京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(生命科学) / 乙第12780号 / 論生博第6号 / 新制||生||38(附属図書館) / 30763 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 垣塚 彰, 教授 豊島 文子, 教授 松本 智裕 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une pathologie hématologique dont le pronostic reste très défavorable, malgré les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-tendant son développement. Identifier de nouvelles stratégies anti-leucémiques représente donc une étape clé dans la concrétisation des avancées thérapeutiques. Grâce à la combinaison de plusieurs approches de criblage génétiques et pharmacologiques, l’objectif de ma thèse a été de définir et valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans les LAM. La première partie de ma thèse a eu pour but de transposer en clinique l’inhibition de la Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3). La stabilisation de la β-caténine secondaire à l'inhibition concomitante des deux paralogues de GSK3, représente un obstacle à l’utilisation clinique de cette classe thérapeutique. Mettant à profit la présence d'un «switch» Asp133 à Glu196 dans les domaines de liaison ATP de GSK3, nous avons identifié un inhibiteur sélectif du paralogue GSK3α et mené des études précliniques validant le BRD0705 comme nouveau traitement pro-différenciant dans les LAM. De plus, une combinaison de profilage métabolomique et d'approches de criblage haut débit à l’aide d’une banque de shRNA a permis d'identifier un nouveau lien entre EVI-1, la voie de la créatine kinase et la voie de signalisation GSK3. La deuxième partie de ma thèse a porté sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques en utilisant une approche de criblage par banque de shRNA dans le modèle murin de LAM porteur de la translocation MLL-AF9. VCP, une AAA-ATPase, a ainsi été identifiée puis validée comme cible thérapeutique. Nous avons montré que VCP orchestre la génération d'une plateforme à ADN simple brin recouverte de RPA, ce qui entraîne l'activation de la kinase ATM et la HR. Dans leur ensemble, nos découvertes permettent une meilleure compréhension de la biologie des LAM et participeront ainsi à l’amélioration des traitements futurs de cette pathologie. / Despite the significant progress made in understanding Acute Myeloid Leukemia oncogenesis over the last decades, this disease remains devastating and the overall five-year survival does not exceed 17%. Developing new translational research strategies focused on the identification of druggable oncogenic targets is critical to continued progress in AML treatment. The goal of this work was to define and validate novel leukemia-specific dependencies using small-molecule inhibitors and RNA-interference-based high-throughput screening methods.The first part of my thesis work aimed at translating Glycogen synthase kinase 3 (GSK3) inhibition into the clinic. Mechanism-based toxicities, driven in part by the inhibition of both GSK3 paralogs and subsequent β-catenin stabilization, were a concern in the clinical translation of this target candidate. Specific knock-down of GSK3α or GSK3β alone does not increase β-catenin, thereby offering a conceptual resolution to GSK3 targeting. The design of selective ATP-competitive inhibitors posed a drug discovery challenge due to the high homology in the GSK3α and GSK3β ATP binding domains. Taking advantage of an Asp133 ® Glu196 “switch” in the GSK3 paralog hinge binding domains, we identified a first-in-class GSK3α selective inhibitor and conducted preclinical studies validating BRD0705 as a promising new differentiation therapy in AML. In addition, a combination of a metabolomic profiling and a pooled shRNA screening method identified a new interplay between the oncogene EVI-1, the creatine kinase pathway and GSK3 signaling. The second part of my studies focused on identification of new therapeutic targets using an in vivo pooled shRNA screening approach in the MLL-AF9-driven AML mouse model. VCP, an AAA-ATPase, was thus identified and validated as a top target. We demonstrated that VCP orchestrates RPA-coated-single-stranded-DNA platform generation, resulting in ATM kinase activation and subsequent HR. Taken together, our discoveries increased our understanding of AML biology and may therefore contribute to novel and more efficacious treatments for this highly aggressive and lethal disease.