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Novas abordagens para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose / New approaches for the development of a vaccine against leptospirosisSeixas Neto, Amilton 06 August 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014-08-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / A leptospirose é uma zoonose que possui distribuição mundial, causando um importante impacto econômico no setor agropecuário. Atualmente, as vacinas empregadas para a prevenção da enfermidade são formuladas com culturas de leptospiras inteiras inativadas, as quais possuem sucesso limitado, já que induzem uma imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Resultados preliminares revelaram que fragmentos recombinantes das proteínas Ligs (Leptospiral immunoglobulin-like) são antigênicas, imunogênicas e conferem proteção total ou parcial contra o desafio homólogo em hamsters. Dessa forma, fragmentos rLigs são candidatos potenciais para uma vacina de subunidade contra a leptospirose humana e animal. Assim sendo, a proposta deste projeto foi avaliar preparações vacinais com as proteínas recombinantes LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) e LigA131-1224aa (rLigAFull) quando administradas com Hidróxido de Alumínio como adjuvante, individualmente ou combinadas, a fim de identificar quais formulações serão capazes de induzir uma resposta protetora contra o desafio homólogo. Hamsters machos e fêmeas foram imunizados com as preparações através da via intramuscular, nos dias 0 e 14, e o desafio homólogo foi realizado através da via intraperitoneal, no dia 28, utilizando Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Após a expressão e purificação das quatro proteínas, obteve-se quatro lotes com pureza de 90%. Todas as quatro proteínas recombinantes apresentaram antigenicidade, reagindo contra soro de humanos e animal convalescentes de leptospirose. A imunização dos hamsters contendo as preparações com rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull conferiram proteções variáveis (0-100%) contra o desafio homólogo. Embora nenhuma preparação tenha induzido a uma proteção esterilizante, evidenciada através das técnicas de reisolamento e imunofluorescência, a associação entre rLigANI e rLigBRep foi capaz de conferir proteção significativa (p<0,05) em todos os experimentos. Em contrapartida, o fragmento inteiro de LigA, assim como rLigB7-11, não conferiram proteção. Nosso estudo propôs uma nova abordagem para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. É o primeiro estudo que testou a proteína LigA recombinante em sua forma inteira. Além disso, foi possível obter a sua expressão na forma solúvel. Embora a proteína obtida tenha sido reconhecida por soros de humanos convalescentes in vitro, foi capaz de conferir apenas níveis de sobrevivência significativa (p<0,05) aos animais desafiados, mas não em relação à mortalidade. Por outro lado, a associação entre rLigBRep e rLigANI, outra abordagem inédita, demonstrou que mesmo testando-se em diferentes doses (40g ou 60g) de cada alvo, tanto a análise de mortalidade quanto a de sobrevivência revelou resultados significativos (p<0,01) em três dos cinco experimentos realizados. Os resultados obtidos em nosso estudo representam uma contribuição importante para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis, causing a major economic impact on the agricultural sector. Currently, the vaccines used to prevent disease in cattle are formulated with inactivated Leptospira whole-cell bacterins, which have limited success, since they induce an immunity of short duration and serovar-specific protection. Preliminary results from our group showed that recombinant fragments of Lig (leptospiral immunoglobulin-like) proteins are antigenic, immunogenic and confer full or partial protection against homologous challenge in hamster model. Thus, rLigs fragments are potential candidates for a subunit vaccine against human and animal leptospirosis. Therefore, the purpose of this study was to evaluate vaccine preparations with recombinant proteins LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) and LigA131-1224aa (rLigAFull) when administered with Alum Hydroxide as adjuvant, either individually or combined, in order to identify formulations that are capable of inducing a protective response against homologous challenge. Male and female hamsters were immunized with the preparations by intramuscular injection on days 0 and 14, and the homologous challenge was performed using Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130, by intraperitoneal injection on day 28. Following expression and purification of the four proteins were obtained four batches with a purity of 90%. All four recombinant proteins showed antigenicity, reacting against human sera with convalescent leptospirosis. Immunization of hamsters with preparations containing rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11, and rLigAFull conferred variable protection (0-100%) against homologous challenge. Although no preparation has induced a sterilizing protection, evidenced by the isolation and immunofluorescence techniques, the association between rLigANI and rLigBRep was able to confer significant protection (p <0.05) in all experiments. In contrast, the LigAFull as well as rLigB7-11, did not provide protection. Our study has proposed a new approach for the development of a recombinant vaccine against bovine leptospirosis. It is the first study that tested the rLigA in its entire form. Furthermore, it was possible to obtain expression in soluble form. Although the protein obtained has been recognized by sera from convalescent human in vitro, it was only capable of conferring significant levels of survival (p <0.05) to challenged animals but not in relation to mortality. Moreover, the association between rLigBRep and rLigANI, another novel approach, testing showed that even at different doses (40 g ou 60 g) of each target, both the analysis of the mortality and survival showed significant results (p <0.01) in three of the five experiments. The results obtained in our study represent an important contribution to the development of a vaccine against leptospirosis.
