricensis. Ambos s?o parasitas pr?prios de roedores e a infec??o humana ? considerada acidental. A meningite eosinof?lica, causada por A. cantonensis, tem gerado preocupa??o na comunidade cient?fica pela expans?o da ?rea geogr?fica de ocorr?ncia. M?todos moleculares e imunol?gicos para o diagn?stico desta infec??o s?o cruciais para o diagn?stico, entretanto, ap?s muitos estudos com diferentes mol?culas antig?nicas, at? hoje n?o foi desenvolvido um teste de diagn?stico que seja espec?fico e sens?vel o suficiente para discriminar as angiostrongil?ases de outras parasitoses. A reatividade cruzada tem sido o principal problema encontrado nos estudos j? desenvolvidos para este prop?sito. Com o objetivo de aprimorar o diagn?stico das angiostrongil?ases, foi realizado neste estudo an?lise comparativa do reconhecimento de prote?nas de diferentes extratos teciduais de A. cantonensis, Toxocara canis, Schistosoma mansoni e Strongyloides stercoralis contra soro positivo para Angiostrongylus spp Atrav?s de kit de extra??o, eletroforese unidimensional e bidimensional, western blot e espectrometria de massas foram identificadas 149 prote?nas. Dentre estas, 34 foram exclusivas para A. cantonensis, sendo que COI estava presente apenas no extrato de A. cantonensis n?o possuindo similaridades com nenhum outro parasito comparado no NCBI (nr database) e WormBase Database. Estas prote?nas podem ser consideradas promissoras como marcadores de reatividade humoral espec?fica para o parasito. Todavia, outras nove prote?nas foram reconhecidas por mais de um parasito em mais de um extrato testado, sendo importantes marcadores de reatividade cruzada em infec??es parasit?rias. Com os dados obtidos neste estudo, sugerimos como marcadores de reatividade cruzada o uso das prote?nas: Galectin 1, HSPA-5 e Ifa1. Al?m disso, prote?nas imunog?nicas de A. cantonensis ES-7, Lec-5 e 14-3-3, foram expressas de forma recombinante em dois tipos celulares, CHO e HEK, e o potencial uso diagn?stico destas prote?nas foi verificado atrav?s de eletroforese uni e bidimensional, western e dot blot, e tratamento por N-glycosidase F (PNGase F), utilizando soro positivo para Angiostrongylus spp., soro negativo e positivo para outras parasitoses. Prote?na ES-7 expressa em c?lulas HEK e CHO, e Lec-5 expressa em CHO foram reconhecidas apenas pelo soro positivo para Angiostrongylus spp. e n?o pelo soro negativo e controles de especificidade em testes 2D e 1D, respectivamente. J? nas an?lises em 2D, Lec-5 apresentou fraco reconhecimento com soro negativo. J? a prote?na 14-3-3 n?o apresentou nenhuma especificidade pelo soro de A. cantonensis, j? que foi reconhecida por todos os soros testados. O reconhecimento ant?geno-anticorpo se mostrou dependente das por??es glic?dicas, j? que quando tratadas com N-glycosidase F (PNGase F), o reconhecimento das prote?nas pelo soro desapareceu. A express?o heter?loga, utilizando c?lulas de mam?feros, assim como a identifica??o de mol?culas compartilhadas e/ou espec?ficas, podem representar uma promissora fonte de ant?genos para o diagn?stico da meningite eosinof?lica, requerendo aprimorados testes moleculares para seu diagn?stico.

Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar alterações na resposta clínica e imunológica ao camarão após a imunoterapia com Dermatophagoides pteronyssinus. Métodos: Selecionou-se 35 indivíduos alérgicos a Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), os quais foram submetidos a testes cutâneos de leitura imediata para ácaros, baratas, camarão, tropomiosina recombinante, além de cão, gato e fungos. A detecção de IgE espcífica in vitro foi feita para o ácaro, camarão, barata americana e para suas tropomiosinas. Em todos, avaliou-se reatividade clínica ao camarão através de provocação oral. Dez pacientes foram alocados para o grupo controle, e 25 foram submetidos à imunoterapia alérgeno específica para o ácaro. Os testes cutâneos e a dosagem de IgE sérica específica foram repetidas após a indução da imunoterapia, e após 1 ano do início. A reatividade clínica ao camarão foi reavaliada no final do estudo pela provocação oral. Resultados: No grupo dos pacientes que foram submetidos à imunoterapia, observamos diminuição na reatividade nos testes cutâneos e dosagem de IgE específica para Der p, camarão e tropomiosina recombinante. Dos 10 pacientes com testes cutâneos positivos para camarão, 4 foram negativos na dosagem após um ano de imunoterapia (p= 0,04). Quanto à dosagem sérica de IgE para camarão, dos 9 positivos no início, 6 ficaram negativos (p= 0,014). Nenhum paciente submetido a imunoterapia desenvolveu nova sensibilização para camarão. Não houve alteração na reatividade clínica ao camarão após imunoterapia. Conclusão: A imunoterapia para Dermatophagoides pteronyssinus foi acompanhada de diminuição da reatividade imunológica para camarão e clinicamente não houve alteração da sensibilidade a camarão / Objective: The objective of this study was to determine changes in clinical and immunological response to shrimp after immunotherapy with Dermatophagoides pteronyssinus. Methods: We studied 35 allergic subjects to Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), submitted to skin tests to mites, cockroach, shrimp, recombinant tropomyosin, and dog, cat and fungi. The detection of serum specific IgE was performed to mite, shrimp, and tropomyosin from American cockroach. In all patients, the clinical reactivity to shrimp was assessed through oral challenge. Ten patients were allocated to the control group, and 25 were submitted to immunotherapy for mite. Skin tests and determination of serum specific IgE were repeated after the induction of immunotherapy (3-4 months) and 1 year after of beginning of the treatment. The clinical reactivity to shrimp was assessed again at the end of the study by oral challenge. Results: In the group of patients who were undergoing immunotherapy, we observed decreased reactivity in the skin tests and specific IgE levels to Der p, shrimp and recombinant tropomyosin. Among the 10 patients with positive skin tests to shrimp, 4 were negative when assessed after one year of immunotherapy (p = 0.04). About serum specific IgE to shrimp, from the 9 positive reactors in the beginning of treatment, 6 became negative (p= 0.014). There was no change in clinical reactivity to shrimp after immunotherapy. Conclusion: The immunotherapy for Dermatophagoides pteronyssinus was accompanied by decreased immune reactivity to shrimp and clinically there was no change in sensitivity to shrimp

Submitted by Emanoel Martins Filho (emanoelfilho@ufba.br) on 2016-09-13T01:29:53Z No. of bitstreams: 1 Carlos_Jose.pdf: 1542832 bytes, checksum: 5aa9be2cd715ccd9ddd9ede563b3fe9e (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2016-09-13T20:32:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Carlos_Jose.pdf: 1542832 bytes, checksum: 5aa9be2cd715ccd9ddd9ede563b3fe9e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T20:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos_Jose.pdf: 1542832 bytes, checksum: 5aa9be2cd715ccd9ddd9ede563b3fe9e (MD5) / CONS NAC DE DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO - Programa TWAS/CNPq / Diversos são os parasitos intestinais capazes de acometer cães e gatos, e destacam-se aqueles capazes de causar impacto na saúde pública por tratar-se de zoonoses. Dentre eles, o Toxocara canis e o Toxocara cati, agentes causadores das toxocaríases canina e felina respectivamente que são responsáveis pelas síndromes larva migrans visceral e ocular do homem. Os animais domésticos integram o ciclo evolutivo como hospedeiros definitivos criando focos de transmissão em ambientes comuns ao lazer humano. As infecções podem produzir uma gama de sinais clínicos que variam desde um quadro subclínico até a morte do animal. O propósito do presente estudo foi desenvolver um método de ensaio imunoenzimático de ELISA indireto com especificidade ótima para o diagnóstico de toxocaríase em cães, determinada pela absorção de imunoglobulinas que reagem cruzadamente com antígenos associados a outras parasitoses. Foram selecionados 140 cães em condições de risco de infecção para determinação da soroprevalência de toxocaríase através do ensaio imunoenzimático indireto (ELISA). Os resultados do ELISA foram comparados à frequência parasitária obtida por exames coprológicos pela técnica de Willes-Molay e Sedimentação espontânea. Para realização do ELISA indireto, padronizou-se o teste com antígeno excretório-secretório de T. canis, produzido a partir de larvas dos parasitos. Durante o desenvolvimento do método ELISA, foi incluída uma etapa em que amostras de soro foram absorvidas em antígenos