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第23553号 / 生博第464号 / 新制||生||62(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 垣塚 彰, 教授 井垣 達吏, 教授 豊島 文子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(生命科学) / 乙第12778号 / 論生博第4号 / 新制||生||38(附属図書館) / 30761 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 垣塚 彰, 教授 米原 伸, 教授 井垣 達吏 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25160号 / 医博第5046号 / 新制||医||1070(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙橋 良輔, 教授 渡邊 直樹, 教授 林 康紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Lors d'un stress, les cellules activent un mécanisme de défense appelé “la réponse au stress”. Ce mécanisme empêche notamment l'accumulation de protéines mal enroulées grâce à la synthèse des protéines du choc thermique, les HSPs (Heat Shock Proteins),via l'activation du facteur de transcription HSF1 (Heat Shock Factor 1). Les HSPs empêchent l'agrégation des protéines et aident au repliement protéique. Deux partenaires associés à HSF1 ont récemment été identifiés : le chaperon moléculaire VCP (Valosin Containing Protein) et l'histone déacétylase 6 (HDAC6). Notre projet était d'étudier les rôles d'HDAC6 et de VCP dans la réponse au stress thermique. Nous avons mis en évidence un rôle prépondérant du domaine de fixation à l'ubiquitine d'HDAC6 dans la régulation de la durée d'activation d'HSF1 suite à un choc thermique. Lorsque HDAC6 ne peut pas se fixer à l'ubiquitine, VCP favorise une inactivation rapide de HSF1 empêchant la transcription du chaperon HSP25. Ces travaux montrent également que la réponse activée suite à un stress dépend de la nature de celui-ci. En effet, nous avons montré que les mécanismes activés dans la réponse au stress suite à un choc thermique sont différents de ceux activés suite à une inhibition du protéasome. La myopathie à corps d'inclusion associée à la maladie osseuse de Paget et à une démence fronto-temporale, appelée IBMPFD, Inclusion Body Myopathy associated with Paget disease of the bone and Frontotemporal Dementia, est une maladie autosomale dominante rare. La myopathie est la caractéristique clinique la plus commune parmi celles qui sont causées par des mutations de VCP. La perturbation de la fonction de VCP entraîne l'accumulation de protéines poly-ubiquitinées et la formation de corps d'inclusion en partie responsables de la pathogenèse de l'IBMPFD. Nous avons montré que l'activation de la réponse au stress via un choc thermique dans des cellules murines déficientes en VCP mimant le phénotype de l'IBMPFD, entraîne une diminution du taux de cellules ayant des agrégats de protéines poly-ubiquitinées. Nos résultats préliminaires montrent que HSF1 ne serait pas à l'origine de cette diminution des agrégats au contraire de HSP90 et HDAC6 qui interviendraient suite à l'activation de la réponse au stress. Cette stratégie est actuellement en cours de test sur des modèles murins. / Under stress, cells activate a defense mechanism named “cellular stress response”. This mechanism prevents especially unfolded proteins accumulation thanks to Heat Shock Proteins (HSPs) synthesis through the activation of Heat Shock Factor 1 (HSF1) transcription factor. HSPs prevent aggregation and help protein refolding. Two partners associated to HSF1, have recently been identified: the molecular chaperone, VCP (Valosin Containing Protein) and the Histone DeACetylase 6 (HDAC6). Our project was to characterize the roles of HDAC6 and VCP in the Heat Shock Response (HSR). We have highlighted a preponderant role for the HDAC6 ubiquitin binding domain in the HSF1 activation time regulation after a heat shock. When HDAC6 can't bind ubiquitin, VCP promotes a rapid HSF1 inactivation preventing HSP25 chaperone transcription. This work also emphasizes a stimulus-dependent stress response. Indeed, we showed that mechanisms activated during the stress response following a heat shock differ from those activated after a proteasome inhibition. Inclusion Body Myopathy, Paget disease of the bone, and Frontotemporal Dementia (IBMPFD) is a rare autosomal dominant disorder. Myopathy is the most common clinical feature of IBMPFD. It is caused by mutations of VCP. Alteration of VCP function leads to the accumulation of poly-ubiquitinated proteins and to the formation of inclusion bodies thought to be responsible, at least in part, for the pathogenesis of IBMPFD. We have shown that activation of the heat shock stress response in mouse cells VCP deficient mimicking IBMPFD phenotype, results in the decrease of cells with ubiquitinated protein aggregates. Our preliminary results show that HSF1 is not responsible for this decrease unlike HSP90 and HDAC6 that seems to intervene following the stress response activation. This strategy is currently tested on mouse models.

