Orientadora: Karina Alves de Toledo / Banca: Valéria Marta Gomes do Nascimento / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: No mundo, estima-se que exista cerca de 12 milhões de casos graves e 3 milhões de casos muito graves de infecção do trato respiratório inferior em crianças anualmente. Dentre os agentes etiológicos destas infecções, o vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é a principal causa de internações infantis em países desenvolvidos, agravando os casos de bronquiolite, pneumonia e infecções pulmonares obstrutivas crônicas em pessoas de todas as idades, principalmente crianças e idosos. Estudos preliminares demonstraram que a Quercetina possui ação virucida sobre hRSV, além de inibir sua replicação. Entretanto, não se tem conhecimento do quão promissora é a atividade antiviral de Quercetina sobre o vírus hRSV ou mesmo se esta atividade poderia ser melhorada através de mudanças químicas em sua estrutura molecular. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer o índice de seletividade (IS) para Quercetina e seus derivados acetilados durante a infeção por hRSV através de ensaios in vitro. A análise de viabilidade celular através da adição do sal de MTT determinou os valores de CC50 para Quercetina na presença/ausência do vermelho de fenol (85 e 11,4 µM, respectivamente). Dentre as condições testadas, Quercetina apresentou atividade virucida (16-30% de proteção celular) sem apresentar efeitos no pré ou pós-tratamentos. Os valores de CC50 dos compostos derivados Q1 e Q2 foram 37,1 µM e 53,15 µM, respectivamente. O composto Q1 apresentou atividade anti-hRSV nos protocolos virucida e pó... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Worldwide, is estimated that there are about 12 million serious cases and 3 million severe cases of lower respiratory tract infection in children every year. Among the etiological agents of these infections, respiratory syncytial virus (hRSV) is the leading cause of children's hospitalizations in developed countries, aggravating cases of bronchiolitis, pneumonia and chronic obstructive pulmonary infections in people of all ages, especially children and the elderly. Preliminary studies demonstrated that Quercetin has virucidal action on hRSV, and inhibits replication. However, we do not know how promising is the antiviral activity of Quercetin on the hRSV. The objectives of this work is to understand the action of Quercetin and some of its derivatives acetylated on the steps of the replicative cycle of hRSV, determining the selectivity index for each compound. The development of this project will assist in the search for effective compounds in the prevention and/or treatment of hRSV infections. In the cytotoxicity assays, Quercetin showed CC50 values variable depending on the presence/absence of phenol red (11.4 and 85 μM respectively). Among the concentrations tested Quercetin only showed a slight virucidal activity (16-30% concentration 5-10 μM). The CC50 values were derived compounds 37.1 μM for Q1 and Q2 to 53.15 μM. Compound Q1 showed anti-hRSV activity in virucidal and post-treatment protocol (60-90% at 4-8 μM). The Q2 compound showed no anti-hRSV relevant activity. The ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Karina Alves de Toledo / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Banca: Luciane Alarcão Dias-Melício / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) atua como um dos principais agentes etiológicos das mais de 15 milhões de infecções do trato respiratório inferior em crianças e idosos anualmente. A despeito de décadas de inúmeras pesquisas em busca de compostos anti-hRSV, atualmente não existem vacinas ou medicamentos eficazes contra esta infecção viral. Dentre os leucócitos presentes nas vias aéreas de indivíduos acometidos por hRSV, os neutrófilos são predominantes e se mostram em estado de ativação, incluindo a indução da liberação das NETs. As NETs, compostas por DNA e proteínas granulares/nucleares tem sido descritas como eficientes na captura e eliminação de diversos microrganismos. Em relação ao hRSV, o vírus induz a liberação das NETs no tecido pulmonar de indivíduos infectados, mas as consequências desse evento ainda não foram elucidadas. O objetivo deste trabalho foi investigar se as NETs possuem algum efeito anti-hRSV. Para tanto, foram realizados ensaios in vitro e in silico. NETs geradas a partir do estímulo