La vanillyl alcool oxydase est un biocatalyseur prometteur d’un point de vue réactionnel en raison de sa faible sélectivité sur les composés phénoliques substitués en position para. Elle catalyse l’oxydation d’une large gamme de dérivés 4-hydroxybenzylique, des réactions de déméthylation oxydative, de désamination, de déshydrogénation et d’hydroxylation ; notamment celle de l’eugénol. L’hydroxylation de ce dernier conduit à la formation d’alcool coniférylique. Dans le but d’utiliser l’eugénol comme substrat de biosytnhèse de dérivés vanilliques, nous avons développé, au cours de ce travail de thèse, deux souches exprimant le biocatalyseur d’intérêt : une souche de levure et une souche bactérienne.La première partie de la thèse a donc consisté à mettre au point un système d’expression pour la production de VAO dans la levure de boulanger et un procédé d’hydroxylation de l’eugénol en fermenteur. Le principal apport réside dans la construction de la souche 93645, qui contient la cassette d’expression VAO et une activité oxydase propre permettant la bioconversion de l’alcool coniférylique formé en acide férulique. En fonction des conditions de fermentation, 20 g/l d’alcool coniférylique ou 27 g/l d’acide férulique sont produits par les cultures de S. cereviaise- VAO 93645. La reproductibilité des procédés, ainsi que leur faisabilité à l’échelle pilote, ont été démontrés.Dans la seconde partie de cette étude, le même travail de clonage a été réalisé dans la souche Amycetales Streptomyces setonii ATCC 39116. La bactérie, reclassifiée en 2009 sous le nom d’Amycolatopsis sp 39116, est connue pour sa capacité à bioconvertir l’acide férulique en vanilline ; d’où l’intérêt d’exprimer l’enzyme VAO dans cette souche. Plusieurs stratégies de clonage ont été expérimentées et une souche recombinante, exprimant une activité VAO active a été obtenue. Les conditions optimales pour l'utilisation de cette dernière dans le cadre de la production de vanilline et d’alcool coniférylique ont été identifiées. Elles conduisent à la biosynthèse de 0,4 g/l vanilline et de 15 g/l d’alcool coniférylique. Les résultats mettent en évidence une activité insuffisante des oxydases de Streptomyces sur l’alcool coniférylique formé. Ce type de production n’a encore jamais été réalisé chez S. setonii et ces premiers résultats demandent encore des mises au point avec, sans doute, le clonage d’oxydases hétérologues permettant la bioconversion de l’alcool coniférylique formé en acide férulique. / Our aim was to develop a process for the biosynthesis of vanillin derivatives from eugenol.Vanillyl alcohol oxidase isolated from Peniciiiium simplissicimum, catalyzes the hydroxylation of eugenolinto coniferyl alcohol. In this study, two strains expressing the biocatalyst were constructed: a yeast,Saccharomyces cerevisiae, and a bacteria; Streptomyces setonii.It has been demonstrated that the wild strain Saccharomyces cerevisiae can bioconvert coniferyl alcohol, most probably due to its dehydrogenase activity. Strain 93645, genetically modified to expressvanillyl-alcohol oxidase, enabled us to optimize an industrial scale process for the production of natural ferulic acid.Streptomyces setonii strain ATCC 39116 was also genetically engineered to over-express VAO. Abioconversion process was developed leading to a coniferyl alcohol concentration of 15 g/1 coniferyl alcohol. The impact of several parameters; such as temperature, substrate addition mode and pH, werealso explored to improve the bioconversion reaction of coniferyl alcohol to vanillin. The amounts of product resulting from bacterial biosynthesis were however too low for implementation of an industrial process.