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Triagem in silico de candidatos vacinais contra Toxoplasma gondii / In silico screening of vaccine candidates against Toxoplasma gondiiInácio, Moisés Morais 06 March 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-03-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Toxoplasma gondii is the causative agent of congenital toxoplasmosis, which manifests as mild chorioretinitis, miscarriage, mental retardation, microcephaly, hydrocephalus, and seizures. Treatment of this disease is limited and a new vaccine represents the best strategy for prevention of the infection. In the present study, the reverse vaccinology combined with immunomics was applied for the development of a vaccine against T. gondii. Using an in silico approach, we identified T. gondii’s proteins that contain signal peptide and transmembrane domain using the ToxoDB® database. We evaluated the homology of these proteins with the human proteome and predicted their epitopes using Blastp, NetMHCpan 3.0 and NetMHCIIpan 3.1 tools. Class I and II HLA alleles with frequency greater than 1% in the population of South America, North America and Europe were obtained using the dbMHC database. Processing of the MHC class I epitopes were evaluated by MHC I Processing on the IEDB® database and the B lymphocyte epitopes were obtained through the Bcpred and BCTOPE servers. Finally, the antigenicity of the potential targets was analyzed by the VAxiJen server. A total of 1228 proteins were obtained, from which 349 showed no homology with human proteins. For the South American population, among the proteins identified with promiscuous epitopes, we observed proteins that are part of the virulence arsenal of the pathogen such as ROP8, ROP7, ROM4, Cathepsin C / B, rhoptry neck protein and LMBR1 family region protein. In the North American and European populations, we identified common proteins to both populations, such as MIC15, ROP7, HECT-domain (ubiquitin-transferase) domain-containing protein and rhoptry neck protein. ROP31 and subtilisin SUB2 are exclusive to the North American population. These proteins are involved in the invasion process and were shown to be positive in all the parameters adopted in this study. Regarding B lymphocyte epitopes, proteins such as ROP7, ROP8, ROM4, MIC15, HECT were identified. These proteins also presented promiscuous epitopes to class I and II HLAs from the analyzed populations. In addition, MIC2, ROM5, ROP9, MIC8, and MIC9 also showed B lymphocyte epitopes, but MIC9 was noteworthy with the highest score, high expression in the bradyzoite stage, and lack of vaccine test. ROP7, ROP8, ROM4, MIC8 and MIC9 were selected for in vivo and in vitro testing. Thus, our results demonstrate that immunochemical reverse vaccination has been shown not only to identify potential vaccine candidates against pathogens with complex life cycles. / Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose congênita, que pode se manifestar como coriorretinite leve, aborto espontâneo, retardo mental, microcefalia, hidrocefalia e convulsões. O tratamento dessa doença é limitado e uma nova vacina representaria a melhor estratégia para a prevenção da infecção. No presente estudo, adotamos a vacinologia reversa associada a imunômica foi aplicada na construção de uma vacina contra T. gondii. Utilizando uma abordagem in silico, selecionamos as proteínas do patógeno que possuem peptídeo sinal e domínio transmembranar utilizando o banco de dados no ToxoDB®. Avaliamos a homologia dessas proteínas com o proteoma humano e predizemos os epítopos utilizando as ferramentas Blastp. NetMHCpan 3.0 e NetMHCIIpan 3.1. Os alelos de HLAs de classe I e II com frequência ≥ 1% na população da América do Sul, América do Norte e Europa foram obtido através do banco de dados dbMHC. O processamento dos epítopos de MHC de classe I foram avaliados pelo MHC I Processing no banco de dados IEDB® e os epítopos de linfócitos B foram obtidos através dos servidores Bcpred e BCTOPE. Por fim, a antigenicidade dos potenciais alvos foi analisada pelo servidor VAxiJen. Um total de 1228 proteínas foi obtido, das quais 349 não apresentaram homologias em humanos. Para a população sul-americana, entre as proteínas com epítopos promíscuos identificadas, observamos proteínas que fazem parte do arsenal de virulência do patógeno tais como ROP8, ROP7, ROM4, cathepsin C/B, rhoptry neck protein e LMBR1 family region protein. Em relação às populações norte-americana e europeia, a identificação de epítopos promíscuos revelou proteínas comums às duas populações tais quais MIC15, ROP7, HECT-domain (ubiquitin-transferase) domain-containing protein e rhoptry neck protein e exclusivas à população norte americana, como ROP31 e subtilisina SUB2. Essas proteínas estão envolvidas no processo de invasão e/ou foram positivas em todos os parâmetros adotados neste estudo. Com relação aos epítopos de linfócitos B, obteve-se 93 proteínas, dentre elas, ROP7, ROP8, ROM4, MIC15, HECT que também apresentaram epítopos promíscuos aos HLAs de classe I e II das populações analisadas. Além delas, MIC2, ROM5, ROP9, MIC8 e MIC9 também apresentaram epítopos de linfócitos B, mas MIC9 destacou-se com o maior score; pela elevada expressão no estágio de bradizoíto e pela inexistência de testes vacinais. ROP7, ROP8, ROM4, MIC8 e MIC9 foram selecionadas para teste in vivo e in vitro. Dessa forma, nossos resultados demonstram que vacinologia reversa associada a imunômica mostrou-se capaz de identificar fortes candidatos vacinais contra patógenos de ciclo vida complexo.
