Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer / From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

Une réponse immunitaire efficace contre un large spectre de pathogènes ou contre des cellules tumorales nécessite l’activation des lymphocytes T CD4+. L’engagement du récepteur T par un peptide antigénique apprêté sur les produits de classe-II du complexe majeur d’histocompatibilité (peptide-CMH, pCMH) portés par une cellules présentatrices d’antigène (CPAg), conduit à de nombreux remaniements du lymphocyte T. Il s’établit notamment à l’interface entre le lymphocyte T et la CPAg, une structure spécialisée qui est la synapse immunologique (ou synapse immune). La synapse est le siège d’événements de signalisation intenses où diverses molécules de signalisation nécessaires l’amplification et la diversification du signal provenant du TCR sont recrutées. Ces évènements de signalisation sont régulés par l’adaptateur transmembranaire LAT (« Linker for Activation of T cells ») qui est présent à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires. La fraction intracellulaire de LAT est recrutée à la synapse immune et il est proposé que ces compartiments vésiculaires participent à la signalisation lymphocytaire T. L’objectif de ce travail de thèse a été de déterminer les voies de trafic intracellulaire nécessaires au recrutement de la fraction intracellulaire de LAT à la synapse immunologique et de comprendre le rôle de ce transport dans l’activation et la réponse lymphocytaire T. Par des approches d’extinction de l’expression de différentes molécules de transport intracellulaires dans les cellules T Jurkat ou des lymphocytes T CD4+ primaires humains ou par l’utilisation de souris Knock-Out (KO), nous avons mis en évidence plusieurs voies de transport impliquées dans le transport de LAT. Nous avons ainsi mis en évidence que le recrutement de LAT à la synapse immunologique nécessite une voie de sécrétion dépendante de la protéine SNARE vésiculaire VAMP7. L’analyse plus avant du transport de LAT a par ailleurs permis de montrer que LAT est présente dans des compartiments de recyclage alors que VAMP7 est principalement localisée dans l’appareil de Golgi. L’étude de la petite GTPase Rab6 et de la protéine t-SNARE syntaxine-16 qui sont impliquées dans des voies de transport rétrograde entre les endosomes de recyclage et l’appareil de Golgi, a permis de dévoiler que cette voie de transport est requise dans le recrutement de LAT à la synapse immunologique, ainsi qu’à la réponse lymphocytaire T in vitro, ex vivo et in vivo. Enfin, le rôle de la protéine de transport intraflagellaire IFT20, qui a déjà été mis en cause dans le transport du TCR, a été analysé chez la souris et a également montré des défauts de recrutement de LAT à la synapse et dans l’activation lymphocytaire T ex vivo et in vivo. Nos résultats mettent ainsi en évidence que la régulation du transport intracellulaire dans les lymphocytes T joue un rôle crucial dans l’activation lymphocytaire T. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel LAT est constitutivement internalisé depuis la membrane plasmique et poursuit une voie de recyclage dépendante de l’appareil de Golgi qui contient la machinerie de sécrétion associé à VAMP7. Cette voie de transport intracellulaire, conditionnerait la resécrétion polarisée de LAT à la synapse immunologique dans les conditions d’activation et une réponse lymphocytaire T robuste. / The immune response against a broad spectrum of pathogens or against tumor cells requires the CD4 + T lymphocytes activation. The triggering of T Cell Receptor (TCR) by peptide-MHC through antigen-presenting cells (APC) leads to numerous T-cell remodeling and the establishment of a specialized structure at the interface between the T lymphocyte and the APC: the immunological synapse. The synapse is the site of intense signaling events where various signaling molecules are recruited in order to amplify and diversify the signal initiated by the TCR. These signaling events are regulated by the transmembrane adapter LAT ("Linker for activation of T cells") which is present at the plasma membrane as well as in intracellular compartments. The intracellular fraction of LAT is recruited at the immune synapse and it is proposed that these vesicular compartments participate in T lymphocyte signaling. The objective of this thesis work was to determine the intracellular trafficking pathways required for the recruitment of the intracellular pool of LAT to the immunological synapse and understand the role of this transport in T cell activation and response. By silencing the expression of different intracellular transport molecules in Jurkat T cells or primary human CD4 + T lymphocytes, or by using Knock-Out (KO) mice, we have highlighted several trafficking pathways involved in the transport of LAT to the immune synapse. We have demonstrated that the recruitment of LAT to TCR activation sites requires a secretion pathway dependent on the vesicular SNARE protein VAMP7. Further analysis of the transport of LAT showed that LAT is present in recycling compartments whereas VAMP7 is mainly located in the Golgi apparatus. The study of the small GTPase Rab6 and the t-SNARE syntaxin-16 protein that are involved in the retrograde transport pathways between the recycling endosomes and the Golgi apparatus, demonstrated that this route of transport is required for the recruitment of LAT to the immunological synapse and for T lymphocyte response in vitro, ex vivo and in vivo as well. Finally, the role of intraflagellar transport protein IFT20, which has already been implicated in the transport of TCR, was analyzed in mice and also showed defects in LAT recruitment to synapse and T lymphocyte activation ex vivo and in vivo. Our results thus show that the regulation of intracellular transport plays a crucial role in T lymphocyte activation. We thus propose a model in which LAT is constitutively internalized from the plasma membrane and pursues a Golgi-dependent recycling pathway that contains the secretion machinery associated with VAMP7. This intracellular transport pathway would thus allow the polarized LAT re-secretion to the immunological synapse under activation conditions and a robust T lymphocyte response.

