Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-02T20:07:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Rita de Cássia Pereira de Lima.pdf: 2090852 bytes, checksum: df6f7838949b3a9d06e3a4aa1380550c (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-03T22:32:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Rita de Cássia Pereira de Lima.pdf: 2090852 bytes, checksum: df6f7838949b3a9d06e3a4aa1380550c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:32:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Rita de Cássia Pereira de Lima.pdf: 2090852 bytes, checksum: df6f7838949b3a9d06e3a4aa1380550c (MD5) Previous issue date: 2017-03-08 / CAPES / Cervical e um subconjunto de cânceres de cabeça e pescoço são causados pela infecção persistente por papilomavírus humano (HPV) de alto risco. A oncogenicidade do HPV está fortemente associada a fatores ambientais, a exemplo dos tipos virais e suas variantes, e também tem sido associado a presença de polimorfismos em oncogenes virais, os quais podem estar envolvidos no risco de progressão maligna. O conhecimento sobre como a variância genética é bem distribuído entre diferentes populações e sua relação com lesões de alto grau pode ser crucial para o diagnóstico e estratégias terapêuticas contra doenças relacionadas ao HPV. Os polimorfismos podem levar à alteração da função biológica com conseqüências clínicas. Além de prejudicar o controle do ciclo celular mediado por pRB, as atividades de E7 incluem perturbação da via NF-κB afetando uma importante via crítica celular anti-viral. Em pacientes do Nordeste do Brasil, nosso estudo descreveu a presença de tipos de HPV e variantes de amostras cervicais por técnica de PCR e sequenciamento e realizou uma das primeiras análises funcionais baseadas na atividade NF-κB dos polimorfismos E7 de HPV-16. Adicionalmente, para se ter acesso aos níveis de expressão de mRNA de E7 a partir de culturas de células. O HPV-16 foi encontrado como o tipo mais prevalente, seguido por HPV-31 e HPV-58. Entre as variantes do HPV-16, as linhagens C e D foram detectadas principalmente em lesões cervicais de alto grau. Além disso, identificamos quatro polimorfismos do gene E7 do HPV-16. Um polimorfismo não-sinônimo foi localizado em epítopos preditos de células T e B, que estão sob seleção positiva. Este polimorfismo também está localizado em uma região de loop próximo ao domínio da hélice LXCXE, que é responsável pela interação da proteína E7 e pRb, passo crucial no desenvolvimento do câncer. Novas mutações adaptativas podem levar o vírus a evadir o sistema imunológico do hospedeiro e aumentar a patogenicidade. Sobre os resultados da via NF-kB, estes mostraram que as variantes do gene E7 do HPV-16 nas quais os três polimorfismos estão presentes podem exercer um forte efeito supressor nos pacientes infectados com HPV com implicações na persistência da infecção e na sua progressão. No entanto, as alterações resultantes dos polimorfismos podem não estar necessariamente relacionadas com os níveis de expressão diferencial das variantes. Estes resultados adicionam dados importantes para os estudos sobre a variabilidade de E7, o que poderia contribuir para uma melhor compreensão da diversidade e infecção do HPV. / Cervical and a subset of head and neck cancers are caused by high-risk human papillomavirus (HPV) persistent infection. HPV oncogenicity is strongly associated with environmental factors, viral types, and their variants, where even polymorphisms in viral oncogenes may be involved in malignant progression risk. Knowledge about how genetic variance is distributed among populations and its relationship with high-grade lesions may be critical to diagnosis and therapeutic strategies against HPV-related diseases. Polymorphisms may lead to altered biological function with clinical consequences. Besides impairing pRB-mediated cell cycle control, E7 activities include NF-κB disturbing, which affects an anti-viral cellular critical pathway. In Brazilian Northeastern patients, our study described the presence of HPV types and variants from cervical cells by PCR technique and sequencing and performed one of the first NF-κB activity-based functional analysis of HPV-16 E7 polymorphisms. In addition, in order to access E7 mRNA expression levels from cell cultures. HPV-16 was found as the most prevalent type, followed by HPV-31 and HPV-58. Among HPV-16 variants, C and D lineages were detected mostly from high-grade cervical lesions. Furthermore, we have identified four HPV-16 E7 gene polymorphisms. A non-synonymous polymorphism was located into predicted T and B-cell epitopes, which are under positive selection. This polymorphism is also located in a loop region next to LXCXE helix domain, which is responsible for the interaction of E7 protein and pRb, critical step in cancer development. Novel adaptive mutations could lead the virus to evade host immunological system and increase pathogenicity. About the NF-kB pathway, results have shown that HPV-16 E7 gene variants in which the three polymorphisms are present may perform a strong suppressive effect on the in HPV-infected patients with implications for infection persistence and its progression. However, the changes resulting from polymorphisms may not necessarily be related to the differential expression levels of the variants. These results add important data on E7 variability studies, which could contribute to a better understanding of HPV diversity and infection.