Orientador: Selma Giorgio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T16:29:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_WagnerWelberArraisda_D.pdf: 2543782 bytes, checksum: d4c1a96c9dabbacb3872004b7f017fb8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Nas infecções com o parasito do gênero Leishmania a incapacidade da célula hospedeira destruir os amastigotas leva à lesão a cronificar-se. A persistência e o aumento da carga parasitária levam a formação de um granuloma macrofágico, que resulta em áreas de inadequada perfusão e conseqüente alteração do microambiente tecidual. Assim, neste trabalho avaliamos durante a evolução da lesão de camundongos infectados com L amazonensis a expressão das proteínas HIF-1a e VEGF, que respondem ao estresse microambiental. Paralelamente, investigamos protocolos terapêuticos com HBO que modulem a curva de crescimento da lesão em modelos animais da infecção por Leishmania amazonensis. A expressão de HIF-1a ocorreu nas fases iniciais, crônicas e fases finais da infecção murina com L. amazonensis. Nas lesões cutâneas de camundongos da linhagem BALB/c a expressão de HIF-1a foi de localização difusa na lesão, enquanto que a expressão de HIF- 1a em lesões cutâneas da linhagem C57Bl/6 foi em forma de cluster restrita aos macrófagos parasitados. A expressão de VEGF nas lesões de ambas linhagens de camundongos foi discreta durante todo o período experimental e não aumentou com o tempo de infecção. O tratamento com oxigênio hiperbárico mostrou efeito deletério sobre formas promastigotas aumentando o acúmulo de lipídios citoplasmáticos e o nível de apoptose. O oxigênio hiperbárico diminuiu os efeitos patológicos e modulou a resposta imune. Concluímos que a expressão de HIF-1a durante a evolução da lesão leishmaniótica não está diretamente relacionada à expressão de VEGF e pode ser resultado de múltiplos fatores, que incluem fatores hipóxicos e não hipóxicos. Sugerimos também que o tratamento hiperbárico é capaz de modular a resposta imunológica e diminuir a progressão da lesão durante a leishmaniose murina / Abstract: The incapacity of host cell in killing amastigotes during Leishmania infections causes to chronic lesions. The increase of parasite burden leaves to macrophage accumulation and consequently granuloma formation that result in inadequate perfusion and tissue microenvironment alterations. Thus, in this work we evaluated the HIF-1a and VEGF expression, proteins that responses for environmental stress, during the course of L.amazonensis infection. We also investigated protocols for hyperbaric oxygen therapy that module the lesion progress in animal models infected with L. amazonensis. HIF-1a expression occurred in the early, chronic and in final stages of murine infection with L. amazonensis. BALB/c mice lesions showed a homogeneous expression of HIF-1a while footpads from C57Bl/6 mice showed HIF-1a expression restrict in clusters of heavily infected macrophages. The VEGF expression was not correlated to the evolution of lesion or the HIF-1 production in both stains. The hyperbaric oxygen treatment showed deleterious effects on promastigotes increasing cytoplasmtic lipids and apoptosis level. The HBO decreased pathological effects and modulated the immune response. The results suggest that the HIF-1a expression during lesion progress induced by L.amazonensis in both murine strains is the result of multiple factors, including hypoxic and non hypoxic factors. There is no direct relation between HIF-1a and VEGF expression during experimental cutaneous leishmaniasis. We also indicated that hyperbaric oxygen therapy was able to modulate immune response and decrease of lesion progress during murine leishmaniasis / Doutorado / Doutor em Parasitologia

L’angiogenèse est définie comme la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux sanguins pré-existants. Elle contribue à l’extension du réseau vasculaire et assure ainsi l’efficacité des échanges gazeux et du transport des cellules, nutriments, métabolites et molécules de signalisation vers les tissus. L’angiogenèse par bourgeonnement passe par la spécification d’une cellule endothéliale en cellule meneuse et la formation d’un réseau de cellules suiveuses à la base du bourgeon vasculaire. Toute perturbation de ce mode de néovascularisation génère des vaisseaux fortement tortueux, immatures et non-étanches qui soit affectent les fonctions physiologiques des organes en causant ainsi des pathologies potentiellement fatales, ou accélèrent la progression des conditions telles que le cancer. Dans l’oeil, l’angiogenèse pathologique des vaisseaux choroïdiens et rétiniens cause une perte de la vue. Particulièrement, la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) de type néovasculaire, une maladie oculaire caractérisée par le bourgeonnement anormal de la choroïde dans l’espace sous-rétinien, représente la cause majeure de cécité au sein des populations des pays industrialisés. Les thérapies conventionnelles contre la DMLA humide reposent sur l’usage des médicaments qui ciblent la signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Bien que démontrant des résultats cliniques, ces traitements anti-VEGFs sont invasifs et présentent multiples effets secondaires. Par ailleurs, ils n’induisent aucun effet chez une portion des patients traités. De ces faits, il existe présentement un grand besoin de thérapies alternatives aux anti-VEGFs. De façon intéressante, la protéine de morphogénèse osseuse 9 (BMP9), qui active son récepteur “activin receptor-like kinase 1” (ALK1), régule l’angiogenèse développementale des vaisseaux rétiniens de l’oeil de la souris. Par ailleurs, les mutations au sein du BMP9, de son récepteur ALK1 ou de ses intermédiaires de signalisation sont associées à la morphogénèse anormale des vaisseaux qui contribue ultimement à la pathogénèse de diverses maladies néovasculaires. De façon additionnelle, le récepteur ALK1 au BMP9 est restreint à la cellule endothéliale; contrairement à ceux des ligands angiogéniques tels que le VEGF, exprimés par une diversité de cellules. Par ailleurs, au sein de cette cellule, le BMP9 contribue à la