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La protéine p97/VCP est un membre de la famille des ATPase AAA+ et joue un rôle majeur dans de nombreux processus cellulaires tel que le contrôle de l’homéostasie protéique ou de fonctions associées à la chromatine (transcription, réplication, dommage à l’ADN, progression du cycle cellulaire). De plus, la protéine p97/VCP est impliquée dans un nombre croissant de maladies dont les cancers où il a été montré qu’elle contribue à l’homéostasie protéique et l’adaptation au stress oncogéniques. En effet, l’expression de la protéine p97/VCP est augmentée dans de nombreux cancers et dans certains cas corrèle avec une récurrence de la tumeur et un mauvais pronostique pour les patients. Cependant, le mécanisme moléculaire précis par lequel la protéine p97/VCP régule l’homéostasie protéique des cellules tumorales reste incertain. Pour remédier à cela, nous avons démontré un rôle de la protéine p97/VCP dans le contrôle de l’expression des gènes lors du stress du Réticulum Endoplasmique (RE). Nous avons trouvé que en conditions basales, la protéine RuvBL2 fait partie d’un complexe remodeleur de la chromatine qui contient les protéines HDAC1 et mSin3A et agit comme un répresseur des gènes de stress du RE. De plus, nous avons identifié le gène Gli1, un effecteur connu de la voie de signalisation Hedgehog comme cible de la protéine p97/VCP et du complexe RuvBL2-HDAC1-mSin3A. Ainsi en condition de stress du RE, la voie de signalisation Hedgehog qui a été impliqué dans le développement de cancers est activée. Globalement, nos travaux indiquent que p97/VCP agit comme un interrupteur moléculaire pour inactiver le complexe répresseur RuvBL2-HDAC1 en condition de stress du RE et ainsi activer les gènes de stress du RE et de la voie de signalisation Hedhehog de façon non-canonique. / P97/VCP is a member of the AAA+ ATPase family that plays major roles in various cellular processes including control of protein homeostasis and chromatin-associated functions (transcription, replication, DNA damage, cellular cycle progression). Moreover, p97/VCP is involved in a growing number of diseases including cancers in which it has been shown to contribute to protein homeostasis and adaptation to oncogenic stresses. Indeed, p97/VCP expression is increased in numerous cancers and in some cases correlates with tumor recurrence and poor prognosis for patients. However, the precise mechanism by which p97/VCP regulates tumor cell proteostasis remains unclear. To address this, we demonstrated a role of p97/VCP in gene expression control upon endoplasmic reticulum (ER) stress. We found that in basal conditions, RuvBL2 is part of chromatin remodeler complex that included HDAC1 and mSin3A and act as a repressor of ER stress genes. However under ER stress, ubiquitinylated RuvBL2 is degraded by p97/VCP thus causing activation of ER stress genes. Moreover, we have identified GLI1, a known effector of Hedgehog signaling, as a target of the p97/VCP and RuvBL2-HDAC1-mSin3A complex. As a result under ER stress conditions, the Hedgehog pathway which have been linked to cancer development is non-canonically activated. Overall, our work indicated that p97/VCP acts as a molecular switch to inactivate RuvBL2-HDAC1 repressor complex under ER stress thus activating ER stress genes and Hedgehog genes in a non-canonical manner.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative lente, progressive et irréversible. Elle est principalement caractérisée par deux lésions histopathologiques : les dégénérescences neurofibrillaires, causées par l’accumulation intraneuronale d'agrégats de protéines Tau hyper- et anormalement phosphorylées ; et les dépôts amyloïdes parenchymateux, constitués d’agrégats de peptides amyloïdes (Aβ) issus du clivage de la protéine précurseur du peptide amyloïde (APP). À ces deux lésions s'ajoute entre autres une dérégulation de l'homéostasie protéique et des systèmes de dégradation des protéines : protéasome, autophagie et voie endosome/lysosome qui sont les mécanismes principaux mis en jeu pour l'élimination des agrégats protéiques. Plusieurs études suggèrent que la surproduction et l'agrégation des peptides Aβ sont les causes principales de la MA. Ainsi, la réduction de leur production et/ou l’amélioration de leur clairance représentent des stratégies potentielles pour le développement de traitement contre la MA. Les objectifs de mes travaux de thèse furent d’étudier de façon plus approfondie l’implication respective des voies de dégradation de l’APP et de ses métabolites ; de déterminer le mode d’action biologique de dérivés chimiques de la chloroquine sur le métabolisme de l’APP en relation avec la Valosin-Containing protéine (VCP), supposée être la cible de ces molécules, et par la même occasion d’étudier la relation existante entre l’APP et VCP. Dans un premier temps, nous avons pu démontrer que l’APP et ses fragments carboxyterminaux (APP-CTFs) étaient principalement dégradés par deux voies : la g-sécrétase et la voie endolysosome. Ensuite, nous avons démontré que VCP régulait le trafic intracellulaire de l’APP. Enfin, nous avons découvert que l’action des molécules était indépendante de la protéine VCP et qu’il s’agissait