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-01T16:06:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 16381046 bytes, checksum: 744e0d70d25cc43dd4482fbf751a1c8c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T16:06:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 16381046 bytes, checksum: 744e0d70d25cc43dd4482fbf751a1c8c (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A emergência dos begomovírus (virus transmitidos por mosca-branca classificados no gênero Begomovirus, família Geminiviridae) no Brasil provavelmente ocorreu pela transferéncia horizontal de vírus presentes em plantas não-cultivadas após a introdução da Bemisia tabaci MEAMl. Recentemente, Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) foi encontrado em associação com Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) infectando Euphorbia heterophylla, uma importante invasora na cultura da soja no Brasil. A variabilidade genética e a estrutura da população de begomovírus infectando E. heterophylla, e novas ocorrências de EuYMA, foram investigados em amostras coletadas em nove estados Brasileiros entre 2009 e 2014. Apenas EuYMV foi detectado (com uma exceção), e um total de 158 e 57 haplótipos foram comparados em conjuntos de dados correspondentes ao DNA-A e DNA-B, respectivamente. EuYMA foi detectado em apenas seis amostras coletadas nos estados do Rio Grande do Sul e Paraná. Comparado com populações de outros begomovírus, o EuYMV possui um menor grau de variabilidade genética, e poucos eventos de recombinação intraespecíficos. Analise de componentes principais permitiu a diferenciação de seis subpopulações virais de acordo com os locais de amostragem, corroborando as análises filogenéticas. Os polimorfismos de 23 sitios que mais contribuiram para a estrutura geografica foram descritos como suficientemente informativos para discriminar entre as subpopulações virais. A caracterização biológica e molecular da associação do alfassatélite EuYMA com o EuYMV foi realizada após a construção de clones infeciosos de ambos os agentes. Diferenças fenotípicas na infecção por EuYMV na presença do EuYMA foram observadas em Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e E. heterophylla. Ensaios de transmissão indicaram que o EuYMA afeta negativamente a transmissão de EuYMV por Bemisia tabaci MEAMl. Em conjunto, os resultados indicam que o EuYMV apresenta menor grau de variabilidade genética comparado a outros begomovírus que infectam plantas cultivadas e não-cultivadas no Brasil, porém, similar ao descrito para outros begomovírus, segrega de acordo com o local de amostragem. Além disso, o EuYMA é capaz de modular os sintomas, o acúmulo Viral e a transmissão pela mosca-branca no contexto da infecção pelo EuYMV, potencialmente interferindo na disseminação do vírus no campo. / The emergence of begomoviruses (whitefly-transmitted viruses classified in the genus Begomovirus, family Geminiviridae) in Brazil probably occurred by horizontal transfer of viruses infecting non-cultivated plants after the introduction of Bemisia tabaci MEAMl. Recently, Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) was found in association with Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) infecting Euphorbia heterophylla, an important invasive species in soybean and other crops in Brazil. We assessed the genetic variability and population structure of begomoviruses infecting E. heterophylla, and the geographical range of alphasatellites in samples collected throughout nine Brazilian states from 2009 to 2014. Only EuYMV was detected (with one exception), and a total of 158 and 57 haplotypes were compared in DNA-A and DNA-B datasets, respectively. EuYMA was detected in only six samples collected in the states of Rio Grande do Sul and Paraná. Compared with other begomoviruses, EuYMV has a low degree of genetic variation, and few intraspecific recombination events. The application of principal component analysis allowed the differentiation of six viral subpopulations according to sampling locations, in agreement with phylogenetic analysis. The polymorphisms of 23 sites that mostly contributed to the geographical structure were shown to hold supporting information to discriminate between the viral subpopulations. Biological and molecular aspects of the association between the alphasatellite EuYMA and EuYMV were studied following the construction of infectious clones of both agents. Phenotypic differences of EuYMV infection in the presence of EuYMA were observed in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and E. heterophylla. Transmission assays indicated that EuYMA negatively affects the transmission of EuYMV by Bemisia tabaci MEAMl. Together, the results indicate that EuYMV displays a lower degree of genetic variation compared to other begomoviruses infecting cultivated and non-cultivated plants in Brazil but, similar to other begomoviruses, segregates according to sampling location, and that EuYMA is capable of modulating symptoms, Viral accumulation and whitefly transmission of EuYMV, potentially interfering with Virus dissemination in the field.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-01T11:36:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9707476 bytes, checksum: a565c0a06a8c635b67e72e452cff1bff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T11:36:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9707476 bytes, checksum: a565c0a06a8c635b67e72e452cff1bff (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Cowpea mild mottle virus (CPMMV, família Betaflexiviridade e gênero Carlavirus) é um vírus emergente no Brasil. O vírus é transmitido pela mosca-branca Bemisia tabaci e infecta hospedeiros preferencialmente da família Fabaceae, sendo encontrado em diferentes culturas em quase todos os continentes do mundo. Nesse trabalho, vários aspectos da biologia e genética do CPMMV foram discutidos e a relação CPMMV- hospedeiro foi explorada. O CPMMV causa sintomas muito variados em plantas campo e em casa de vegetação. A natureza