régulation des phénotypes meneur et suiveur qui sont induits par le VEGF et requis pour le déroulement de l’angiogenèse par bourgeonnement. De ces faits qui précèdent, nous avons émis l’hypothèse du rôle du BMP9 dans la régulation de la néovascularisation pathologique relative à la DMLA humide. Ainsi, les travaux de la présente thèse déterminent spécifiquement l’effet du BMP9 sur l’angiogenèse pathologique à l’aide des modèles oculaires pertinents à la DMLA humide et examine aussi sa base mécanistique. Les travaux de cette thèse démontrent l’effet anti-angiogénique du BMP9 sous les conditions expérimentales de néovascularisation choroïdienne induite au laser (CNV) et de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). Ils montrent aussi les effets régulateurs de la signalisation du BMP9 sur les voies de signalisation endothéliales du VEGF et de Notch, respectivement de façon dépendante de VEGFR1 et de JAG1. En somme, les présentes études démontrent les effets anti-angiogéniques du BMP9 sur la néovascularisation pathologique relative à la DMLA humide et identifient les facteurs moléculaires qui contribuent à son action inhibitrice du bourgeonnement vasculaire induit par le VEGF. / Angiogenesis is defined as the formation of new capillaries from existing blood vessels. It extends the vasculature and thereby sustains the efficient exchange of gases and transport of cells, nutrients, metabolites and signalling molecules to tissues. Sprouting angiogenesis proceeds through the selective specification of an endothelial cell into a leading tip cell and the formation of stalk cells at the base of the sprout. A disturbance in this modality of neovascularisation leads to highly tortuous, immature and leaky vessels that either impair the physiological functions of organs, thereby causing life-threatening diseases, or accelerate the progression of conditions such as cancer. In the eye, the pathological angiogenesis of choroidal and retinal vessels specifically results in vision loss. Particularly, the neovascular form of the age-related macular degeneration (AMD), an ocular disease characterized by the abnormal sprouting of the choroidal network into the subretinal space, represents the leading cause of blindness in populations of industrialized countries. Conventional therapies against wet AMD are based on drugs that target the signaling of the vascular endothelium growth factor (VEGF). Despite their clinical achievements, the anti-VEGFs treatments are invasive and show multiple adverse effects. Moreover, they are not effective in a portion of treated patients. Thus, there currently is a substantial need of therapy alternatives to anti-VEGFs. Interestingly, the bone morphogenetic protein 9 (BMP9), that activates its activin receptor-like kinase 1 (ALK1) transducer, regulates the developmental angiogenesis of the mouse eye retina vasculature. Moreover, mutations in BMP9, its receptor ALK1 or its signaling mediators correlate with the abnormal vessel morphogenesis that ultimately drives the pathogenesis of various neovascular diseases. Additionally, the BMP9-specific receptor ALK1 is restricted to endothelial cells; in contrast to those of neovascularisation-inducing ligands such as VEGF, expressed by a range of cells. Particularly within these cells, BMP9 contributes to regulate the VEGF-induced tip/stalk phenotypes required for sprouting angiogenesis. Given the aforementioned, we hypothesized the role of BMP9 in regulating the pathological angiogenesis associated with wet AMD. Thus, the studies from the current thesis specifically determine the effect of BMP9 on pathological NV using ocular models relevant to AMD and further investigate its mechanical basis. The current work demonstrates the antiangiogenic effects of BMP9 under experimentally induced oxygen-induced retinopathy (OIR) and laser-induced choroid neovascularisation (CNV) conditions. Moreover, this thesis shows the regulatory effects of BMP9 signaling on the VEGF and Notch endothelial pathways, respectively in VEGFR1 and JAG1 -dependent manners. Collectively, the current studies demonstrate the anti-angiogenic effects of BMP9 on pathological NV associated with wet AMD and identify the molecular players that mediate its inhibitory action on VEGF-mediated sprouting.

The food that we consume contain many dietary compounds which are biologically active. In this thesis we will discuss the biological effects of dietary compounds and the mechanisms behind their activities. First, we studied on the anti-metastatic effects of curcumin, a dietary compound derived from turmeric, through lymphangiogenesis inhibition. Curcumin inhibited vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C)-induced lymphangiogenesis in vivo and in vitro. Curcumin inhibited lymphangiogenesis, in part through suppression of proliferation, cell cycle progression and migration of lymphatic endothelial cells. Curcumin inhibited expressions of VEGF receptors (VEGFR2 and VEGFR3), as well as down-stream signaling such as phosphorylation of ERK and FAK. Finally, curcumin sulfate and curcumin glucuronide, two major metabolites of curcumin in vivo, had little inhibitory effect on proliferation of HMVEC-dLy cells. Our results demonstrate that curcumin inhibits lymphangiogenesis in vitro and in vivo, which could contribute to the anti-metastatic effects of curcumin. Next, we investigated the mechanisms underlying the cytotoxic activity of tert-butylhydroquinone (TBHQ), a widely used synthetic food antioxidant. Here we found that the biological effects of TBHQ are mainly mediated by its oxidative conversion to a quinone metabolite tert-butylquinone (TBQ). Co-addition of cupric ion (Cu2+) enhanced, whereas ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) suppressed the oxidative conversion of TBHQ to TBQ, and the biological activities of TBHQ in MC38 colon cancer cells. Finally, a structure and activity relationship study was done and together, these results suggest that the biological activities of TBHQ and other para-hydroquinones are mainly mediated by their oxidative metabolism to generate more biologically active quinone metabolites.

