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Implication des systèmes de dégradation cellulaire, de la protéine VCP et de nouvelles molécules sur le métabolisme de l’APP : aspects fondamentaux et appliqués à la maladie d’Alzheimer / Implication of degradation systems, the Valosin-Containing Protein and new drugs on APP metabolism : fundamental and applied aspects to Alzheimer's disease

Evrard, Caroline 20 November 2018 (has links)
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative lente, progressive et irréversible. Elle est principalement caractérisée par deux lésions histopathologiques : les dégénérescences neurofibrillaires, causées par l’accumulation intraneuronale d'agrégats de protéines Tau hyper- et anormalement phosphorylées ; et les dépôts amyloïdes parenchymateux, constitués d’agrégats de peptides amyloïdes (Aβ) issus du clivage de la protéine précurseur du peptide amyloïde (APP). À ces deux lésions s'ajoute entre autres une dérégulation de l'homéostasie protéique et des systèmes de dégradation des protéines : protéasome, autophagie et voie endosome/lysosome qui sont les mécanismes principaux mis en jeu pour l'élimination des agrégats protéiques. Plusieurs études suggèrent que la surproduction et l'agrégation des peptides Aβ sont les causes principales de la MA. Ainsi, la réduction de leur production et/ou l’amélioration de leur clairance représentent des stratégies potentielles pour le développement de traitement contre la MA. Les objectifs de mes travaux de thèse furent d’étudier de façon plus approfondie l’implication respective des voies de dégradation de l’APP et de ses métabolites ; de déterminer le mode d’action biologique de dérivés chimiques de la chloroquine sur le métabolisme de l’APP en relation avec la Valosin-Containing protéine (VCP), supposée être la cible de ces molécules, et par la même occasion d’étudier la relation existante entre l’APP et VCP. Dans un premier temps, nous avons pu démontrer que l’APP et ses fragments carboxyterminaux (APP-CTFs) étaient principalement dégradés par deux voies : la g-sécrétase et la voie endolysosome. Ensuite, nous avons démontré que VCP régulait le trafic intracellulaire de l’APP. Enfin, nous avons découvert que l’action des molécules était indépendante de la protéine VCP et qu’il s’agissait de modulateurs indirects de l’activité β-sécrétase permettant ainsi de réduire la sécrétion de peptides Aβ. En conclusion, ces travaux ont permis de contribuer à une meilleure compréhension du métabolisme de l’APP et de ses processus de dégradation ainsi que de caractériser l’effet biologique de nouveaux inhibiteurs indirects de la β-sécrétase. / Alzheimer's disease (AD) is a slow, progressive and irreversible neurodegenerative disease. There are two histopathological hallmarks found in AD brains: neurofibrillary tangles, caused by the intraneuronal accumulation of Tau protein aggregates in a hyper- and abnormally phosphorylated form; and amyloid deposits in the brain parenchyma which are mainly composed of amyloid peptides (Aβ) aggregates derived from the cleavage of the amyloid precursor protein (APP). AD physiopathology also includes a deregulation of protein homeostasis and degradation systems: proteasome, autophagy and the endosome/lysosome pathway, which are the main processes involved in the elimination of protein aggregates. Many evidences suggest that overproduction and aggregation of Aβ peptides are the main causes of AD and that strategies aiming to reduce their production and/or improve their clearance represent attractive approaches for AD therapeutics. Thus, this thesis aimed to study the respective contribution of g-secretase, proteasome and lysosomes in APP degradation; to determine the biological mode of action of chloroquine derivatives on APP metabolism in relationship with the Valosin-Containing Protein (VCP), supposed to be the target of these molecules, and at the same time, to study the relationship between APP and VCP. First, we have demonstrated that APP and its carboxy-terminal fragments (APP-CTFs) were mainly degraded by two pathways: g-secretase and the endosome/lysosome pathway. Next, we showed that VCP was involved in APP trafficking and processing. Finally, we have discovered that the action of our molecules does not depend on VCP but that they are indirect modulators of the β-secretase activity, reducing Aβ peptides secretion. In conclusion, this work contributed to a better understanding of APP metabolism and its degradation processes but also to characterize the biological effects of new indirect β-secretase inhibitors.
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Caractérisation des fonctions des modifications post-traductionnelles de PCNA à l'aide d'un nouvel outil génétique / Characterization of PCNA’s post-translational modification functions using a new genetic tool

Dietsch, Frank 09 April 2019 (has links)
PCNA est une protéine essentielle qui intervient dans de nombreux mécanismes cellulaires et qui possède de nombreuses modifications post-traductionnelles (MPTs) dont les fonctions de certaines, restent encore inconnues. Afin d’étudier la fonction de ces MPTs, nous avons développé un nouvel outil génétique permettant in cellulo, de substituer la protéine endogène PCNA par une version mutée de la protéine appelée version de complémentation. La technique consiste à cotransfecter des cellules en culture avec deux types de plasmides. Un premier plasmide permet l’invalidation du gène de PCNA endogène dans les cellules transfectées par le système CRISPR-Cas9. Le deuxième plasmide dit de complémentation permet l’expression d’une forme mutée de PCNA. Sur l’ensemble d’une banque de mutants testés, deux mutants de PCNA se sont avérés être létaux (D122A et E124A). Nous avons démontré que ces deux sites sont impliqués dans l’initiation d’une voie de dégradation ubiquitine dépendante CRL4Cdt2 essentielle pour la mise en place de la protéolyse d’un cocktail de protéines (cdt1, p21, set8) durant la phase S. Nous avons démontré que les cellules mutantes pour PCNA (D122A et E124A) accumulent la protéine p21. Ce défaut de dégradation de p21 provoque alors des évènements de re-réplication menant à terme à la mort des cellules mutantes. / PCNA is an essential protein that is involved in many cellular mechanisms and has many post-translational modifications (PTMs). The functions of some PTMs, still remain unknown. In order to study the function of these PTMs, we have developed a new genetic tool allowing, in cellulo, the substitution of endogenous PCNA protein with a mutated version of the protein named complementation version. The technique involves cotransfection of the cells in culture with two types of plasmids. A first plasmid allows invalidation of the endogenous PCNA gene in transfected cells by the CRISPR-Cas9 system. The second plasmid, named complementation plasmid allows the expression of a mutated form of PCNA. In the whole bank of tested mutants, two PCNA mutants were found to be lethal (D122A and E124A). We have demonstrated that these two sites are involved in the initiation of an ubiquitin-dependent protein degradation CRL4Cdt2 pathway essential for the proteolysis of a protein cocktail (cdt1, p21, set8) during the S phase. We demonstrated that PCNA mutant cells (D122A and E124A) accumulate p21 protein. This lack of degradation of p21 then causes re-replication events leading ultimately to the mutant cells death.

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