dessa variação de sintomas foi determinada nesse trabalho utilizando-se inoculações sucessivas de um isolado de CPMMV brasileiro causador de necrose na cultivar de soja CD206. As inoculações sucessivas levaram o isolado que antes causava necrose a induzir sintomas brandos (mosaicos e clareamento de nervuras). Isso foi verificado após seis inoculações sucessivas de uma amostra vegetal de soja proveniente do campo e também a partir do isolado viral oriundo de uma lesão local, e submetido, portanto a um gargalo genético, em folhas de Nicotiana benthamiana. A alteração do padrão de sintomas aumentou adaptabilidade do vírus e vetor, sugerindo que a indução de diferentes sintomas pelos variantes virais é uma vantagem adaptativa. A região viral envolvida na indução de sintomas pelo CPMMV foi a replicase viral (codificada pela ORF1) e diferentes sítios distribuídos ao longo de blocos recombinantes da ORF1 foram associados às alterações do fenótipo. Nesse trabalho, também se buscou compreender um aspectos da replicação do CPMMV em soja, identificando-se fatores necessários à replicação. Até o momento tudo que se sabia sobre a replicação dos betaflexivírus é que ela ocorria no citoplasma. Nenhum fator do hospedeiro era conhecido. Aqui foram identificadas duas proteínas do hospedeiro capazes de interagir com o domínio RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) a partir de uma biblioteca de cDNA de soja construída em vetor de duplo-híbrido de leveduras. Para a construção da biblioteca foram utilizadas plantas de soja cv. CD206 com infecção pelo CPMMV após 0, 3, 7 e 14 dias de inoculação. As proteínas identificadas foram: a ERD4 tipo CSC1 (GmERD4) e uma inositol metiltransferase (GmIMT). A interação foi confirmada por ensaios de duplo-híbrido de leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A predição e a localização subcelular de ambas as proteínas e do domínio RdRp também foram realizados. GmERD4 localizou-se no retículo endoplasmático (RE) e GmIMT apresentou localização citoplasmática, enquanto o domínio RdRp induziu estruturas pontuais na membrana plasmática e sobre a rede do RE. A análise da expressão de ambos os genes em plantas de soja infectadas com o CPMMV, demonstrou que eles foram induzidos após 3 e 7 dias da inoculação. A superexpressão de GmERD4 e GmIMT foi realizada em protoplastos de soja infectados com o CPMMV e foi verificado que a superexpressão de GmERD4 aumentou o acúmulo viral após 7 dias de infecção. A replicase viral está envolvida em diferentes processos da infecção viral, atuando não apenas na replicação dos genomas, mas também na indução de sintomas. Isso reforça a natureza multifuncional das proteínas virais. / Cowpea mild mottle virus (CPMMV, family Betaflexiviridae and genus Carlavirus) is an emerging virus in Brazil. The virus is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci and it infects hosts preferentially of Fabaceae family, being found in different crops in almost all the continents in the world. In this work, several aspects about biology and genetics of CPMMV were dicussed and the CPMMV-host relationship was explored. CPMMV causes varied symptoms in plants in the fields and in greenhouse. The nature of this symptoms variation was determinate in this work using successive inoculations of a CPMMV Brazilian isolate causing necrosis in the CD206 soybean cultivar. Successive inoculations led to the isolate, which previously had caused necrosis to induce mild symptoms (mosaic and vein clearing). This was verified after six successive inoculations of a soybean sample from the field and also from a local lesion of a viral isolate, and thus submitted to a genetic bottleneck, in Nicotiana benthamiana leaves. We have shown that altering of symptoms pattern increased the fitness of the virus and vector, suggesting that the induction of different symptoms by viral variants is an adaptive advantage. The viral region involved in the induction of CPMMV symptoms was viral replicase (encoded by ORF1), different sites distributed throughout the recombinant blocks of ORF1 were associated with phenotype changes. In this work, also shought to the understanding about the replication of CPMMV in soybean identifying factors necessary for replication. To date, all that has been known about betaflexiviruses’s replication is that it occurs in the cytoplasm. None host factor was known. Here, two host proteins able to interact with the RNA-dependent RNA polymerase domain (RdRp) from a yeast two-hybrid vector-constructed soybean cDNA library were indentifyed. For the library construction, soybean plants cv. CD206 with CPMMV infection after 0, 3, 7 and 14 days of inoculation were used. The proteins identified were: the CSC1 type ERD4 (GmERD4) and an inositol methyltransferase (GmIMT). The interaction was confirmed by yeast two-hybrid assays and by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assays. Prediction and subcellular localization of both proteins and the RdRp domain were also performed. GmERD4 was located in the endoplasmic reticulum (ER), GmIMT presented cytoplasmic location while the RdRp domain induced punctual structures in the plasma membrane and on the ER network. Analysis of the expression of both genes in soybean plants infected with CPMMV demonstrated that the they were induced after 3 and 7 days of inoculation. Overexpression of GmERD4 and GmIMT was performed on soybean protoplasts infected with CPMMV and it was found that overexpression of GmERD4 increased viral accumulation after 7 days of infection. Viral replicase is involved in different viral infection processes, acting not only on genome replication, but also on the induction of symptoms. This reinforces the multifunctional nature of viral proteins.