Le Demodex, petit acarien vivant dans les follicules pilo-sébacés de tous les humains adultes, est reconnu responsable des démodécies chez l’homme mais n’est considéré dans la rosacée, au plus, que comme un facteur aggravant potentiel d’une inflammation préexistante. Toutes nos observations, depuis 1983, convergent vers la confirmation de son rôle pathogène dans la rosacée, et suggèrent des liens physiopathologiques clairs entre rosacées avec papulopustules (RPP) avec ou sans érythème permanent, rosacée érythématotélangiectasique (RET), pityriasis folliculorum et autres démodécies. (1) Dans les biopsies cutanées, le Demodex est associé à l’inflammation périfolliculaire. (2) Le concept de densité en Demodex a été introduit et une méthode de prélèvement standardisée permettant de mesurer cette densité a été développée, puis perfectionnée. (3) Elle a permis de montrer que cette densité était nettement supérieure chez les patients atteints de démodécie et de RPP, que chez ceux avec peau saine et ceux atteints d’autres dermatoses faciales, les patients avec RPP sans prolifération en Demodex étant exceptionnels. (4) Un test diagnostique hautement spécifique et sensible, utilisable facilement en consultation a été élaboré et validé. (5) Des signes cliniques discrets de ces dermatoses ont été mis en évidence, de même que la grande fréquence des démodécies en consultation de dermatologie (alors qu’elles sont très peu diagnostiquées). (6) L’effet acaricide sur le Demodex de six traitements topiques a été comparé in vivo et les meilleures molécules ont été utilisées pendant une vingtaine d’années :sur base des résultats collectés, l’efficacité du traitement a été démontrée, non seulement sur la densité en Demodex mais également sur les symptômes cliniques, tant parmi les démodécies que dans la RPP, ce qui prouve indirectement que la prolifération en parasites n’est pas un épiphénomène mais est bien la cause de la maladie. (7) Parmi les modalités comparées, les plus intenses ont une efficacité plus rapide et une meilleure compliance. (8) La RET peut correspondre à une démodécie subclinique et est probablement un facteur favorisant la prolifération des parasites, tout comme le sont probablement l’hyperplasie sébacée et l’hypothyroïdie, tandis que la cortisone semble limiter leur prolifération quand celle-ci est excessive. (9) Les similarités et les confusions nosologiques entre les démodécies et les différentes formes de rosacée ont été mises en évidence, afin de montrer que ces dermatoses ne sont vraisemblablement que des phénotypes d’une seule et même maladie :ce sont toutes des démodécies. (10) Trois systèmes d’attribution d’une cause à une maladie convergent pour confirmer le rôle pathogène du Demodex dans la RPP. Nos observations doivent être confirmées par des études longitudinales et des études contrôlées, mais d’ores et déjà, ajoutées aux données actuelles de la littérature, elles nous semblent suffisantes pour reconnaître le rôle pathogène du parasite en médecine humaine et dans la rosacée en particulier. Cette reconnaissance donnerait une définition principalement étiologique à la rosacée, la classerait parmi les démodécies, et en faciliterait la prise en charge et le traitement. Nous proposons une hypothèse physiopathologique originale où le Demodex se trouve au centre d’un réseau causal « en toile d’araignée », la RPP étant considérée comme une infection chronique s’accompagnant d’épuisement lymphocytaire. / Demodex folliculorum and Demodex brevis are small mites living in the pilosebaceous follicles of all adult humans. They are known to be responsible for demodicosis in humans but in rosacea are generally considered only as a potential aggravating factor of pre-existing inflammation. However, our observations since 1983 converge towards a pathogenic role of the Demodex mite in rosacea, and suggest clear pathophysiological links between rosacea with papulopustules (PPR) with or without persistent erythema, erythematotelangiectatic rosacea (ETR), pityriasis folliculorum and other demodicoses. Summarising our findings: (1) In skin biopsies, Demodex is statistically associated with perifollicular inflammation. (2) The concept of Demodex density was introduced and a method to measure it using two consecutive standardized skin surface biopsies was developed and refined. (3) It was shown that Demodex density was significantly higher in patients with demodicosis and PPR than in those with healthy skin and with other facial dermatoses; patients with PPR without Demodex proliferation detected are rare, and the few cases that do occur likely correspond to false negative results linked to proliferation of the mites deep in the pilosebaceous follicles, thus not detected by the sampling method. (4) A highly specific and sensitive diagnostic test based on the results from two consecutive standardized skin surface biopsies was developed and validated and can be easily used during clinical consultation. (5) Less well-known clinical signs of these dermatoses were highlighted, as well as the high frequency of demodicoses in dermatologic consultations (although they are under-diagnosed). (6) The acaricidal effect of six topical treatments on Demodex was compared in vivo and the best molecules were used for about 20 years in our practice. From data collected from our patients during this time period, the efficacy of the treatment was demonstrated, not only on Demodex density but also on clinical symptoms, both in demodicosis and in PPR, indirectly showing that parasite proliferation is not an epiphenomenon, but is the cause of the disease. (7) Of the treatment modalities compared, those that were more intense worked more rapidly and had better compliance. (8) ETR may correspond to subclinical demodicosis and is probably a condition that favours parasite proliferation, as are sebaceous hyperplasia and hypothyroidism; cortisone seems initially to favour mite proliferation, but to limit it when Demodex density is very high. (9) The similarities and nosological confusion between demodicosis and the different forms of rosacea were highlighted, showing that these dermatoses are probably phenotypes of one and the same disease: they are all demodicoses. (10) Three systems used to attribute disease causality converge to confirm the pathogenic role of Demodex in PPR. Our observations need to be confirmed by longitudinal and controlled studies, but, combined with current data in the literature, they seem sufficient to recognise the pathogenic role of the parasite in human disease and in rosacea in particular. This recognition would enable a mainly aetiological definition to be given to rosacea, would classify it among the demodicoses, and would facilitate its management and treatment. We propose an original pathophysiological hypothesis in which Demodex is at the centre of a causal network, with PPR being considered a chronic infection accompanied by lymphocyte exhaustion. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Die Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff in artifiziellen, 3D Scaffolds für das Tissue Engineering ist Grundvoraussetzung für die Viabilität darin kultivierter Zellen. Die Kombination aus definierter Architektur und biomimetischer Zusammensetzung ist dabei entscheidend, sodass neben dem Stofftransport auch die Adhäsion, Proliferation, Migration und Morphologie von Zellen gesteuert werden können. Die Verwendung von Komponenten der nativen Extrazellulären Matrix, wie Collagen Typ I (COL I), als Scaffold-Material wird dafür als optimal angesehen. Jedoch stellt die Gestaltung der Architektur und Bereitstellung instruktiver Elemente zur Steuerung der Zellverhaltens bei COL I-basierten Scaffolds, aufgrund der mechanischen und biochemischen Eigenschaften des COL I, besondere Ansprüche an die Bearbeitungsverfahren. Ziel dieser Arbeit war es daher, Verfahren zur Ausstattung von modularisierbaren, COL I-basierten Membranen mit einer instruktiven biochemischen Zusammensetzung, Mikroarchitekturen als Basis für ein initiales vaskuläres System und Gradienten des Vascular Endothelial Growth Factors (VEGF) zu entwickeln. Diese Scaffolds sollten anschließend hinsichtlich der Beeinflussung des Wachstums, der Orientierung und der gerichteten Migration von humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) charakterisiert werden. COL I-Scaffolds konnten durch Plastic Compression in Membranform hergestellt und mit Fibronectin (FN) und Hyaluronsäure (HA, mit hohem Molekulargewicht) ausgestattet werden. Die Inkorporation von FN erhöhte die HUVEC-Proliferation, während die Proliferationsrate bei der verwendeten HA konstant blieb. Anisotrope Mikrostrukturen als Basis für ein vaskuläres System und zur HUVECOrientierung wurden durch einen 3-stufigen Prozess auf den COL I-Membranen erzeugt. Dabei wurde die Mikrostrukturübertragung durch mikrostrukturierte Polystyren-Stempel in einem Druckumformprozess realisiert. Die erhaltenen Mikrogräben mit Breiten von 10-40 µm beeinflussten die Orientierung der HUVEC deutlich. Für die Erzeugung von VEGF-Gradienten zur Steuerung der gerichteten Migration von HUVEC wurde ein Immersionsverfahren mit Hilfe der Modellproteine Bovines Serumalbumin und Hyaluronidase entwickelt. Dieses ermöglichte die Erzeugung eines linearen, graduellen Konzentrationsverlaufs der Modellproteine auf der Membranoberfläche. Der entwickelte Prozess konnte auf VEGF mit einem minimalen Gradientenprofil von 3,8-11,8 pg/mm² nach Immersion in 100 ng/mL VEGF-Lösung übertragen werden. Erste Versuche zur Induktion der HUVEC-Migration zeigten, dass ein erfolgreiches Gradientenprofil jedoch noch gefunden werden muss. Die erzeugten COL I-Membranen bilden eine gute Ausgangsposition für die Bereitstellung modularer, biomimetischer Tissue-Engineering-Scaffolds, mit initialer Vaskularisierung und zellinstruktiven Elementen. Außerdem besitzen sie das Potential, durch eine Vielzahl von Bio-Engineering-Methoden modifiziert und biochemisch den Anforderungen an das zelluläre Mikromilieu ausgestattet zu werden. / The supply of nutrients and oxygen in artificial, three-dimensional scaffolds for tissue engineering is a basic prerequisite for the viability of cells cultivated therein. The combination of defined architecture and biomimetic composition are crucial in this context, so that besides the metabolic transport, the adhesion, proliferation, migration and morphology of cells can also be controlled. The use of native extracellular matrix components, such as collagen type I (COL I), as scaffold material is considered optimal for this purpose. However, designing the architecture and providing instructive elements to control cell behavior in COL I-based scaffolds poses special challenges to processing methods due to the mechanical and biochemical properties of COL I. Therefore, the aim of this work was to develop basic procedures to equip modularizable COL I-based membranes with instructive biochemical composition, microarchitectures as initial vascular system, and vascular endothelial growth factor (VEGF) gradients and to characterize the obtained scaffolds with respect to influencing human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) growth, orientation, and migration. It was shown that COL I scaffolds can be prepared by Plastic Compression in membrane form and equipped with fibronectin (FN) and hyaluronic acid (HA, with high molecular weight). Incorporation of FN increased HUVEC proliferation, whereas the proliferation rate remained constant with the HA used. Anisotropic microstructures as a basis for a vascular system and for HUVEC orientation were generated by a 3-step process on the COL I membranes. In this process, the microstructure transfer was realized by microstructured polystyrene stamps in a pressure forming process. The obtained microtrenches with widths of 10-40 µm significantly affected the orientation of HUVEC. For the generation of VEGF gradients to control the directional migration of HUVEC, an immersion technique was developed using the model proteins bovine serum albumin and hyaluronidase. This allowed the generation of a linear, gradual concentration gradient of the model proteins on the membrane surface. The developed process could be applied to VEGF with a minimum gradient profile of 3.8-11.8 pg/mm² after immersion in 100 ng/mL VEGF solution. Initial experiments to induce HUVEC migration showed that a successful gradient profile still needs to be found, however. The generated COL I membranes provide a good starting point for the provision of modular, biomimetic tissue engineering scaffolds, with initial vascularization and cell-instructive elements. They also possess the potential to be modified by a variety of bioengineering methods and biochemically equipped to meet the requirements of the cellular microenvironment.