com PMA e avaliadas por eletroforese apresentaram longos fragmentos de DNA e proteínas de peso molecular próximos daqueles determinados para elastase, catepsina G, mieloperoxidase e histonas. As NETs apresentaram índices de citotoxicidade celular abaixo de 50%, com uma CC50 >67μg/mL. Ensaio virucida realizado com diferentes MOIs (0.1, 0.5 e 1.0), mostraram eficiência das NETs (CE50 ≅ 1 e IS ≅ 66). As interações obtidas in silico demonstram forte interação entre... / Abstract: Annualy the Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) acts as one of the main etiological agents of more than 15 million infections in the lower respiratory tract of children and elderly. Despite decades of extensive research in search of anti-hRSV compounds, there are currently no vaccines or effective drugs against this viral infection. Among the present leukocytes in the airways of individuals affected by hRSV, the neutrophils are predominant and are shown in activation state, including the induction of the release of NETs. NETs, composed by DNA and glanular/nuclear proteins have been described as efficient in capturing and eliminating several microorganisms. Regarding hRSV, the virus induces the release of NETs in the lung tissue of infected individuals, but the consequences of this event have not yet been elucidated. The goal of this study was to investigate whether the NETs have some anti-hRSV effect. For that purpose, assays were performed in vitro and in silico. NETs generated from the stimulation with PMA and evaluated by electrophoresis showed long DNA fragments and proteins of molecular weight close to those determined for elastase, cathepsin G, myeloperoxidase, and histones. The NETs presented cellular cytotoxicity indices below 50%, with CC50 >67µg/mL. Virucide assay performed with different MOIs (0.1, 0.5 and 1.0), showed efficiency of the NETs (CE50 ≅ 1 and IS ≅ 66). The interactions obtained in silico demonstrate strong interaction between elastase and histone proteins with the F-hRSV protein, pre and postfusion, in important regions for the infection/replication of the virus. The data obtained up to date indicate that the NETs have a promising antiviral role and this effect may be related to its direct action in the capture of viral particles and/or interference of the fusion activity of F protein. In conclusion, our results associated with previous literature ... / Mestre

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Coorientador: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Flavio Augusto Vicente Seixas / Banca: Fernanda Canduri / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: Fernando Alves de Melo / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV) é a principal causa de infecções respiratórias agudas em crianças, como bronquiolite e pneumonia. Este Paramyxovirus tem um RNA de fita simples, com 10 genes que codificam 11 proteínas. Um fator importante que contribui para o sucesso da replicação do hRSV é a evasão do sistema imune, processo no qual a proteína não estrutural 1 (NS1) está envolvida. Esta proteína pode atuar por meio da inibição ou neutralização das etapas da cascata do interferon do tipo I, bem como, pelo silenciamento do complexo ribonucleoproteico do hRSV. O conhecimento da interação da proteína NS1 com ligantes é importante na busca de moléculas que possam interferir na função da proteína e consequentemente resultar na redução da replicação do hRSV dentre os quais os flavonóides têm sido descritos como sendo supressores eficazes da replicação viral. Os objetivos deste estudo incluíram a expressão e purificação da proteína NS1, a caracterização da estrutura secundária e estabilidade térmica por dicroísmo circular e a realização do estudo de interação entre NS1 e quercetina por espectroscopia de fluorescência. Foi realizada a purificação da proteína NS1 em resina de afinidade utilizando cromatógrafo líquido ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). As medidas de dicroísmo circular (CD) permitiram calcular a porcentagem de estruturas secundárias e a temperatura de melting da NS1. A partir das análises das titulações por fluorescência foram calculados a constante de Stern Volmer (Ksv), a constante de ligação (Kb) e o número de ligantes por sítio (n). Os resultados de CD mostraram que a composição da estrutura secundária de NS1 é de 75 % de alfa-hélice, 3% de folha-beta, 10% de