Les résines phénoliques de type résole présentent des propriétés applicatives et thermiques adaptées à l'élaboration de matériaux composites pour l'industrie aérospatiale. En particulier, ces résines peuvent être polymérisées en plusieurs étapes et présentent des propriétés de charbonnement très élevées. Seulement, ces résines sont principalement synthétisées à partir de formaldéhyde et de phénol. Ces précurseurs sont classés Cancérigène Mutagène Reprotoxique (CMR) respectivement de catégorie 1B et 2 et sont issus de ressources pétrolières. Du fait de cette classification CMR et de la raréfaction des ressources pétrolières, la société SAFRAN-Herakles souhaite substituer le formaldéhyde par des précurseurs non classés CMR et d'origine renouvelable. Les précurseurs aldéhyde aromatiques issus des lignines, 4-hydroxybenzaldéhyde, vanilline et syringaldéhyde, ne sont pas toxiques et peuvent être issus d'une ressource renouvelable abondante et bon marché, les lignines. Néanmoins, nous avons montré que ces trois précurseurs bio-sourcés ne sont pas réactifs en synthèse de résines résole. Nous avons également montré que le formaldéhyde doit être substitué par des précurseurs dialdéhyde aromatiques réactifs pour synthétiser des résines phénoliques avec d'excellentes propriétés de charbonnement. Ainsi, nous avons mis au point deux méthodes de fonctionnalisation pour transformer ces composés aldéhyde aromatiques bio-sourcés en de tels précurseurs dialdéhyde aromatiques réactifs. Les précurseurs obtenus ont ensuite été utilisés en synthèses de résines résole sans formaldéhyde et bio-sourcées. Après caractérisation de ces résines, nous avons enfin identifié des précurseurs donnant accès à des résines résole bio-sourcées avec des propriétés de charbonnement supérieures aux résines formophénoliques actuelles. En résumé, ces nouveaux précurseurs aldéhyde bio-sourcés représentent des alternatives prometteuses à l'usage de formaldéhyde pour la synthèse de résines résole avec des propriétés cibles pour des applications dans l'industrie aéropatiale. / Resol-type phenolic resins present applicative and thermal properties suitable for applications such as composite manufacture in aeropatial industry. Especially, resols can be polymerized stage-wise and present after curing high char yield properties. However, those resins are typically synthesized from formaldehyde and phenol. Those precursors are both classified as Carcinogenic Mutagenic Reprotoxic (CMR), respectively 1B and 2, and are petrobased. Because of this classification and of the fossil feedstock depletion, SAFRAN-Herakles wants to substitute formaldehyde by non-toxic and biobased aldehyde precursors. Aromatic aldehyde precursors such as 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin and syringaldehyde are interestingly non-toxic and can be produced from the cheap and abundant lignins. Nevertheless, we have shown that those precursors are not reactive in resol synthesis conditions. Also, we have shown that difunctional and reactive aromatic aldehyde precursors are suitable for the synthesis of high char yield resins. Then, we have designed two functionalization methods to turn the biobased aldehyde precursors into difunctional and reactive ones. Finally, those precursors have been used for the synthesis of biobased resols without formaldehyde. Those new resins can be polymerized stage-wise and present higher char yield properties than the current formophenolic resins. Hence, those new biobased aldehyde precursors represent promising alternatives to formaldehyde for the synthesis of resols with target properties for aerospatial industry applications.

Ce mémoire présente une exploration des polymères à empreintes moléculaires (MIP) comme outils d’une libération contrôlée de bioactifs olfactifs ou pour le criblage/préselection de composés à activité antivirales ou anti-tumorales sur le site actif d’une enzyme. La première partie est une étude de la complexation de la vanilline sur des billes polymériques sphériques en vue d’une libération contrôlée (pH, salinité, …). Ces études portent sur les caractéristiques de l'absorption et la libération de la molécule d'intérêt dans le milieu aqueux sur les microsphères fonctionnalisées fourni par Merck ESTAPOR® Microsphères. Nous avons ensuite synthétisé divers MIP de vanilline au format monolithique. Plusieurs stratégies d’impression ont été étudiées: non covalente, covalente et semi-covalente. La composition du MIP préparé dans chaque approche a été optimisée pour obtenir les meilleures propriétés et performances. L'affinité, la sélectivité et la capacité du MIP ont été déterminées. Les MIPs ont été évalués par extraction en phase solide (SPE) d'analogues structuraux de la vanilline dans des échantillons naturels (extrait de vanille, vin). La deuxième partie de ce mémoire concerne l’évaluation de MIPs de l’adénosine 5’-monophosphate (AMP) Le polymère a été préparé par une approche non-covalente et son efficacité de recapture a été caractérisée par analyse frontale (FA). L’analyse frontale est une technique qui permet de discriminer des interactions spécifiques des non spécifiques et de comprendre les mécanismes de liaison dans des cavités spécifiques. / This thesis report presents the exploration of molecularly imprinted polymers (MIP) for the application in controlled release and targeting antivirus and anticancer drugs. The first part of this study describes the imprinting of vanillin as a monolith. Several strategies were studied: non-covalent, covalent and semi-covalent. The composition of the MIP prepared in each approach was optimized to obtain the best properties and performance. The affinity, selectivity and capacity of MIP were determined. MIPs were evaluated in solid-phase extraction (SPE) of structural analogues in natural samples (vanilla extract, wine). We also present the study of the exploration of spherical beads as potential tools for the controlled release of vanillin. These studies concern the characteristics of uptake and release of the molecule of interest in the aqueous medium on functionalised microspheres supplied by Merck ESTAPOR Microspheres®. The second part of this thesis is devoted to studies on the evaluation of MIP of adenosine 5'-monophosphate (AMP). The polymer was prepared in non-covalent approach and efficiency of binding was characterised using frontal analysis (FA). FA is a useful technique that allows discriminate specific and nonspecific interactions and to understand the binding mechanisms in specific cavities.