Les synapses fibres moussues de l‘hippocampe entre le gyrus denté et les cellulespyramidales de CA3 sont caractérisées par leur morphologie particulière, et par leurspropriétés distinctives de transmission synaptique et de plasticité présynaptique. Cessynapses sont parfois appelées «détonatrices» pour leur rôle fonctionnel dansl‘encodage de la mémoire épisodique. Cependant, les mécanismes moléculaires à labase des propriétés spécifiques de ces synapses restent peu connus. Ce travail estcomposé de deux parties principales:1) Phénotypage des synapses fibres moussues de l'hippocampe chez les sourisVAMP7 KOVAMP7 est une protéine SNARE vésiculaire de la famille des longins, qui joue unrôle dans la croissance des neurites durant le développement. Dans le cerveauadulte, VAMP7 est enrichi dans un sous-ensemble de terminaisons nerveuses, enparticulier dans les fibres moussues de l‗hippocampe. Nous avons analysé lafonction de VAMP7 dans la libération de neurotransmetteurs par une caractérisationextensive de la transmission synaptique et des mécanismes de plasticité de cettesynapse. L'absence de VAMP7 ne cause pas de graves déficits développementauxou neuronaux (Sato et al., 2011; Danglot et al., 2012). Les mécanismesprésynaptiques de la plasticité à court terme de la fibre moussue de l‘hippocampesemblent également normaux, pour des raisons éventuelles qui seront discutées.2) Circuits du CA3 examinés par traçage viral et enregistrements de pairesNous avons développé une technique pour établir des enregistrements en pairesentre cellules en grain du gyrus denté connectées et cellules pyramidales CA3 (GCCA3),sur des cultures organotypiques de tranches d'hippocampe de souris. Pouridentifier les partenaires présynaptiques directs à une cellule pyramidale CA3 ciblée,nous avons combiné l‘électroporation cellulaire unitaire et le traçage mono-transsynaptiquebasé sur un virus de la rage recombinant et pseudotypé. Nous avonstransfecté une cellule pyramidale CA3 unique par tranche avec les plasmides codantla glycoprotéine d‘enveloppe du virus de la rage (RG), un rapporteur fluorescent, etla protéine TVA (récepteur de surface apparenté au EnvA, qui n'a pas d‘homologuechez les cellules de mammifères). Les tranches ont ensuite été infectées avec levirus de la rage recombinant et pseudotypé. Après 3-4 jours, le traçage mono-transsynaptiquerévèle les entrées présynaptiques de ce neurone unique. Ensuite, nousavons pu établir des enregistrements de paires entre les cellules en grain-CA3connectés, ainsi que de quantifier les partenaires présynaptiques de la cellulepyramidale CA3 de départ. / The hippocampal mossy fiber is characterized by its particular morphology, distinctsynaptic transmission and presynaptic plasticity. Moreover, this synapse has beencalled ―teacher‖ or ―detonator‖ for its proposed functional role in episodic memoryencoding. Nevertheless, the molecular mechanisms underlying its specific functionalproperties remain elusive. This work is composed of two main parts:1) Phenotyping Hippocampal Mossy Fiber Synapses in VAMP7 KO MiceVAMP7 is a vesicle SNARE of the longin family important in neurite growth duringdevelopment. In the adult brain, VAMP7 is enriched in a subset of nerve terminals,particularly at the hippocampal mossy fiber. We analyzed VAMP7 function inneurotransmitter release by characterizing basal and evoked transmission at thissynapse in KO mice and fully tested hypotheses relevant to short-term plasticity.Loss of VAMP7 has been previously reported not to cause major developmental orneurological