voltas e 12% de outras estruturas e a temperatura de melting da NS1 é de cerca de 65°C. Os resultados de fluorescência mostraram que Ksv e Kb foram da ordem de 104 e 105-106M-1, ... / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major cause of acute respiratory infections in children, like bronchiolitis and pneumonia. This Paramyxovirus has a single strand RNA with 10 genes that codify 11 proteins. An important factor that contributes for the success hRSV replication is the immune system evasion, process wich Non-Structural Protein 1 (NS1) is involved. This protein can act by inhibiting or neutralizing steps of interferon type I pathway, as well as, by silencing the ribonucleoproteic complex of hRSV. The knowledge of NS1 protein interaction with ligands is important in the search for molecules that could interfere with protein function and hence result in a reduction of hRSV replication among them the flavonoids have been reported to be effective in suppressing viral replication. The aim of this study includes expression and purification of NS1 protein, characterization of its secondary structure and thermal stability through circular dicroism and perform fluorescence spectroscopy interaction study between NS1 and Quercetin. NS1 purification was performed using affinity resin coupled to a liquid cromatograph ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). Circular dicroism spectra and thermal denaturation were carried out to investigate NS1 secondary structure and stability. Through fluorescence spectroscopy titration results it has been calculated the Stern Volmer constant (Ksv), the binding (Kb) constant and number of ligands per site (n). CD analysis shown that secondary structure composition of NS1 is 75% alpha-helix; 3% beta-sheet; 10% turn and 12% others and, melting temperature of NS1 is around 65°C. Fluorescence results shown that Ksv and Kb were in order of 104 and 105-106M-1, respectively. Ksv dependence with temperature indicates that the interaction between NS1 and quercetin is dynamic. The results suggest that this interaction may potentially contribute to block the xiii protein function and thus quercetin may ... / Doutor

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-28Bitstream added on 2015-04-09T12:48:12Z : No. of bitstreams: 1 000811761_20160401.pdf: 128977 bytes, checksum: dea2a8e871c9982dfbafa4187b62fa02 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-04-01T11:49:30Z: 000811761_20160401.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T11:50:31Z : No. of bitstreams: 1 000811761.pdf: 785012 bytes, checksum: d2639de3af3e75addc7def7c6e77f5fb (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV) é a principal causa de infecções respiratórias agudas em crianças, como bronquiolite e pneumonia. Este Paramyxovirus tem um RNA de fita simples, com 10 genes que codificam 11 proteínas. Um fator importante que contribui para o sucesso da replicação do hRSV é a evasão do sistema imune, processo no qual a proteína não estrutural 1 (NS1) está envolvida. Esta proteína pode atuar por meio da inibição ou neutralização das etapas da cascata do interferon do tipo I, bem como, pelo silenciamento do complexo ribonucleoproteico do hRSV. O conhecimento da interação da proteína NS1 com ligantes é importante na busca de moléculas que possam interferir na função da proteína e consequentemente resultar na redução da replicação do hRSV dentre os quais os flavonóides têm sido descritos como sendo supressores eficazes da replicação viral. Os objetivos deste estudo incluíram a expressão e purificação da proteína NS1, a caracterização da estrutura secundária e estabilidade térmica por dicroísmo circular e a realização do estudo de interação entre NS1 e quercetina por espectroscopia de fluorescência. Foi realizada a purificação da proteína NS1 em resina de afinidade utilizando cromatógrafo líquido ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). As medidas de dicroísmo circular (CD) permitiram calcular a porcentagem de estruturas secundárias e a temperatura de melting da NS1. A partir das análises das titulações por fluorescência foram calculados a constante de Stern Volmer (Ksv), a constante de ligação (Kb) e o número de ligantes por sítio (n). Os resultados de CD mostraram que a composição da estrutura secundária de NS1 é de 75 % de alfa-hélice, 3% de folha-beta, 10% de voltas e 12% de outras estruturas e