Ces travaux de thèse traitent de l’utilisation d’une molécule polycyclique, l’acide abiétique, issu de la colophane, et de dérivés phénoliques potentiellement dérivés de la lignine, pour la synthèse de polymères rigides bio-sourcés. Dans les deux cas, des monomères symétriques et difonctionnels sont élaborés par réaction de dimérisation des précurseurs bio-sourcés puis testés en polymérisation. D’une part, les dimères de l’acide abiétique obtenus par un mécanisme cationique possèdent des structures mal définies qui compliquent leur polymérisation. Ces dimères ont alors été estérifiés avec de l’undécénol afin d’obtenir un composé bis-insaturé qui est ensuite polymérisé par ADMET. D’autre part, un procédé de dimérisation de molécules phénoliques, potentiellement issues de la lignine, a été développé par voie enzymatique utilisant une laccase. L’avantage majeur de ce procédé ‘vert’ réside dans la séparation très simple entre le monomère, soluble, et son dimère, insoluble. Ces dimères ont ensuite été modifiés chimiquement afin de constituer une bio-plateforme de composés biphényles fonctionnels. Ces composés ont été utilisés pour la synthèse de polyesters, polyamides et résines époxy qui présentent des propriétés thermiques et thermomécaniques remarquables. / The aim of this thesis is to investigate new biobased rigid synthons for the synthesis of polymers with high thermomechanical properties. A polycyclic biobased molecule, i.e resinic acids, and phenolic compounds potentially derived from lignin, such as vanillin were selected. Both classes of substrates were dimerized in order to get difunctional symmetric synthons. On the one hand, abietic acid dimers synthesized via a cationic mechanism presented an ill-defined structure. To avoid reactivity issues, dimers with reactive terminal double bonds were successfully synthesized by esterification of abietic acid dimers with undecenol and polymerized by ADMET methodology. On the other hand, we developed a “green” process to dimerize phenolic compounds derived from lignin in large quantity and high yield via enzymatic catalysis using a laccase. The main advantage of this method is that the phenolic monomer is soluble in the reaction medium while the dimer precipitates. After chemical modifications of the dimers, we built a functional bio-platform of biphenyl derivatives. The latter were then used for the synthesis of polyesters, polyamides and epoxy resins which exhibited remarkable thermal and thermomechanical properties.