de Ascaris lumbricoides, Trichuris sp., Ancylostoma caninum e Dipylidium caninum para minimizar a reatividade cruzada e aumentar a especificidade do teste. A análise parasitológica evidenciou 70,7% de amostras fecais positivas, distribuídas como infecções individuais por Trichuris sp em 28,57%, Ancilostomídeos em 9,29%, T. canis em 1,43%, Cystoisospora em 0,7%, além de infecções mistas. As condições ideais para realização da sorologia foram padronizadas, absorvendo as amostras com 4 mg/ml de antígeno somático dos demais parasitos, sensibilização com 3 µg/mL de Antígeno excretório/secretório de T. canis, diluições dos soros e anticorpo secundário em 1:1000 e 1:2000 respectivamente. A soroprevalência foi determinada em 61,4% (86/140), utilizando o ponto de corte de 0,275. A sensibilidade do teste ELISA foi determinada em 100% e a especificidade em 94,44%. Evidenciou-se, portanto, uma baixa positividade do exame parasitológico contrapondo-se à alta soropositividade de detecção de animais com toxocaríase. Assim, o ELISA desenvolvido no presente estudo contribui para atender ao necessário desenvolvimento de novos testes diagnósticos específicos, capazes de diagnosticar principalmente os animais em estágios subclínicos, devido ao impacto que podem acarretar à saúde pública. Concluímos que os exames sorológicos devem ser empregados para complementar o diagnóstico parasitário canino e principalmente auxiliar na elaboração de medidas profiláticas. / There are several intestinal parasites able to affect dogs and cats, and stand out from those capable of causing public health impact because it is of zoonoses. Among them, T. canis and T. cati, causative agents of canine and feline toxocariases respectively, are responsible for the larva migrans syndromes visceral and ocular of humans. Domestic animals are part of the life cycle as definitive hosts becoming transmission focuses for the common human leisure environments. Infections can produce a range of clinical signs ranging from subclinical conditions to the death of the animal. The purpose of this study was to develop an ELISA immunoenzymatic assay method with good specificity for the diagnosis of toxocariasis in dogs, determined by the absorption of immunoglobulins which cross-react with antigens associated with other parasites. One hundred and forty dogs were selected in places with infection risk conditions to determine the seroprevalence of toxocariasis by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The ELISA results were compared to parasitic frequency obtained by stool tests by Willes-Molay technique and spontaneous sedimentation. To perform the ELISA, standardization was performed by using excretory-secretory products of T. canis larvae as antigen. During the development of the ELISA, a step was included, in which serum samples were adsorbed with somatic antigens of Ascaris lumbricoides, Trichuris sp., Dipylidium caninum, Ancylostoma caninum to minimize cross-reactivity and increase the specificity of the test. The parasitological analysis resulted in 70.7% positive fecal samples, distributed as individual infections by Trichuris sp in 28.57%, Hookworms in 9.29%, T. canis in 1.43%, Cystoisospora 0.7%, and mixed infections (30, 7%). The optimum ELISA conditions were standardized as absorbing samples with 4 mg / mL of somatic antigen of other parasites; sensitizing wells with 3 µg/mL of Ag-E/S Toxocara and diluting sera and secondary antibody at 1: 1,000 and 1: 2,000 respectively. The seroprevalence was determined in 61.4% (86/140), using a cutoff value of 0.275. The sensitivity of the ELISA was of 100% and specificity of 94.44%. The different results between ELISA and parasitological tests obtained in the present study reflects the need for development of new specific tests able to diagnose mainly animals at subclinical stages due to the impact that may lead to public health. Therefore, the ELISA test that was developed in this work contributes as an useful method to complement the diagnosis of canine worm infections, so that to primarily assist in developing preventive measures.

Neste trabalho foi avaliado o potencial antigênico das vesículas de membrana externa, OMV, de N. meningitidis, das OMV e componetes protéicos selecionados de N. lactamica. Para tal foram realizados cultivos de ambas as espécies em biorreatores, ensaios de imunização em camundongos, análises de espectrometria de massas, e análises de tamanho das partículas, polidispersabilidade e potencial zeta. As análises da cinética de cultivos levaram a dados inéditos possibilitando uma nova discussão sobre o metabolismo e sobre a produtividade de OMV destas bactérias. N. lactamica obteve valores 5 vezes maiores de concentração máxima de OMV de 152 mg/L e 2,5 vezes maiores de produtividade de OMV de 0,32 g/L.h comparado aos obtidos para N. meningitidis nas mesmas condições de cultivo. OMV obtidas nos cultivos de ambas e componentes proteicos de N. lactamica foram utilizadas para imunizar camundongos com 3 doses subcutâneas. Ensaios de imunoblote e ELISA demonstraram que soros gerados contra as proteínas isoladas de N. lactamica foram reativos com proteínas de N. meningitidis, assim como o soro anti-OMV de N. lactamica que reagiu com 6 proteínas de N. meningitidis, as proteínas de membrana App, Omp85, PilQ, PorA, PorB, e ComL ou Opa/Opc. Análises de espectrometria de massas identificaram 229 proteínas na OMV de N. lactamica, sendo 77 proteínas de membrana e 243 proteínas de N. meningitidis, sendo 54 proteínas de membrana. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem a possibilidade do uso das OMV de Neisseria lactamica como abordagem alternativa para o desenvolvimento de vacinas contra a doença meningocócica. / In these studies we evaluated the antigenic potential of outer membrane vesicles (OMV) from N. meningitidis, OMV from N. lactamica and proteic components from N. lactamica. Outer membrane vesicles were obtained from cultures of both species in bioreactors. Immunization tests were conducted in mice. Western-blotting and ELISA techniques were used to evaluate the cross-reactivity of murine sera against outer-membrane proteins from Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica. Analysis of mass spectrometry and determination of particle size, polydispersity and zeta potential were also performed. Analysis of bacterial growth kinetics led to new data enabling a discussion about metabolism and OMV productivity. When both species were cultured in the same medium OMV concentration of N. lactamica (152 mg/L) is 5 times higher than that in N. meningitidis and OMV productivity of N. lactamica (0.32 g/L.h) is 2.5 times higher. Mice were vaccinated subcutaneously with 3 doses of OMV from both species and proteins from N. lactamica. These vaccines induced antibodies against N. meningitidis proteins. By mass spectrometry it was possible to identify these membrane proteins as App, Omp85, PilQ, PorA, PorB, and ComL or Opa/Opc. Mass spectrometry analyses also identified 229 proteins in N. lactamica OMV, with 77 predicted as membrane proteins and 243 in N. meningitidis OMV with 54 predicted as membrane proteins. Ours results suggested that OMV from Neisseria lactamica provides protection against N. meningitidis and could be used as an alternative approach for the development of a vaccine against meningococcal disease.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JetheNOF_DISSERT.pdf: 2279868 bytes, checksum: 4d99a8a04626302078cb68e1b2a75887 (MD5) Previous issue date: 2013-02-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Leishmania infantum and Trypanosoma cruzi are trypanosomatids of medical importance and are, respectively, the etiologic agents of visceral leishmaniasis (VL) and Chagas disease (CD) in Brazil. People infected with L. infantum or T. cruzi may develop asymptomatically, enabling the transmission of pathogens through blood transfusion and / or organs. The assessment of the infection by T. cruzi is included among the tests performed for screening blood donors in Brazil, however, there is no availability of tests for Leishmania. Serological tests for T. cruzi are very sensitive, but not specific, and may have cross-reactions with other microorganisms. Thus, the aim of this study was to determine the prevalence of Leishmania infection in blood donors and assess whether the serological test for T. cruzi detect L. infantum. Among the 300 blood samples from donors, discarded in 2011, 61 were T. cruzi positive, 203 were from donors with other infections and 36 were from handbags with low blood volume, but without infection. We also assessed 144 samples from donors without infections and able to donate blood, totaling 444 subjects. DNA was extracted from blood samples of all to perform quantitative PCR (qPCR) to detect Leishmania DNA. The buffy coat obtained from all samples was grown in Schneider medium supplemented and NNN. All samples were evaluated for the presence of anti-Leishmania antibody. The serological results indicate a percentage of 22% of Leishmania infection in blood samples obtained from discarded bags. A total of 60% of samples positive in ELISA for T. cruzi were negative by IFI, used as confirmatory test, ie 60% false positive for Chagas. Among these samples false positive for Chagas, 72% were positive by ELISA for Leishmania characterizing the occurrence of cross reaction between serologic assays. Of the 300 cultures performed, 18 grew parasites that were typed by qPCR and specific isoenzymes, found the species Leishmania infantum crops. Among the 18 cultures, 4 were purged from scholarships for low volume and all negative serology blood bank, thus demonstrating that there is a real risk of Leishmania transmission via transfusion. It is concluded that in an area endemic for leishmaniasis in Brazil, serological diagnosis performed to detect infection by T. cruzi among blood donors can identify infection by L. infantum and although cause false positive for Chagas, this cross-reactivity reduces the risk of Leishmania infection via blood transfusion, since tests are not applied specific detection of the parasite. In this way, there remains the need to discuss the implementation of a specific serological screening test for Leishmania in endemic countries such as Brazil / Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi s?o tripanossomat?deos de import?ncia m?dica e s?o, respectivamente, os agentes etiol?gicos da leishmaniose visceral (LV) e da doen?a de Chagas (DC) no Brasil. Pessoas infectadas por L. infantum ou por T. cruzi podem evoluir de forma assintom?tica, possibilitando a transmiss?o destes pat?genos atrav?s de transfus?o sangu?nea e/ou ?rg?os. A avalia??o da infec??o por T. cruzi est? contemplada entre os exames realizados para triagem de doadores no Brasil, no entanto, n?o h? disponibilidade de exames para Leishmania. Os testes sorol?gicos para T. cruzi s?o muito sens?veis, mas n?o espec?ficos, podendo apresentar rea??es cruzadas com outros microorganismos. Desta forma, o objetivo