a temperatura de melting da NS1 é de cerca de 65°C. Os resultados de fluorescência mostraram que Ksv e Kb foram da ordem de 104 e 105-106M-1, ... / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major cause of acute respiratory infections in children, like bronchiolitis and pneumonia. This Paramyxovirus has a single strand RNA with 10 genes that codify 11 proteins. An important factor that contributes for the success hRSV replication is the immune system evasion, process wich Non-Structural Protein 1 (NS1) is involved. This protein can act by inhibiting or neutralizing steps of interferon type I pathway, as well as, by silencing the ribonucleoproteic complex of hRSV. The knowledge of NS1 protein interaction with ligands is important in the search for molecules that could interfere with protein function and hence result in a reduction of hRSV replication among them the flavonoids have been reported to be effective in suppressing viral replication. The aim of this study includes expression and purification of NS1 protein, characterization of its secondary structure and thermal stability through circular dicroism and perform fluorescence spectroscopy interaction study between NS1 and Quercetin. NS1 purification was performed using affinity resin coupled to a liquid cromatograph ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). Circular dicroism spectra and thermal denaturation were carried out to investigate NS1 secondary structure and stability. Through fluorescence spectroscopy titration results it has been calculated the Stern Volmer constant (Ksv), the binding (Kb) constant and number of ligands per site (n). CD analysis shown that secondary structure composition of NS1 is 75% alpha-helix; 3% beta-sheet; 10% turn and 12% others and, melting temperature of NS1 is around 65°C. Fluorescence results shown that Ksv and Kb were in order of 104 and 105-106M-1, respectively. Ksv dependence with temperature indicates that the interaction between NS1 and quercetin is dynamic. The results suggest that this interaction may potentially contribute to block the xiii protein function and thus quercetin may ... / FAPESP: 2010/50211-0

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Alexandre Suman de Araujo / Banca: Luiz Paulo Barbour Scott / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é o maior causador de infecções respiratórias agudas (IRAs) em recém-nascidos e crianças no mundo inteiro. Seu genoma codifica 11 proteínas entre as quais as proteínas de superfície F, G e SH que são responsáveis pela entrada e instalação do vírus na célula do hospedeiro. Entre as proteínas de superfície, pouco se sabe sobre a função da proteína SH. O objetivo do presente estudo foi realizar a modelagem e caracterização da proteína SH e análizar o seu comportamento estrutural em diferentes meios: água e bicamada fosfolipídica. O modelo da proteína SH foi gerado pelo servidor I-Tasser, e suas características funcionais e estruturais analisados pelo PredictProtein e PsiPred. Simulações de Dinâmica Molecular foram realizadas para análise da hidrofobicidade da região central da proteína, do seu comportamento em membrana lipídica e possível formação de oligômeros. Os resultados da predição do modelo da proteína SH resultou em uma estrutura linear com uma alfa-hélice compreendida entre os aminoácido 20-42 e as análises realizadas pelo PsiPred indicaram essa região como sendo uma região transmembrânica. As simulações de Dinâmica Molecular mostraram que, quando em solução, a proteína muda sua conformação linear para globular confirmando a hidrofobicidade do domínio central. A presença da proteína SH sozinha ou das cinco estruturas na bicamada resultou num decréscimo considerável da área por lipídeo, conferindo as cadeias menor mobilidade e um maior alinhamento. As simulações do pentâmero mostraram a passagem de moléculas de água pelo poro em ambiente onde os resíduos de histidinas H22 e H51 apresentaram-se na forma protonada, indicando a dependência desta atividade com o pH do meio. Com base nessas análises foi possível propor uma estrutura terciária e quaternária da proteína SH e, com as análises da formação pentamérica da... / Abstract: The human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major cause of lower respiratory tract illnesses in children and elderly people worldwide. Its genome encodes 11 proteins including the surface protein F, G