Le remplacement de monomères d'origine pétrosourcée par des analogues biosourcés améliore la durabilité et diminue la dépendance aux ressources fossiles. De plus, de nouvelles caractéristiques et propriétés sont souvent découvertes. Les polyesters aliphatiques biosourcés ont déjà partiellement remplacé les produits traditionnels. Dans le contexte du projet Sorago, une résine entièrement biosourcée pour les revêtements de prélaquage des produits intérieurs a déjà été introduite sur le marché (Estetic® bio Air, Arcelor Mittal). Pour permettre l'utilisation du produit dans des applications extérieures, sa résistance à la lumière UV et à l'humidité sont à améliorer. Cela pose deux problèmes : Une disponibilité limitée de monomères pouvant introduire de la rigidité dans la résine et la relation entre la structure de la résine et sa dégradation. La vanilline a été choisie comme synthon pour la gamme des monomères rigides et biosourcées. La transformation de sa fonction aldehyde par réaction de Perkin et sa réactivité a été examinée. Dans une série des copolymerisations, l'influence des conditions de réaction sur la composition du produit final a été proposée. Une relation structure-propriétés concernant la température de la transition vitreuse et la viscoélasticité des plusieurs monomères biosourcées a été établie, et comparée avec celle des monomères petrosourcées. Une série des prototypes avec des propriétés très variées a été soumise à un test de vieillissement rapide. Leur dégradation a été suivie sur la base de leur rétention de brillance, par FTIR et par des tests de µ-dureté et d'épaisseur des films. La performance des prototypes biosourcés s'est révélée inférieure à celle d'une résine standard pétrosourcée mais aucune évidence qui suggère que cela est du à la présence des monomères biosourcées n'a été détectée. Cela suggère que la création d'une résine biosourcée et suffisamment durable pour l'extérieur sera possible / Moving away from petroleum and towards biobased materials not only leads to greater sustainability and lower dependence on diminishing fossil resources, but can also catalyse the discovery of new properties. Aliphatic polyesters based on renewable resources have already started to replace traditional products. Within the Sorago project, a fully biobased resin for interior coil coatings has recently been proposed on the market (Estetic® Bio Air, Arcelor Mittal). In order to extend the possible use of the biobased product to exterior applications, an improvement of its resistance to humidity and UV radiation is crucial. This presents two challenges: The limited availability of monomers which provide rigidity in the resin structure and the relationship between the resin composition and its weatherability. Vanillin was chosen as a possible extension to the range of rigid, biobased monomers for polyesterification reactions. The transformation of its aldehyde and its reactivity was studied in terms of catalytic activation and through a series of copolymerisations which revealed the influence of the reaction conditions on the composition of the product. A structure-property relationship concerning the coating glass transition temperature and visco-elastic behaviour of the coating was furthermore established for a series of renewable monomers and contrasted with petroleum based equivalents. Series of prototypes with a wide variety of properties were then subjected to accelerated weathering tests. Their degradation was followed directly by gloss retention and different mechanisms were revealed using FTIR, µ-hardness and film thickness measurements. While the performance of the biobased coating was subpar, no evidence linking its degradation to the presence of renewable monomers was found, suggesting that the creation of a sufficiently durable and renewable exterior coating will be possible

La chimiothérapie conventionnelle est principalement constituée d’agents pro-apoptotiques. Or, de nombreux cancers sont intrinsèquement résistants à l’apoptose et cela explique en grande partie les mauvais pronostics associés à certains cancers, dont les cancers métastatiques, en raison de leur résistance aux chimiothérapies pro-apoptotiques. La thématique de ce travail s’inscrit dans la recherche de molécules présentant des modes d’actions différents afin de vaincre les mécanismes de résistance des cellules cancéreuses. <p><p>Une nouvelle série de composés di- et trivanilliques a ainsi été déclinée. La structure de ces composés est inspirée de molécules naturelles divanilliques étudiées pour leurs propriétés anti-falciformation dans la drépanocytose. Notre stratégie a été de transposer l’activité présumée de ces composés sur le cytosquelette des érythrocytes falciformes au niveau de la prolifération et de la migration des cellules cancéreuses. A cette fin, des méthodes pour analyser l’activité antitumorale de cette série de nouveaux composés ont été mises en place.<p><p>In vitro, les composés que nous qualifions d’actifs inhibent la croissance d’une dizaine de populations cellulaires cancéreuses distinctes à des valeurs inhibitrices de croissance à 50 % (indice IC50) de l’ordre de 30 µM. Les dérivés trivanilliques se classent parmi les composés les plus actifs de la série, en particulier le composé trivanillique chloré 13c qui exerce un effet cytostatique sur les lignées cellulaires cancéreuses analysées tout en présentant un certain taux de biosélectivité vis-à-vis des cellules normales. Nous avons ainsi consacré une partie de ce travail à approfondir la compréhension du mécanisme d’action du composé 13c et à le comparer à ses analogues de synthèse pour tenter d’établir une relation de type structure-activité.