The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in cancer is well-known in the context of angiogenesis but is also important in the functional regulation of tumor cells themselves. Notably, autocrine VEGF signaling mediated by its co-receptors called neuropilins (NRPs) appears be essential for sustaining the proliferation and survival of cancer stem cells (CSCs), which are implicated in mediating tumor growth, progression and drug resistance. Therefore, the first half of this thesis focuses on the mechanism of VEGF-NRP-mediated support of CSCs. Aberrant activity of the Hippo pathway effector YAP and TAZ are associated with breast CSCs and have been shown to confer stem cell-like properties. I found that VEGF-NRP2 signaling contributes to the activation of YAP/TAZ in various breast cancer cells, which mediates a positive feedback loop that promotes mammosphere formation. VEGF-NRP2 signaling activated the GTPase Rac1, which inhibited the Hippo kinase LATS, which enabled the activity of YAP/TAZ. In complex with the transcription factor TEAD, TAZ then bound and repressed the promoter of the gene encoding the Rac GTPase-activating protein (Rac GAP) β2-chimaerin. By activating GTP hydrolysis, Rac GAPs effectively turn off Rac signaling; hence, YAP/TAZ-mediated repression of β2-chimaerin sustained Rac1 activity in CSCs. Depletion of β2-chimaerin in non-CSCs increased Rac1 activity, YAP/TAZ activation and mammosphere formation. Analysis of breast cancer patients revealed an inverse correlation between β2-chimaerin and TAZ expression in tumors. These findings highlight an unexpected role for β2-chimaerin in a feedforward loop of YAP/TAZ activation and the acquisition of CSC properties. Given that CSCs have been implicated in therapy resistance and are enriched in triple negative breast cancer (TNBC), which exhibits VEGF-NRP2 signaling, the second half of this thesis focuses on understanding the mechanism by which VEGF-NRP2 contributes to the chemoresistance of TNBC. I discovered that VEGF-NRP2 promote homologous recombination (HR) in BRCA1 wild-type TNBC cells by contributing to the expression and function of Rad51, an essential enzyme in the HR pathway that mediates efficient DNA double strand break repair. Mechanistically, I found that VEGF-NRP2 stimulates YAP/TAZ-dependent Rad51 expression and that Rad51 is a direct YAP/TAZ-TEAD transcriptional target. I also discovered that VEGF-NRP2-YAP/TAZ signaling contributes to the resistance of TNBC cells to chemotherapy and that Rad51 rescues the defects in DNA repair upon inhibition of either VEGF-NRP2 or YAP/TAZ in response to cisplatin. These findings reveal novel roles for VEGF-NRP2 and YAP/TAZ in DNA repair and they indicate a unified mechanism involving VEGF-NRP2, YAP/TAZ and Rad51 that contributes to resistance to platinum chemotherapy. In summary, this thesis provides novel insight into the roles of autocrine VEGF-NRP2 signaling in breast CSC function and therapy resistance and provides rationale in inhibiting NRP2 for platinum-resistant tumors that are dependent on YAP/TAZ activation.

Retinale Hypoxie ist ein wichtiger Faktor bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Erkrankung, die mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergeht. Das angeborene Immunsystem besitzt eine Vielzahl von Mechanismen, um pathogene Faktoren zu erkennen und zu eliminieren. Dazu gehört u.a. das NLRP3-Inflammasom, das wahrscheinlich auch bei der AMD in der Netzhaut aktiviert ist. Die Aktivierung des Inflammasoms ist ein Zweischrittprozess: der erste Schritt, das Priming, besteht in der Transkription von NLRP3-assoziierten Genen. Im zweiten Schritt kommt es zu einer Assemblierung der Inflammasombestandteile, so dass das aktivierte Inflammasom pro-IL-1ß in das biologisch aktive IL-1ß umwandelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob Hypoxie in kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE)-Zellen die Transkription und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms induziert. Es sollte auch ermittelt werden, welche Signalwege die hypoxischen Veränderungen der Genexpression von NLRP3 und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF-A) vermitteln. Dafür wurden Untersuchungen an humanen RPE-Zellen, die in 0,2% O2 bzw. in Anwesenheit von CoCl2 kultiviert wurden, durchgeführt. Hypoxie bewirkte keine Veränderungen der Genexpression der Inflammasom-assoziierten Proteine NLRP1, NLRP6, NLRP7, NLRP12 und NLRC4, wohingegen die Expression der NLRP3- und IL-1ß-Gene sowie der NLRP3- und IL-1ß-Proteingehalt in RPE-Zellen erhöht wurden. Verschiedene Signalwege vermitteln die Hypoxie-induzierte Transkription des NLRP3-Gens. Hierzu zählen die Transkriptionsfaktoren CREB und HIF, Proteinkinase A, IP3-Rezeptoren, calcium-bindende Proteine, TRP- und SOS-Kanäle sowie autokrine/parakrine Aktivierung von EGF-, TGF-ß1-, FGF- und IL-1ß-Rezeptoren. Desweiteren wurde auch eine Beteiligung der autokrin/parakrinen Aktivierung von purinergen Rezeptoren an der hypoxischen NLRP3-Genexpression nachgewiesen. Eine Pannexin-abhängige Freisetzung von ATP trägt über eine Aktivierung von P2Y2- und Adenosin-A1-Rezeptoren zur hypoxischen Expression des NLRP3-Gens bei. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren trägt auch zur hypoxischen Expression und Sekretion von VEGF bei. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine durch lysosomale Destabilisierung bewirkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms eine Verringerung der RPE-Zellviabilität unter hypoxischen Bedingungen bewirkt. Die Daten lassen vermuten, dass Hypoxie ein Faktor ist, der ein Priming und eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in RPE-Zellen bewirkt. Dies könnte eine retinale Inflammation und eine Degeneration der RPE-Zellen begünstigen. Eine Aktivierung von P2Y2-Rezeptoren trägt sowohl zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms als auch zur Produktion des angiogenen Faktors VEGF-A in RPE-Zellen bei.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 2. Einführung 2.1. Das retinale Pigmentepithel-Aufbau und Funktionen 2.2. Die Altersbedingte Makuladegneration (AMD) 2.2.1. Epidemiologie und Ätiologie 2.2.2. Pathophysiologie und Klassifikation der AMD 2.2.2.1. Frühe AMD 2.2.2.2. GA und CNV – Spätformen der AMD 2.3. Zusammenhang zwischen AMD und Immunsystem 2.4. Das NLRP3-Inflammasom 2.4.1. Signalerkennung, Rezeptoren und Aufbau des NLRP3-Inflammasoms 2.4.2. Aktivierung des Inflammasoms 2.4.3. Wirkung von inflammatorischen Prozessen und Zytokinen auf die RPE-Zelle 2.5. Komplementsystem und AMD 2.6. Therapie der AMD 3. Aufgabenstellung 4. Materialien und Methoden 4.1. Materialien 4.1.1. Chemikalien 4.1.2. Substanzen zur Zellstimulation 4.1.3. Geräte und Sonstige Materialien 4.1.4. Primerpaare 4.1.5. Antikörper für die Western-Blot-Analyse 4.1.6. ELISA 4.2. Methoden 4.2.1. Zellkultivierung und Zellstimulation 4.2.2. Zellvitalität 4.2.3. RNA Präparation 4.2.4. cDNA Synthese 4.2.5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 4.2.6. Agarose – Gelelektrophorese 4.2.7. siRNA Transfektion 4.2.8. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.9. Western-Blot, Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE 4.3. Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1. Genexpression von Inflammasom-assoziierten Proteinen 5.2. Wirkung von Hypoxie auf die Genexpression von Inflammasomproteinen 5.3. Hypoxisch induzierte Expression von NLRP3 und IL-1ß Protein 5.4. RPE Zellvitalität 5.5. Regulation der Genexpression von NLRP3 und VEGF unter hypoxischen Bedingungen 5.5.1. Transkriptionsfaktoren 5.5.2. Beteiligung intrazellulärer Signalkaskaden 5.5.2.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.2.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.3. Beteiligung von extrazellulären Signalproteinen 5.5.3.1. NLRP3 mRNA-Expression 5.5.3.2. VEGFA-mRNA-Expression 5.5.4. Beteiligung purinerger Rezeptoren 5.5.4.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.4.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.5. Rolle purinerger Rezeptoren bei der Hypoxie-induzierten Sekretion von VEGF 6. Diskussion 6.1. Hypoxie induziert Priming und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 6.2. Hypoxie-induzierte Signalwege, die die Expression von NLRP3 und VEGF-A regulieren 6.2.1. Transkriptionsfaktoren 6.2.2. Intra- und extrazelluläre Signaltransduktion 6.2.3. Rolle purinerger Rezeptoren bei der hypoxischen Expression von NLRP3 und VEGF 6.3. Chemische Hypoxie vs. Kultivierung in 0,2% O2 6.4. Einfluss der Inflammasomaktivierung auf die Expression und Sekretion von VEGF in RPE-Zellen 6.5. Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die AMD 7. Zusammenfassung 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1. Danksagung 9.2. Abbildungsverzeichnis 9.3. Lebenslauf 9.4. Eigenständigkeitserklärung

Das Makulaödem nach einem retinalen Venenastverschluss (VAV) korreliert in den meisten Fällen mit einem Sehverlust. Derzeit stehen zur Behandlung des Makulaödems drei Therapieverfahren zur Verfügung: 1. Intavitreale Injektionen von anti-VEGF-Medikamenten 2. Applikation von Steroiden in den Glaskörper 3. Die fokale gitterförmige Laserphotokoagulation der Netzhaut Alle drei Verfahren können unterschiedlich stark ein Makulaödem nach einen stattgefunden VAV reduzieren. Häufig korreliert der Rückgang des retinalen Ödems mit einer Verbesserung der Sehleistung. Alle drei Verfahren haben auch potentielle Risiken und Nebenwirkungen. So kann es nach der fokalen Laserung zu störenden zentralen Gesichtsfelddefekten kommen. Die Behandlung mit Steroiden und Anti-VEGF-Präparaten muss als Injektion in den Glaskörper erfolgen. Allein diese Applikationsform kann z.B. zur Verletzung der Linse, einer Netzhautablösung und einer Endophthalmitis führen. Des Weiteren erfordern beide Verfahren wiederholte Applikationen, die für die Patienten oft eine hohe Anzahl von Arztbesuchen bedeutet. Deshalb wäre eine ideale Behandlung des Makulaödems eine einmalige Behandlung mit möglichst geringen Nebenwirkungen und einer hohen Effizienz. Eine mögliche Alternative zu den oben genannten Verfahren würde die Arteriolenverengung (AV) (Arterial Crimping) darstellen. Bei dieser Behandlung wird die zuführende Arterie des okkludierten Netzhautgebietes mittels Argonlasers koaguliert und somit der Blutzustrom reduziert. Erste klinische Studien zeigten vielversprechende Ergebnisse. So konnte bei den behandelten Patienten sowohl eine Reduktion des Makulaödems als auch eine Verbesserung der Sehleistung nachgewiesen werden. Allerdings wurden die