and SH which are responsible for entry and distribution of virus in the host cell. Among the protein surface, little is known about the function of protein SH. Knowing their structure and function is fundamental to a better understanding of its mechanism. The aim of this study was modeling and caracterization of the RSV SH protein and analysis of structural behavior in different environment : water and phopholipid bilayer for understanding and evaluating the formation of its pentameric structure. The SH protein model was generated by I-TASSER server, and its funcional and structural caracterisct was analyzed by PredictProtein and PsiPred. Molecular Dynimics Simulation were performed for analysis of hidrophobicit of protein central region, studies of the protein behavior on the membrane and pentamer formation. The SH protein model prediction resulted in a linear model with a helix-alpha between amino acid 20-42 and the anlysis performed by PsiPred indicated this region as transmembrane region. Molecular Dynamics Simulation showed that, when in solution,the proteína changes its linear conformations for globular conformation confirming the hydrophobicity of the central domain. The presence of the Sh protein itself or of the pentamer in bilayer resulted in a considerable decrease of the area per lipid, giving the chains less mobility and greater alignment. The pentamer simulation showed passage of water molecules through the pore in an environment where histidine residues H22 and H51 are protonated, indicating the dependence of this activity with the pH of the medium. Based on this analysis, it was proposed the structure tertiary and quaternary of the SH protein and, with the analysis of the ... / Mestre

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Alessandra Vidotto / Banca: Rogério de Moraes / Banca: Natália Bueno Leite Slade / Banca: Marcio José Tiera / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é o principal agente causador de doenças respiratórias agudas severas, como pneumonia e bronquiolite. Trata-se de um vírus da família Paramyxoviridae, com simetria helicoidal e envelope lipídico. Possui um genoma de RNA fita simples, não segmentado, com 10 genes codificantes. Um dos fatores que contribuem para o sucesso na replicação viral é a interação da proteína M2-1 com as proteínas P, M e com o RNA. Tal proteína age através da interação com RNA, e assim, participa efetivamente no processo de replicação viral, apresentando atividade anti-parada da replicação sendo ativa quando na forma tetramérica. Deste modo, o ligante que realizar interação com a M2-1 é um potencial candidato a prevenir as interações M2-1 com RNA e demais proteínas, impedindo deste modo o sucesso da replicação viral. Flovonoides são compostos naturais com várias atividades como antioxidante, anticancerígena, cardio protetora, antibacteriana e antiviral. Quercetina é um flavonoide que apresenta atividade antiviral, inibindo o complexo de replicação. Com a finalidade de investigar a interação de um potencial candidato a inibição da atividade da M2-1, clonamos, expressamos e purificamos a proteína M2-1 do hRSV e, determinamos sua característica físico-química de interação com quercetina em diferentes condições de temperatura. Para clonagem e expressão do gene M2-1 foram escolhidos o vetor pGEX-4T-1 e a bactéria Escherichia coli da linhagem BL21 Gold (DE3). A proteína expressa foi purificada em cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. As análises de composição de estrutura secundária e estabilidade térmica foram realizadas por espectroscopia de dicroísmo circular e, a interação com Quercetina com espectroscopia de fluorescência. Para o mapeamento da interação com a Quercetina foram realizadas docking molecular e dinâmica molecular. A proteína... / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major causative agent of acute respiratory infections such as pneumonia and bronchiolitis. This is a virus of the Paramyxoviridae family with helical symmetry and lipid envelope. It has a single strand RNA genome, not segmented, with 10 coding genes. One of the factors that contribute to success in viral replication is the interaction of M2-1 protein with P, M protein and RNA viral. Such protein acts through the interaction with RNA, hence, participating in the viral replication process, having anti-stop activity in the replication process and, the