<p><p>Le dérivé 13c est cytostatique car il interfère avec le processus mitotique et il inhibe à plus de 75 % l’activité de 26 kinases à la concentration de 2 µM qui est donc plus de dix fois inférieure à la concentration inhibitrice IC50 moyenne de 30 µM rapportée ci-avant. Huit de ces 26 kinases sont directement impliquées dans l’organisation du cytosquelette d’actine et notamment dans les processus de cytokinèse. Parmi les kinases dont l’activité est la plus fortement modifiée par le composé 13c figurent les Aurora kinases qui sont de puissants contrôleurs de la cytokinèse. Nos résultats montrent également que l’activité cytostatique du composé 13c entraînant une désorganisation du cytosquelette d’actine pourrait être induite non seulement par l’inhibition de l’activité de certaines kinases mais aussi par des modifications induites par ce produit au niveau de l’homéostasie du calcium intracellulaire.<p><p>L’efficacité des agents chimiothérapeutiques est souvent altérée par une résistance tumorale intrinsèque appelée résistance multidrogue (le phénotype MDR). In vitro, le composé 13c s’est montré tout aussi efficace sur des lignées cancéreuses possédant cette résistance multidrogue que sur des cellules cancéreuses sensibles aux agents chimiothérapeutiques. De même, diverses lignées cellulaires résistantes aux stimuli pro-apoptotiques sont également sensibles à l’activité inhibitrice de croissance in vitro du trivanillate 13c. <p><p>Enfin, l’activité du composé 13c a été testée in vivo sur un modèle de pseudométastases pulmonaires issues du mélanome B16F10 murin. Les tumeurs pulmonaires présentent une cible intéressante pour le composé 13c au vu de son activité anti-tyrosine kinase comprenant la kinase EGFR et ses formes mutées EGFR-L858R et EGFR-T790M fréquemment retrouvées au sein des cancers du poumon non-à-petites-cellules (NSCLC). Le principe actif a été administré dans les poumons par inhalation via un dispositif endotrachéal. La voie inhalée est avantageuse par rapport à la voie systémique pour l’administration du produit 13c car cette molécule possède des liaisons esters qui sont hydrolysables par les estérases plus présentes au niveau des voies systémiques que dans les tissus pulmonaires. L’inhalation permet aussi de cibler mieux le site tumoral afin de réduire les dommages collatéraux. <p><p>Ce travail offre des perspectives au niveau de l’élaboration de formulations permettant d’augmenter la biodisponibilité de la molécule 13c. Une association d’un traitement au composé 13c et d’une chimiothérapie conventionnelle est envisagée car elle pourrait potentialiser les effets de ces deux traitements. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Vanilla planifolia, orchidée épiphite florifère, est la principale source naturelle de l'arôme de vanille. Largement utilisé dans les produits laitiers, les boissons, les pâtisseries et les parfums, cet arôme est le résultat d'un processus complexe : de huit à neuf mois après la fécondation des fleurs, les gousses matures sont récoltées et traitées pendant environ un an afin de libérer leur bouquet aromatique. Aujourd'hui, plus de la moitié de la production mondiale de vanille provient de Madagascar. Pour faire face à cette concurrence, les producteurs de la Réunion se tournent vers la production de vanille "haut de gamme". L'exploitation des vanilliers les plus intéressants du point de vue aromatique est donc favorisée. Toutefois, les programmes d'amélioration se heurtent au manque de connaissances sur la physiologie de la plante. Il devient alors essentiel de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et biochimiques impliqués dans la production aromatique des gousses de V. planifolia. Dans ce travail de thèse, une analyse des métabolites présents dans les gousses vertes et les feuilles de vanille a été effectuée par Résonance Magnétique Nucléaire. Cette technique permet l'évaluation qualitative et quantitative des métabolites primaires (sucres, acides animés et organiques...) et secondaires (composés phénoliques...) présents dans la plante dans diverses conditions physiologiques : au cours du développement de la gousse, lors d'une infection virale, selon les saisons ou encore sur différentes accessions. / Vanilla planifolia, a flowering epiphitic orchid, is the major natural source of vanilla flavour. Largely used in dairy products, beverages, bakeries and perfume, vanilla flavour is obtained after a long process: from eight to nine months after flower pollinisation, mature pods are harvested and then prepered during about one year in order to release the characteristic vanilla aroma. Nowadays, more than half vanilla pods world production comes from Madagascar. To face the concurrence, a solution could be develop higher quality pods. Selection of the most aromatic vanilla plant is then preferred. Nevertheless, amelioration program are facing up to a lack of knowledge in vanilla plant physiology. It is now essential to understand more the physiological and biochemical mechanisms implied in the aromatic production of V. planifolia pods. In this thesis, a metabolomic analysis of vanilla green pods and leaves has been performed by nuclear magnetic resonance. This technique has allowed the qualitative and quantitative analysis of primary (sugar, amino and organic acids...) and secondary metabolites (phenolic compounds...) present in vanilla plant according to various physiological conditions: developing pods, viral infection, inter-accession or seasonal variation.