deficits (Sato et al., 2011; Danglot et al., 2012). Presynapticmechanisms of short-term plasticity at the hippocampal mossy fiber also seemunaffected for potential reasons that will be discussed.2) CA3 Circuits Probed with RABV-Tracing and Paired RecordingsWe developed a technique to establish paired recordings between connected dentategyrus granule cells and CA3 pyramidal cells (GC-CA3) in mouse hippocampalorganotypic slice cultures. To identify direct presynaptic partners to a defined targetCA3 pyramidal cell, we combined single-cell electroporation (SCE) and mono-transsynaptictracing based on a pseudotyped, recombinant rabies virus (EnvApseudotyped RABV ΔG). Using SCE we transfected a single CA3 pyramidal cell perslice with the plasmids encoding: the RABV envelope glycoprotein (RG), afluorescent reporter, and TVA (the EnvA cognate surface receptor, which has nohomologue in mammalian cells). The slices were subsequently infected with EnvApseudotyped RABV ΔG. After 3-4 days, the RABV mono-trans-synaptic tracingrevealed the presynaptic inputs of that single neuron. Then, we were able toestablish paired recordings between connected GC-CA3 cells, as well as to quantifythe presynaptic partners of the starter CA3 pyramidal cell. / De mosvezel van de hippocampus kenmerkt zich door een bijzondere morfologie,uitzonderlijke synaptische transmissie en presynaptische plasticiteit. De synapswordt ook wel "leraar" of "detonator" genoemd vanwege zijn waarschijnlijke rol in decodering van het episodisch geheugen. Toch blijven de specifieke moleculairemechanismen van dit synaps onbekend. Dit werk bestaat uit twee delen:1) Fenotypering van mosvezel synapsen van de hippocampus in VAMP7 KO muizenVAMP7 is een vesicle-SNARE van de longin familie van belang bij de groei vanneurieten tijdens de ontwikkeling. In de volwassen hersenen, wordt VAMP7 verrijkt ineen subset van zenuwuiteinden, vooral in de mosvezel van de hippocampus. Weanalyseerden VAMP7 functie in neurotransmitter afgifte door het karakteriseren vanbasale en opgeroepen transmissie bij deze synaps in KO muizen. Eerder is algesteld dat gebrek aan VAMP7 niet leidt tot grote ontwikkelings- of neurologischeafwijkingen (Sato et al., 2011; Danglot et al., 2012). Presynaptische mechanismenvan korte termijn plasticiteit in de mosvezel van de hippocampus lijken ookonaangetast te zijn, de mogelijke redenen hiervoor zullen worden besproken.2) CA3 circuits onderzocht met behulp van RABV-tracing en gekoppelde opnamesWe ontwikkelden een techniek om gekoppelde opnames tussen korelcellen van degyrus dentatus en aangesloten CA3 piramidale cellen (KC-CA3) op zogenaamde‗mouse hippocampal organotypic slice cultures‘ te meten. Om rechtstreeksepresynaptische partners te identificeren van een specifieke CA3 piramidale cel,combineerden we single-cell electroporation (SCE) en mono-trans-synaptic tracingop basis van een pseudo-typed, recombinant rabiësvirus (EnvA pseudogetypedRABV ΔG). Met behulp van SCE transfecteerde we één CA3 piramidale cel per slicemet plasmiden die coderen voor: het RABV glycoproteïne-envelop (RG), eenfluorescerende reporter, en TVA (de aan EnvA verwante oppervlakte receptor diegeen homoloog in zoogdiercellen heeft). De slices werden vervolgens geïnfecteerdmet ENVA pseudogetyped RABV ΔG. Na 3-4 dagen bracht de RABV mono-transsynaptischetracing de presynaptische ingangen van die ene neuron aan het licht.Hierna konden we gekoppelde opnames doen tussen verbonden KC-CA3 cellen.Daarnaast konden we de presynaptische partners van de starter CA3 pyramidale celkwantificeren.