desse estudo foi determinar a preval?ncia da infec??o por Leishmania em doadores de sangue e avaliar se os teste sorol?gicos para T. cruzi detectam L. infantum. Dentre as 300 amostras de sangue de doadores, descartadas em 2011, 61 eram T. cruzi positivas, 203 eram de doadores com outras infec??es e 36 eram oriundas de bolsas com baixo volume de sangue, mas sem infec??o. Foram tamb?m avaliadas 144 amostras de doadores sem infec??es e aptos a doarem sangue, totalizando 444 volunt?rios. DNA foi extra?do do sangue de todas as amostras para realizar PCR quantitativa (qPCR) a fim de detectar DNA de Leishmania. O creme leucocit?rio obtido de todas as amostras foi cultivado em meio Schneider e NNN suplementado. Todas as amostras foram avaliadas quanto a presen?a de anticorpo anti-Leishmania. Os resultados sorol?gicos apontam um percentual de 22% de infec??o por Leishmania nas amostras de sangue obtidas das bolsas descartadas. Um total de 60% das amostras positivas no ELISA para T. cruzi foram negativas na RIFI, teste usado como confirmat?rio, ou seja, 60% falso positivos para Chagas. Dentre essas amostras falso positivas para Chagas, 72% foram positivas no ELISA para Leishmania caracterizando a ocorr?ncia de rea??o cruzada entre os ensaios sorol?gicos. Do total de 300 culturas realizadas, 18 cresceram parasitas que foram tipados por isoenzimas e qPCR espec?fica, sendo encontrada a esp?cie Leishmania infantum nas culturas. Dentre as 18 culturas, 4 foram provenientes de bolsas expurgadas por baixo volume e negativas em todas as sorologias do banco de sangue, demonstrando assim que h? um risco real de transmiss?o de Leishmania por via transfusional. Conclui-se que em ?rea end?mica para leishmanioses no Brasil, diagn?sticos sorol?gicos realizados para detectar infec??o por T. cruzi em doadores de sangue podem identificar a infec??o por L. infantum e, apesar de ocasionar resultados falso positivos para Chagas, essa reatividade cruzada reduz o risco de infec??o por Leishmania via transfus?o sangu?nea, visto que n?o s?o aplicados testes espec?ficos detec??o desse parasita. Desde modo, persiste a necessidade de se discutir a implementa??o de um teste de triagem sorol?gica espec?fico para Leishmania em pa?ses end?micos como o Brasil

Neste trabalho foi avaliado o potencial antigênico das vesículas de membrana externa, OMV, de N. meningitidis, das OMV e componetes protéicos selecionados de N. lactamica. Para tal foram realizados cultivos de ambas as espécies em biorreatores, ensaios de imunização em camundongos, análises de espectrometria de massas, e análises de tamanho das partículas, polidispersabilidade e potencial zeta. As análises da cinética de cultivos levaram a dados inéditos possibilitando uma nova discussão sobre o metabolismo e sobre a produtividade de OMV destas bactérias. N. lactamica obteve valores 5 vezes maiores de concentração máxima de OMV de 152 mg/L e 2,5 vezes maiores de produtividade de OMV de 0,32 g/L.h comparado aos obtidos para N. meningitidis nas mesmas condições de cultivo. OMV obtidas nos cultivos de ambas e componentes proteicos de N. lactamica foram utilizadas para imunizar camundongos com 3 doses subcutâneas. Ensaios de imunoblote e ELISA demonstraram que soros gerados contra as proteínas isoladas de N. lactamica foram reativos com proteínas de N. meningitidis, assim como o soro anti-OMV de N. lactamica que reagiu com 6 proteínas de N. meningitidis, as proteínas de membrana App, Omp85, PilQ, PorA, PorB, e ComL ou Opa/Opc. Análises de espectrometria de massas identificaram 229 proteínas na OMV de N. lactamica, sendo 77 proteínas de membrana e 243 proteínas de N. meningitidis, sendo 54 proteínas de membrana. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem a possibilidade do uso das OMV de Neisseria lactamica como abordagem alternativa para o desenvolvimento de vacinas contra a doença meningocócica. / In these studies we evaluated the antigenic potential of outer membrane vesicles (OMV) from N. meningitidis, OMV from N. lactamica and proteic components from N. lactamica. Outer membrane vesicles were obtained from cultures of both species in bioreactors. Immunization tests were conducted in mice. Western-blotting and ELISA techniques were used to evaluate the cross-reactivity of murine sera against outer-membrane proteins from Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica. Analysis of mass spectrometry and determination of particle size, polydispersity and zeta potential were also performed. Analysis of bacterial growth kinetics led to new data enabling a discussion about metabolism and OMV productivity. When both species were cultured in the same medium OMV concentration of N. lactamica (152 mg/L) is 5 times higher than that in N. meningitidis and OMV productivity of N. lactamica (0.32 g/L.h) is 2.5 times higher. Mice were vaccinated subcutaneously with 3 doses of OMV from both species and proteins from N. lactamica. These vaccines induced antibodies against N. meningitidis proteins. By mass spectrometry it was possible to identify these membrane proteins as App, Omp85, PilQ, PorA, PorB, and ComL or Opa/Opc. Mass spectrometry analyses also identified 229 proteins in N. lactamica OMV, with 77 predicted as membrane proteins and 243 in N. meningitidis OMV with 54 predicted as membrane proteins. Ours results suggested that OMV from Neisseria lactamica provides protection against N. meningitidis and could be used as an alternative approach for the development of a vaccine against meningococcal disease.