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Prospecção e avaliação de proteínas recombinantes para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose / Prospection and evaluation of recombinant proteins for the development of a vaccine against leptospirosisFortes, Tanise Pacheco 21 February 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A leptospirose é uma zoonose de ocorrência mundial causada por membros patogênicos do gênero Leptospira. Em países em desenvolvimento, como o Brasil, a doença representa um grave problema de saúde pública. Os hospedeiros suscetíveis adquirem a doença através do contato com urina, água ou solo contaminados com a bactéria. Além dos roedores, os bovinos e os caninos se destacam como importantes reservatórios de Leptospira spp, tornando a vacinação dos animais suscetíveis uma das principais formas de prevenção da doença. As vacinas disponíveis comercialmente são bacterinas que induzem resposta imune humoral predominantemente contra o lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano e que não são capazes de fornecer proteção de longo prazo contra a infecção. As proteínas da membrana externa de Leptospira spp tem sido avaliadas como candidatos vacinais em modelo animal e são uma alternativa promissora às formulações comerciais em uso. Dessa maneira, o objetivo deste estudo foi realizar a triagem de preparações vacinais contendo proteínas recombinantes de Leptospira spp, visando o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose. Cinco genes, LIC11889, LIC10666, LIC10498, LIC12666 e LIC10463, foram identificados e amplificados a partir do genoma de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Desses genes, quatro (LIC11889, LIC10666, LIC10498 e LIC10463) foram eficientemente expressos em sistema de expressão heteróloga em Escherichia coli e purificados através de cromatografia de afinidade. Duas proteínas recombinantes, rLIC11889 e rLIC10666 foram empregados na formulação de preparações vacinais, utilizadas para imunizar hamsters posteriormente desafiados com dose letal de L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Todos os animais vacinados com as preparações contendo as proteínas recombinantes sobreviveram à leptospirose aguda, tornando promissora sua utilização para a criação de vacinas contra a doença. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic members of the genus Leptospira. In countries under development, like Brazil, the disease represents a serious problem of public health. The susceptible hosts acquire the disease through contact with urine, water or soil contaminated with the bacteria. As well as rodents, cattle and dogs are important reservoirs of Leptospira spp, making the vaccination of susceptible animals one of the main. ways of preventing the disease. The commercially available vaccines are bacterins that induce humoral immune response predominantly against the bacterial lipopolysaccharide (LPS) and are unable to provide long term protection against the infection. The outer membrane proteins of Leptospira spp have been evaluated as vaccinal candidates in animal models and are a promising alternative to usual commercial formulae. In this way, the objective of this study was to perform a trial of vaccinal preparations containing recombinant proteins of Leptospira spp, to develop a vaccine against leptospirosis. Five genes, LIC11889, LIC10666, LIC10498, LIC12666 and LIC10463 were identified and amplified from the genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130. From these genes, four (LIC11889, LIC10666, LIC10498 and LIC10463) were efficiently expressed in an heterologous expression system in Escherichia coli and purified through affinity chromatography. Two recombinant proteins, rLIC11889 and rLIC10666 were employed in the formulation of vaccinal preparations, used to immunize hamsters that were later challenged with the lethal dose of L. interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130. All the animals vaccinated with the preparations containing the recombinant proteins survived acute leptospirosis, making their use for the development of vaccines against the disease promising.
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