La présence d’un métabolisme actif des bactéries lactiques dans le vin logé en fûts de chêne induit une augmentation de la concentration des composés volatils du bois. Ce phénomène a récemment été attribué à l'activité glycosidique des bactéries. Le glucoside précurseur d'un composé majeur de l’arôme boisé (whiskylactone) a déjà été identifié et quantifié dans le bois de chêne. Mais aucune donnée n'était disponible jusqu’à présent concernant l’identification formelle des précurseurs pour d’autres arômes du bois de chêne.Un premier travail a permis de montrer que les précurseurs monoglycosides n'existaient pas dans le bois de chêne, dans les spiritueux et dans le vin. L'étude a été réalisée à l’aide de la technique UPLC-FT/MS, en utilisant la vanilline-β-D-glucopyranoside, la vanilline-β-D-xylopyranoside, et la coniféraldéhyde-β-D-glucopyranoside, synthétisées par réaction par transfert de phase. Dans un deuxième temps, une purification des précurseurs glycosidiques complexes a été réalisée à l’aide de la Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) à partir d’un extrait de bois de chêne. Le choix du système de solvants a été basé sur une égale répartition dans les deux phases de la libération d’arômes par hydrolyse enzymatique. Cela a conduit à la détermination du nouveau concept de coefficient de partage d’activité Kca. Après purification et fractionnement, la vanilline galloylglucoside, le triméthoxyphénol-galloyl-glucoside et le macarangioside E ont été isolés du bois et identifiés par HPLC-ESI-MS et RMN. Ces précurseurs ont été quantifiés dans différentes espèces de chêne par HPLC-QqQ-MS. Ces trois composés sont les précurseurs respectivement de la vanilline, du 3,4,5-triméthoxyphénol et du 3-oxo-α-ionol. Par dégradation thermique, le macarangioside E peut conduire à la mégastigmatriénone et à la 4-oxo-isophorone, dont les notes aromatiques sont le tabac et l’encens. Ces composés complètent la connaissance que nous avons de l’arôme boisé du vin et contribuent ainsi à une meilleure compréhension de la genèse du bouquet tertiaire. / The presence of lactic acid bacteria (LAB) in oak barrels induces an increase in wood volatile compounds concentration. This phenomenon could be due to the glycosidic activity of LAB. The glucosidic precursor of a major woody aroma compound (oak lactone) was identified and quantified in oak wood but no data was available concerning the presence of other flavor precursors in oak wood. This study showed that monoglycosidic precursors did not exist in oak, in spirits and in wines. The study was performed by UPLC-FT/MS, using vanillin-β-D-glucopyranoside, vanillin-β-D-xylopyranoside, and coniferaldehyde-β-D-glucopyranoside as standards. These molecules were synthesized by phase transfer reaction. Purification of a vanillin glycoside precursor was done by centrifugal partition chromatography (CPC). The choice of the solvent system was based on an equal distribution in both phases of the aromas released by enzymatic hydrolysis. This led to the determination of the new concept, the activity partition coefficient Kca. After purification and fractionation, vanillin galloylglucoside, trimethoxyphenol-galloylglucoside and macarangioside E were isolated from wood and identified by HPLC-ESI-MS and NMR analysis. These precursors were quantified in different oak species by HPLC-QqQ-MS. These three compounds are precursors of vanillin, 3,4,5-trimethoxyphenol and 3-oxo-α-ionol respectively. The macarangioside E can lead by thermal degradation, to megastigmatrienone and 4-oxo-isophorone which have aromatic notes of tobacco and incense. These compounds are involved in the woody aroma of the wine and the genesis of the bouquet.