Parasitas da família trypanosomatidae como dos generos Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas e Rhynchoidomona infectam insetos e Phytomonas parasitam plantas. O T. cruzi e L. (L.) chagasi, agentes etiológicos respectivamente da doença de Chagas e da leishmaniose visceral (LV) também fazem parte desta família. Pela similaridade entre estes parasitos alguns estudos tem utilizado os tripanosomatídeos não patogênicos como fonte alternativa de antígenos para o imunodiagnóstico da doença de Chagas e da leishmaniose. Com o objetivo de identificar moléculas em tripanosomatídeos não patogênicos que reagem com anticorpos anti T. cruzi e anti- Leishmania sp, foram utilizados dois preparados antigênicos: a fração excretada-secretada (ES) e o extrato total obtido por digestão química (ET) de L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata e C. luciliae, sempre comparados com o T. cruzi e a L. (L.) chagasi. A reatividade diferencial entre anticorpos anti T. cruzi e anti L. (L.) chagasi levou à escolha da L. seymouri, único parasito no qual a fração ES mostrou significativas diferenças de reatividade, a C. deanei apresentou dados semelhantes. Anticorpos presentes em casos de LV reagem, por ELISA, tanto com ES como com ET de L. seymouri, no entanto casos de leishmaniose tegumentar e a maioria dos chagásicos não apresentaram reação com a fração ES deste parasito, apesar de reagirem com o antígeno ET. O ELISA mostrou que os anticorpos anti L. (L.) chagasi reagem mais com proteínas contidas no ES e menos com carboidrato, ao contrário a baixa reatividade dos anticorpos anti T. cruzi para o ES são preferencialmente contra carboidratos. Quando as frações de ES e ET foram analisados por Immunobloting o anti- L. (L.) chagasi não reagiu com nenhuma banda por esta metodologia, ao contrário anticorpos anti- T. cruzi apresentaram intensa reação com bandas na região de 29-36kDa do ET de L. seymouri, que foram identificadas como sendo moléculas de proteínas e de carboidratos (66-97kDa) para o ES. A utilização de soros policlonais monoespecíficos mostra que ES e ET possuem epítopos compartilhados e a quantificação deste compartilhando foi calculado utilizando anticorpos monoespecíficos eluídos de ES ou ET. Estes resultados mostraram que a identificação de moléculas reativas de L. seymouri por anticorpos presentes em chagásicos e leishmanióticos sp depende da metodologia empregada versus preparado antigênico. A superioridade das moléculas contidas no parasito de L. seymouri foi adicionalmente evidenciada quando 25,5% das amostras de soros de VL que apresentavam baixa reatividade para o ET de L. chagasi, Abs 492nm menores que 0.99 e média e SD de 0,56 ? 0,18 apresentavam alta reatividade para o ET de L. seymouri (p<0,01) com média e SD de 1,51 ? 0,35. Estes dados nos indicam que uma caracterização mais profunda das moléculas presentes na L. seymouri é de vital importância se for empregada no imunodiagnóstico das doenças de Chagas e leishmaniose. / Parasites of Trypanosomatidae family as Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas and Rhynchoidomonas infect insects and Phytomonas parasitize plants. T. cruzi and L. (L.) chagasi the etiological agents of Chagas disease and Leishmaniasis (VL) respectively, belong to this family. The similarity between these parasites led few studies to use non-pathogenic trypanosomatids as an alternative source of antigens for Chagas\' disease and leishmaniasis immunodiagnosis. With the aim of identifying molecules in nonpathogenic trypanosomatids that react with anti T. cruzi and anti-Leishmania antibodies, two antigenic preparations were employed: the excreted-secreted molecules (ES) and total extract obtained by chemical digestion (ET) of L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata and C. luciliae, and compared with T. cruzi and a L. (L.) chagasi. ES fraction of L. seymouri was the unique that showed differences in reactivity when tested with anti T. cruzi and anti L. (L.) chagasi antibodies, evaluation with C. deanei showed similar data. ELISA performed with L. seymouri ES and ET antigens reacted with all VL cases, however tegumentar leishmaniasis and Chagas disease cases showed no reaction with the ES fraction, although they react with ET antigen. The ELISA revealed that anti L. (L.) chagasi antibodies react with proteins contained in ES and less with carbohydrate, unlike the low reactivity of anti T. cruzi with ES were mainly against carbohydrates. When ES and ET were analyzed by immunoblotting the anti L. (L.) chagasi antibodies did not react with any bands, unlike antibodies to T. cruzi showed intense reaction with 29-36kDa protein bands of L. seymouri ET and carbohydrate bands ES (66-97kDa). The use of monospecific polyclonal sera showed that ES and ET share epitopes and these data was calculated using monospecific antibodies eluted from ES or ET antigens. These results show that the identification of L. seymouri molecules reactive by chagasic and leishmaniotic sp cases depends on the methodology employed versus antigenic preparation. The superiority of L. seymouri reactivity was further evidenced when 25.5% of VL sera that showed low reactivity to L. chagasi ET (Abs 492nm < 0.99 and smaller than average and SD of 0.56 +/- 0.18) showed high reactivity to ET L. seymouri (p <0.01) with mean and SD of 1.51 +/- 0.35. These data indicate that a more thorough characterization of molecules present in L. seymouri is of vital importance if used in Chagas disease and leishmaniasis immunodiagnosis.