de modulateurs indirects de l’activité β-sécrétase permettant ainsi de réduire la sécrétion de peptides Aβ. En conclusion, ces travaux ont permis de contribuer à une meilleure compréhension du métabolisme de l’APP et de ses processus de dégradation ainsi que de caractériser l’effet biologique de nouveaux inhibiteurs indirects de la β-sécrétase. / Alzheimer's disease (AD) is a slow, progressive and irreversible neurodegenerative disease. There are two histopathological hallmarks found in AD brains: neurofibrillary tangles, caused by the intraneuronal accumulation of Tau protein aggregates in a hyper- and abnormally phosphorylated form; and amyloid deposits in the brain parenchyma which are mainly composed of amyloid peptides (Aβ) aggregates derived from the cleavage of the amyloid precursor protein (APP). AD physiopathology also includes a deregulation of protein homeostasis and degradation systems: proteasome, autophagy and the endosome/lysosome pathway, which are the main processes involved in the elimination of protein aggregates. Many evidences suggest that overproduction and aggregation of Aβ peptides are the main causes of AD and that strategies aiming to reduce their production and/or improve their clearance represent attractive approaches for AD therapeutics. Thus, this thesis aimed to study the respective contribution of g-secretase, proteasome and lysosomes in APP degradation; to determine the biological mode of action of chloroquine derivatives on APP metabolism in relationship with the Valosin-Containing Protein (VCP), supposed to be the target of these molecules, and at the same time, to study the relationship between APP and VCP. First, we have demonstrated that APP and its carboxy-terminal fragments (APP-CTFs) were mainly degraded by two pathways: g-secretase and the endosome/lysosome pathway. Next, we showed that VCP was involved in APP trafficking and processing. Finally, we have discovered that the action of our molecules does not depend on VCP but that they are indirect modulators of the β-secretase activity, reducing Aβ peptides secretion. In conclusion, this work contributed to a better understanding of APP metabolism and its degradation processes but also to characterize the biological effects of new indirect β-secretase inhibitors.

Signaling scaffolds are critical for the correct spatial organization of enzymes within the ERK1/2 signaling pathway and proper transmission of intracellular information. However, mechanisms that control molecular dynamics within scaffolding complexes, as well as biological activities regulated by the specific assemblies, remain unclear. The scaffold protein Shoc2 is critical for transmission of the ERK1/2 pathway signals. Shoc2 accelerates ERK1/2 signaling by integrating Ras and RAF-1 enzymes into a multi-protein complex. Germ-line mutations in shoc2 cause Noonan-like RASopathy, a disorder with a wide spectrum of developmental deficiencies. However, the physiological role of Shoc2, the nature of ERK1/2 signals transduced through this complex or mechanisms regulating the function of Shoc2 remain largely unknown. My dissertation addresses the mechanisms by which Shoc2 accelerates ERK1/2 signal transmission and the biological outputs of the Shoc2-guided signals. To delineate Shoc2-mediated ERK1/2 signals, I have utilized a vertebrate zebrafish model. I demonstrated that loss of Shoc2 protein expression leads to early embryonic lethality resulting from a significant reduction in the number of circulating erythropoietic and myelopoietic blood cells, underdeveloped neurocranial and pharyngeal cartilages, and a profound delay in calcification of bone structures. Together, this data demonstrates that the Shoc2 scaffolding module transmits ERK1/2 signals in neural crest development and blood cell differentiation. This dissertation also addresses the mechanistic basis of how allosteric ubiquitination of Shoc2 and RAF-1 is controlled. I have characterized a molecular interaction of Shoc2 with its previously unknown binding partner Valosin-Containing Protein (VCP/p97). These studies demonstrated that hexametric ATPase VCP modulates ubiquitination of Shoc2 and RAF-1 through the remodeling of the scaffolding complex in a spatial-restricted manner. Experiments utilizing fluorescence microscopy and biochemical methods show that VCP/p97 sequesters the E3 ligase HUWE1 from the Shoc2 module, thereby altering the ubiquitination of Shoc2 and RAF-1 as well as the amplitude of ERK1/2 signals. These studies also show that the levels of Shoc2 ubiquitination and ERK1/2 phosphorylation are imbalanced in fibroblasts isolated from Inclusion Body Myopathy with Paget’s disease of bone and Frontotemporal Dementia (IBMPFD) patients harboring VCP germline mutations. This data also suggests that ERK1/2 pathway deregulation is part of IBMPFD pathogenesis. In summary, these studies make a significant advance in our understanding of the mechanisms by which the Shoc2 scaffold regulates specificity and the dynamics of the ERK1/2 signaling networks. They also make important insights into our understanding of biological activities and targets of Shoc2-mediated ERK1/2 signals at the early stages of embryonic development and disease.