protein is active only as a tetramer. Thus, a ligand that interacts with M2-1 is a potential candidate to prevent interaction of M2-1 with other proteins, thereby preventing the success of viral replication. The aim of the research is to clone, express and purify the M2-1 protein of hRSV and then determine its physicochemical characteristics of the interaction with Quercetin in different temperatures to investigate the interaction of a potential candidate to inhibit the activity of the M2-1. The M2-1 gene was cloned in vector pGEX-4T-1 and expressed in Escherichia coli strain BL21 Gold (DE3). The expressed protein was purified on affinity chromatography molecular exclusion chromatography, thermal stability and secondary structure were analyzed by circular dicroism and the interaction with Quercetin was analyzed by fluorescence spectroscopy. To understand the interaction mechanism was performed molecular dynamics and molecular docking. The purified protein has 40% α-helix, 10% β-sheet, 19% turns and 31% random coils, being the melting temperature of 55,6°C. The titration of M2- 1 with Quercetin showed that it interacts in two points, on site 1 (the binding affinity is ~1,5x106 M -1 ) and stablishes an ionic interaction and, on site 2 (1,1x105 M -1 ) stablishes a hydrophobic interaction. One Quercetin molecule interacts on site 1 (formed by the ... / Doutor

A incidência de doença respiratória pelo vírus sincicial respiratório humano (VSRH) avaliada em uma coorte de recém-nascidos, entre dezembro/2002 a setembro/2005, foi de 9,84/1000 criança-mês.Um total de 316 amostras de lavado de nasofaringe, foram processadas por três diferentes técnicas (isolamento viral, imunofluorescência direta e PCR) para detecção de vírus respiratório sincicial humano (VSRH). Destas, 36 (11,4%) foram positivas para o VSRH. A PCR foi à técnica mais sensível, sendo positiva em 35 (11,1%) das amostras, seguido da imunofluorescência direta (25/316, 7,9%) e isolamento viral (20/315, 6,3%) (p < 0,001). Os dados do presente estudo sugerem que o conceito de isolamento viral como "padrão ouro" no diagnóstico do VSRH seja revisto. / The incidence of respiratory illnesses caused by the human respiratory syncytial virus (HRSV) in a cohort of neonates between December 2002 and September 2005 was 9.84/1000 children/month. A total of 316 samples of nasopharyngeal lavage were processed using three different techniques (viral isolation, direct immunofluorescence and PCR) to detect the human respiratory syncytial virus (HRSV). Of these, 36 (11.4%) were positive for HRSV. PCR was the most sensitive technique. It was positive in 35 (11.1%) of the samples, followed by direct immunofluorescence (25/316, 7.9%) and viral isolation (20/315, 6.3%) (p < 0.001). The findings of this study suggest that the view that viral isolation is the "gold standard" for diagnosis of HRSV should be reconsidered.

A incidência de doença respiratória pelo vírus sincicial respiratório humano (VSRH) avaliada em uma coorte de recém-nascidos, entre dezembro/2002 a setembro/2005, foi de 9,84/1000 criança-mês.Um total de 316 amostras de lavado de nasofaringe, foram processadas por três diferentes técnicas (isolamento viral, imunofluorescência direta e PCR) para detecção de vírus respiratório sincicial humano (VSRH). Destas, 36 (11,4%) foram positivas para o VSRH. A PCR foi à técnica mais sensível, sendo positiva em 35 (11,1%) das amostras, seguido da imunofluorescência direta (25/316, 7,9%) e isolamento viral (20/315, 6,3%) (p < 0,001). Os dados do presente estudo sugerem que o conceito de isolamento viral como "padrão ouro" no diagnóstico do VSRH seja revisto. / The incidence of respiratory illnesses caused by the human respiratory syncytial virus (HRSV) in a cohort of neonates between December 2002 and September 2005 was 9.84/1000 children/month. A total of 316 samples of nasopharyngeal lavage were processed using three different techniques (viral isolation, direct immunofluorescence and PCR) to detect the human respiratory syncytial virus (HRSV). Of these, 36 (11.4%) were positive for HRSV. PCR was the most sensitive technique. It was positive in 35 (11.1%) of the samples, followed by direct immunofluorescence (25/316, 7.9%) and viral isolation (20/315, 6.3%) (p < 0.001). The findings of this study suggest that the view that viral isolation is the "gold standard" for diagnosis of HRSV should be reconsidered.