Parasitas da família trypanosomatidae como dos generos Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas e Rhynchoidomona infectam insetos e Phytomonas parasitam plantas. O T. cruzi e L. (L.) chagasi, agentes etiológicos respectivamente da doença de Chagas e da leishmaniose visceral (LV) também fazem parte desta família. Pela similaridade entre estes parasitos alguns estudos tem utilizado os tripanosomatídeos não patogênicos como fonte alternativa de antígenos para o imunodiagnóstico da doença de Chagas e da leishmaniose. Com o objetivo de identificar moléculas em tripanosomatídeos não patogênicos que reagem com anticorpos anti T. cruzi e anti- Leishmania sp, foram utilizados dois preparados antigênicos: a fração excretada-secretada (ES) e o extrato total obtido por digestão química (ET) de L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata e C. luciliae, sempre comparados com o T. cruzi e a L. (L.) chagasi. A reatividade diferencial entre anticorpos anti T. cruzi e anti L. (L.) chagasi levou à escolha da L. seymouri, único parasito no qual a fração ES mostrou significativas diferenças de reatividade, a C. deanei apresentou dados semelhantes. Anticorpos presentes em casos de LV reagem, por ELISA, tanto com ES como com ET de L. seymouri, no entanto casos de leishmaniose tegumentar e a maioria dos chagásicos não apresentaram reação com a fração ES deste parasito, apesar de reagirem com o antígeno ET. O ELISA mostrou que os anticorpos anti L. (L.) chagasi reagem mais com proteínas contidas no ES e menos com carboidrato, ao contrário a baixa reatividade dos anticorpos anti T. cruzi para o ES são preferencialmente contra carboidratos. Quando as frações de ES e ET foram analisados por Immunobloting o anti- L. (L.) chagasi não reagiu com nenhuma banda por esta metodologia, ao contrário anticorpos anti- T. cruzi apresentaram intensa reação com bandas na região de 29-36kDa do ET de L. seymouri, que foram identificadas como sendo moléculas de proteínas e de carboidratos (66-97kDa) para o ES. A utilização de soros policlonais monoespecíficos mostra que ES e ET possuem epítopos compartilhados e a quantificação deste compartilhando foi calculado utilizando anticorpos monoespecíficos eluídos de ES ou ET. Estes resultados mostraram que a identificação de moléculas reativas de L. seymouri por anticorpos presentes em chagásicos e leishmanióticos sp depende da metodologia empregada versus preparado antigênico. A superioridade das moléculas contidas no parasito de L. seymouri foi adicionalmente evidenciada quando 25,5% das amostras de soros de VL que apresentavam baixa reatividade para o ET de L. chagasi, Abs 492nm menores que 0.99 e média e SD de 0,56 ? 0,18 apresentavam alta reatividade para o ET de L. seymouri (p<0,01) com média e SD de 1,51 ? 0,35. Estes dados nos indicam que uma caracterização mais profunda das moléculas presentes na L. seymouri é de vital importância se for empregada no imunodiagnóstico das doenças de Chagas e leishmaniose. / Parasites of Trypanosomatidae family as Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas and Rhynchoidomonas infect insects and Phytomonas parasitize plants. T. cruzi and L. (L.) chagasi the etiological agents of Chagas disease and Leishmaniasis (VL) respectively, belong to this family. The similarity between these parasites led few studies to use non-pathogenic trypanosomatids as an alternative source of antigens for Chagas\' disease and leishmaniasis immunodiagnosis. With the aim of identifying molecules in nonpathogenic trypanosomatids that react with anti T. cruzi and anti-Leishmania antibodies, two antigenic preparations were employed: the excreted-secreted molecules (ES) and total extract obtained by chemical digestion (ET) of L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata and C. luciliae, and compared with T. cruzi and a L. (L.) chagasi. ES fraction of L. seymouri was the unique that showed differences in reactivity when tested with anti T. cruzi and anti L. (L.) chagasi antibodies, evaluation with C. deanei showed similar data. ELISA performed with L. seymouri ES and ET antigens reacted with all VL cases, however tegumentar leishmaniasis and Chagas disease cases showed no reaction with the ES fraction, although they react with ET antigen. The ELISA revealed that anti L. (L.) chagasi antibodies react with proteins contained in ES and less with carbohydrate, unlike the low reactivity of anti T. cruzi with ES were mainly against carbohydrates. When ES and ET were analyzed by immunoblotting the anti L. (L.) chagasi antibodies did not react with any bands, unlike antibodies to T. cruzi showed intense reaction with 29-36kDa protein bands of L. seymouri ET and carbohydrate bands ES (66-97kDa). The use of monospecific polyclonal sera showed that ES and ET share epitopes and these data was calculated using monospecific antibodies eluted from ES or ET antigens. These results show that the identification of L. seymouri molecules reactive by chagasic and leishmaniotic sp cases depends on the methodology employed versus antigenic preparation. The superiority of L. seymouri reactivity was further evidenced when 25.5% of VL sera that showed low reactivity to L. chagasi ET (Abs 492nm < 0.99 and smaller than average and SD of 0.56 +/- 0.18) showed high reactivity to ET L. seymouri (p <0.01) with mean and SD of 1.51 +/- 0.35. These data indicate that a more thorough characterization of molecules present in L. seymouri is of vital importance if used in Chagas disease and leishmaniasis immunodiagnosis.