Wirkungsmechanismen dieses Verfahren bis heute nicht vollständig geklärt. In der vorgelegten Arbeit wurde die Genexpression von Faktoren, die bei der Entwicklung und Resorption des Makulaödems infolge eines retinalen VAV eine Rolle spielen, untersucht. Des Weiteren wurde das Wirkprinzip der AV zur Behandlung eines VAV analysiert. Alle Experimente wurden in einem Rattenmodel durchgeführt und der VAV mittels einer Argon- Laserphotokoagulation induziert. Die Tiere wurden in drei Gruppen eingeteilt: 1. Gruppe: retinaler VAV ohne Therapie (N=32) 2. Gruppe: retinaler VAV mit Arteriolenverengung (N=19) 3. Gruppe: unbehandelte Kontrollgruppe (N=51) Es wurde jeweils an einem Auge der Tiere ein Gefäßverschluss durch Laserkoagulation induziert. Bei der Gruppe, die eine Therapie erhielten, wurde zusätzlich eine Konstriktion der versorgenden Arterie mittels Laser durchgeführt. Die unbehandelten Partneraugen dienten bei allen Tieren als gesunde Kontrollen. In der Pathogenese eines Makulaödems spielen verschiedene Faktoren eine maßgebliche Rolle. Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF) bewirkt eine Ödembildung. Einen gleichen Effekt auf die Ödembildung haben inflammatorische Zytokine wie Interleukin-1beta (IL-1β) und Interleukin-6 (IL-6). Für die natürliche Resorption von Wasser aus der Netzhaut sind verschiedene Membranproteine wie z.B. die Kaliumkanäle (Kir4.1) und Aquaporine (AQP1, AQP4,) verantwortlich. Kommt es zu einer verminderten Bildung von diesen Proteinen, resultiert dieses ebenfalls in einer Ödembildung. Ein Faktor der ebenfalls die Wassereinlagerung in der Netzhaut reduzieren kann, stellt der Wachstumsfaktor Pigment-Epithelium-derived-factor (PEDF) dar. Die Genexpression der genannten Faktoren wurde mittels real time Polymerase Ketten Reaktion (PCR) separat in der Netzhaut und den Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) untersucht. Die Bestimmung erfolgte am Tag 1, 3 und 7 nach der VAV-Induktion und am Tag 1 und 3 nach der AV-Behandlung. Zusammenfassend zeigte sich eine unterschiedliche Expression der genannten Faktoren in Abhängigkeit vom untersuchten Gewebe (Neuroretina und RPE), sowie von der Dauer der durch den VAV induzierten Netzhautischämie. Die Ergebnisse der Genexpression in der untersuchten Netzhaut nach VAV ergaben folgende zeitabhängige Veränderungen: 1. schnelle vorübergehende Erhöhung der Expression von VEGF mRNA 2. Vermehrte Expression von PEDF mRNA nach drei und sieben Tagen 3. stark verminderte Bildung der mRNA der Kalium-, und Wasserkanäle Kir4.1, AQP4 und AQP1 4. erhöhte Genexpression von den inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-6. Die Veränderungen in der Genexpression der Netzhaut bei Zustand nach VAV lassen somit vermuten, dass für die Entstehung eines Netzhautödem sowohl die vaskuläre Leckage (induziert durch VEGF und IL-1β und IL-6) als auch die Flüssigkeitsansammlung des retinalen Gewebes (Herunterregulation der glialen Wasser- und Kalium-Kanäle) verantwortlich ist. Die Ergebnisse der Genexpression nach einem VAV zeigten in der Netzhaut einen rapiden Anstieg der VEGF-A-Expression nach einem Tag und einen verspäteten Anstieg der PEDF- Expression nach drei und sieben Tagen. Die Expression von VEGF-B zeigte in der Netzhaut bei allen untersuchten Zeitpunkten keine signifikanten Unterschiede. In den RPE-Zellen wurde ebenfalls ein Anstieg der VEGF-A mRNA Expression nachgewiesen. Die Expression von VEGF-B war am Tag 1 unverändert, reduzierte sich am Tag 3 und 7 signifikant. Die starke vorübergehende Erhöhung der VEGF-Expression in der Netzhaut nach VAV lässt sich durch die verursachte Hypoxie und der daraus resultierenden Entzündungsreaktion erklären. Diese wiederum könnte über eine Ausschüttung von IL-1β zur weiteren Vermehrung von VEGF-A beitragen. Der Abfall der VEGF-A- Expression drei Tage nach einem VAV könnte auf einer vermehrten Bildung von PEDF beruhen, welches zu diesem Zeitpunkt ansteigt. Die Expression von Kalium- und Wasserkanälen (Kir4.1, AQP4, AQP1) wurde in der Netzhaut und in den RPE-Zellen am Tag 1 und 3 herunter reguliert. Am Tag 7 normalisierte sich die Expression von allen Kalium- und Wasserkanälen in den RPE-Zellen. Dieser Effekt konnte nicht in der Netzhaut detektiert werden. Hier wurde nur eine Normalisierung der Expression von Kir4.1 verzeichnet. Um eine mögliche Umverteilung der Membranproteine AQP4, AQP1 und Kir4.1 zu untersuchen, wurden immunhistochemische Analysen durchgeführt. Es zeigte sich kein Effekt des VAV auf das Verteilungsmuster von AQP4 und AQP1. Im Gegensatz dazu kam es zu einer Umverteilung der Lokalisation des Proteins Kir4.1 in der Netzhaut. In den Kontrollen wurde eine Expression von Kir4.1 in der inneren Netzhautschicht (Nervenfaser und Ganglienschicht) und perivaskulär nachgewiesen. Nach VAV wurde eine Verteilung in der gesamten Netzhaut beobachtet. Die Netzhautexpression der Entzündungszytokine (IL-1ß, IL-6) wurde signifikant hoch reguliert, in den RPE-Zellen war der Expressionsanstieg nur am Tag 1 bei IL-6 sichtbar. Am Tag 7 wurde für beide Entzündungszytokine eine signifikante Reduktion der mRNA- Expression beobachtet. Die Behandlung des VAV durch die AV zeigte unterschiedliche Effekte auf die untersuchten Gene. Die AV hatte keinen Einfluss auf die Genexpression von VEGF-A und VEGF-B. Wie bereits beschrieben kam es auch bei diesen Tieren zu einer vermehrten Bildung der VEGF-A- Expression nach einem Tag. Der Effekt war sowohl in der Netzhaut als auch im RPE nachzuweisen. Die VEGF-B mRNA Expression war in der Netzhaut unverändert, im RPE zeigte sich wie bei den unbehandelten Tieren mit VAV eine unveränderte Expression von VEGF-B am Tag 1 und eine Reduktion am 3. und 7. Tag. Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich auch für die Expression von PEDF. Auch hier konnte kein Einfluss der AV auf die mRNA Bildung nachgewiesen werden. Im RPE kam zu einem Anstieg der mRNA Menge an dem Tag 3 und 7. Im Gegensatz zu dem marginalen Einfluss der AV auf die Genexpression von VEGF und PEDF zeigten sich signifikante Effekte auf die Bildung der mRNA der Membranproteine Kir4 und AQP4. Die AV führte zu einer schnellen Normalisierung der gestörten Genexpression der Kanäle Kir4.1 und AQP4 im RPE. Derselbe Effekt wurde auch für Kir4.1 in der Neuroretina gefunden. Zusätzlich wurde die Überexpression von IL-6 in der Neuroretina durch die AV reduziert. Die AV hatte keinen Einfluss auf die VAV induzierte Umverteilung des Kir4.1 Proteins. Die Ergebnisse unserer Experimente zeigten, dass eine AV ein protektiver Faktor gegenüber der Entstehung eines Netzhautödems beim VAV darstellt. Die beschleunigte Wiederherstellung der durch den VAV supprimierten Membranproteine Kir4.1, AQP4 und AQP1 im RPE und von Kir4.1 in der Neuroretina könnte zu einer schnelleren Resorption des Makulaödems beitragen. Des Weiteren ist es denkbar, dass durch die beschleunigte Normalisierung der hochregulierten Expression von IL-6 in der Neuroretina, die retinale Entzündung und das Ausmaß der Gefäßpermeabilität verringert werden. Alle Effekte der AV nach VAV auf die retinale Genexpression wurden nach drei Tagen, aber nicht nach einen Tag beobachtet. Daher kann man den Schluss ziehen, dass der Effekt der AV verzögert eintritt. Es bleibt zu erforschen ob eine Abnahme des hydrostatischen Druckes ein kausativer Faktor ist für die AV induzierte beschleunigte Abnahme des hochregulierten IL-6. Zusammenfassend führen die hier vorliegenden Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der Pathogenese des Makulaödems infolge eines VAV und zeigen, dass die Veränderungen teilweise durch die AV Technik normalisiert werden können. Somit lässt sich spekulieren, dass die AV Behandlung nach weiteren experimentellen und klinischen Studien als Alternative zu den bisher üblichen Behandlungsmethoden eines Makulaödems bei VAV angewendet werden könnte.:INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. Einführung 5 2. Publikationsmanuskript 13 3. Zusammenfassung 23 4. Literaturverzeichnis 28 5. Darstellung des eigenen Beitrages 34 6. Selbstständigkeitserklärung 35 7. Lebenslauf 36 8. Danksagung 38

Eine lokale Aktivierung des Komplementsystems im RPE ist ein pathogener Faktor der AMD. Neben der Wirkung von angiogenen Faktoren wie VEGF könnte eine Aktivierung des Blutgerinnungssystems im RPE dazu beitragen, dass sich aus einer trockenen eine feuchte AMD entwickelt. Dies könnte auf mehreren Ebenen geschehen: Gerinnungsfaktoren könnten die Expression der Komplementfaktoren und der angiogenen Faktoren regulieren sowie Wirkungen auf die Proliferation und Migration der RPE-Zellen besitzen. Eine Stimulierung der Proliferation und Migration der RPE-Zellen trägt zur Ausbildung von CNV-Membranen bei. Es ist aber bis jetzt nichts darüber bekannt, ob RPE-Zellen Faktoren des Blutgerinnungssystems exprimieren und ob z.B. Thrombin (als zentrale Protease des Blutgerinnungssystems) die Genexpression von Komplementfaktoren und von VEGF im RPE beeinflusst. Die Ziele der vorliegenden Dissertation waren daher: ● Nachweis der mRNA-Expression von Blutgerinnungs- und Komplementfaktoren im RPE; ● Nachweis der Wirkung von Thrombin auf die Expression von VEGF und von Komplementfaktoren, sowie auf die Proliferation und Migration der RPE-Zellen; und ● Nachweis der Wirkung der Komplementfaktoren C5a und C9 auf die Sekretion von VEGF und die Proliferation und Migration der RPE-Zellen.

Extracellular Ub is an immune modulator that plays a role in suppression of inflammation, organ injury, myocyte apoptosis, and fibrosis. The purpose of this study was to investigate the effects of extracellular Ub on the process of cardiac angiogenesis. CMECs and aortic tissue were isolated from rats to measure changes in angiogenic protein levels and to assess angiogenic responses to extracellular Ub. In CMECs, extracellular Ub increased protein levels of VEGF-A and MMP-2, known angiogenesis regulators. CMECs demonstrated enhanced rearrangement of fibrillar actin and migration in response to Ub treatment. Ub-treated CMECs demonstrated an increase in tube network formation which was inhibited by the CXCR4 receptor antagonist, AMD3100. Methylated Ub, unable to form polyubiquitin chains, enhanced tube network formation. Aortic ring sprouting assays demonstrated that Ub increases microvessel sprouting in the Matrigel. The results of our study suggest a novel role for extracellular Ub in cardiac angiogenesis, providing evidence that extracellular Ub, at least in part acting via the CXCR4 receptor, has the potential to facilitate the process of angiogenesis in myocardial endothelial cells.