Infectious bovine keratoconjunctivitis (IBK) is the main ocular disease of cattle. Highly contagious, it is responsible for significant economic losses of livestock worldwide. Moraxella bovis is recognized as the primary agent of the disease in cattle. However, the occurrence of other similar species, including M. ovis and M. bovoculi, recently described, have been common in outbreaks of the disease and are suspected to be causally related to the limited success of preventive measures, especially the use of bacterins containing only strains of M. bovis. This dissertation describes the antigenic characterization of M. bovis, M. bovoculi and M. ovis strains and a commercial vaccine by cross-reactivity using flow cytometry analysis and identification of immunodominant conserved antigens by Western blotting. Antisera against strains of the three species were obtained from immunization of New Zealand rabbits and challenged before a panel of strains isolated from cattle and sheep clinically affected by the disease between 1983 and 2013 as well as reference strains of each species. Field strains of M. bovoculi (Mbv2 and Mbv3) recognized satisfactorily all heterologous strains. However, Mbv3 (M. bovoculi), Mov2 (M. ovis) and Mov3 (M. ovis) strains stood out as the most intense recognition strains of their respective species and suggest that species-specific antigens play an important role in the host immune response. The association of reactivity percentage with the antigenic profiles, evidenced by Western blotting analysis, indicates that the immune response induced by Moraxella spp. appears to be mediated by multiple surface antigens of which many are shared between the three species. Among 32 different proteins identified, 22 (68.7%) were recognized by at least one antiserum in the protein extracts of all strains analyzed by Western blotting. Our study suggests (1) the selection and combination of M. bovis, M. bovoculi and M. ovis strains to be used in the composition of antigenic unit vaccines as IBK control strategy and (2) the use of flow cytometry as the most appropriate methodology for this selection. / Ceratoconjuntivite infecciosa bovina (CIB) é a principal doença ocular de bovinos. Altamente contagiosa, é responsável por significativas perdas econômicas para a pecuária no mundo inteiro. Moraxella bovis é, reconhecidamente, o agente primário da enfermidade em bovinos. Contudo, a ocorrência de outras espécies do gênero, incluindo M. ovis e M. bovoculi, recentemente descrita, têm sido comuns em surtos da doença e são suspeitas de serem causalmente associadas ao sucesso limitado de medidas preventivas, sobretudo do uso de bacterinas contendo apenas cepas de M. bovis. Esta dissertação descreve a caracterização antigênica de cepas de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis e de uma vacina comercial através da análise de reatividade cruzada por citometria de fluxo e da identificação de antígenos imunodominantes e conservados através de Western blotting. Antissoros contra cepas das três espécies foram obtidos a partir da imunização de coelhos Nova Zelândia e desafiados frente a um painel de cepas isoladas de bovinos e ovinos clinicamente acometidos pela doença entre 1983 e 2013 assim como cepas de referência de cada espécie. Cepas de campo de M. bovoculi (Mbv2 e Mbv3) reconheceram satisfatoriamente todas as cepas heterólogas. Contudo, as cepas Mbv3 (M. bovoculi), Mov2 (M. ovis) e Mov3 (M. ovis) destacaram-se pela maior intensidade de reconhecimento de cepas de suas respectivas espécies e sugerem que antígenos espécie-específicos desempenham importante papel na resposta imune do hospedeiro. A associação dos percentuais de reatividade aos perfis antigênicos evidenciados através da análise por western blotting indica que a resposta imune induzida por Moraxella spp. parece ser mediada por múltiplos antígenos de superfície dos quais, diversos são compartilhados entre as três espécies. Entre 32 diferentes proteínas detectadas, 22 (68,7%) foram reconhecidas por pelo menos um antissoro nos extratos protéicos de todas as cepas analisadas por western blotting. Nosso estudo sugere a seleção e combinação de cepas de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis circulantes para composição da unidade antigênica de vacinas como estratégia de controle de IBK e a utilização de citometria de fluxo como metodologia mais adequada para esta seleção.