As fissuras orofaciais não-sindrômicas (FO-NS) correspondem a 70% de todos os casos de FO, possuem etiologia complexa e pouco compreendida, sendo consideradas de herança multifatorial com forte influência de fatores genéticos e ambientais. Apesar de estudos de análise de ligação e associação apontarem vários loci de susceptibilidade às FO-NS, o componente genético ainda não está totalmente explicado. Fatores ambientais também possuem um importante papel na etiologia das FO, e alguns já foram replicados em várias populações. Fatores como exposição materna ao álcool, drogas, tabaco, medicamentos, desnutrição e baixo nível socioeconômico são alguns dos fatores já associados a esta condição. As infecções periodontais são comuns em mulheres grávidas e estão associadas a parto prematuro, baixo peso fetal e, mais recentemente, foram reportadas como fator de risco aumentado para FO-NS nos fetos. Adicionalmente, o avanço das tecnologias de sequenciamento do DNA melhorou exponencialmente a compreensão do microbioma humano e sua influência no estado de saúde e doença, e, mais especificamente, o conhecimento sobre o impacto do microbioma na gravidez. O objetivo deste projeto foi identificar novos fatores etiológicos genéticos e ambientais das FO-NS. Para isso, primeiramente, sequenciamos 68 genes candidatos a FO por sequenciamento de nova geração em 193 indivíduos com FO-NS familial. Nós encontramos enriquecimento significativo de variantes raras e patogênicas de perda de função nos indivíduos com FO-NS e observamos que essas variantes estão em genes intolerantes a esse tipo de mutação. Também reportamos novas variantes raras do tipo perda de função no gene ARHGAP29 e sua importância na susceptibilidade as FO-NS familiais. Além disso, sugerimos o uso de um ponto de corte baseado no escore pLI do banco de dados ExAC como parâmetro para priorizar variantes em estudos de FO-NS familiares, assumindo modelo de herança mono ou oligogênico. Adicionalmente, estudamos o microbioma oral de mães de crianças com FO-NS e mães de crianças sem malformações, utilizando o sequenciamento da subunidade 16S do rRNA das bactérias com o objetivo de verificar diferenças consistentes na composição do microbioma oral de mães de crianças com FO-NS, levando em consideração a presença ou não de doenças infecciosas periodontais maternas. A casuística foi composta de 6 mães de recém-nascidos de até 1 mês que apresentaram FO-NS ao nascimento e mães de crianças sem qualquer malformação congênita. As análises de alfa e beta diversidades não demonstraram diferença significativa na composição do microbioma oral de mães de crianças com FO-NS e mães de crianças controle, contudo observamos que o grupo com infecções periodontais possui a diversidade taxonômica mais abundante do que o grupo hígido. Em resumo, nesse estudo piloto não foi possível identificar alterações no microbioma oral como um fator etiológico das FO-NS. Novas análises em uma casuística maior são necessárias para a confirmação desse achado / The non-syndromic orofacial clefts (nsOFC) correspond to 70% of all OFC cases, have complex etiology and are poorly understood, being considered multifactorial inheritance with a strong influence of genetic and environmental factors. Although linkage and association analysis studies point to several nsOFC susceptibility loci, the genetic component is not yet fully explained. Environmental factors also play an important role in OFC etiology, and some have been replicated in several populations. Factors such as maternal exposure to alcohol, drugs, tobacco, drugs, malnutrition and low socioeconomic status are some of the factors already associated with this condition. Periodontal infections are common in pregnant women and are associated with preterm birth, low birth weight and, more recently, have been reported as an increased risk factor for nsOFC in fetuses. Additionally, the advancement of DNA sequencing technologies has exponentially improved the understanding of the human microbiome and its influence on health and disease status, and, more specifically, knowledge about the impact of the microbiome on pregnancy. The objective of this project was to identify new genetic and environmental etiological factors of nsOFC. For this, we first sequenced 68 candidate genes by next generation sequencing in 193 individuals with familial nsOFC. We found significant enrichment of rare and pathogenic loss of function variants in individuals with nsOFC and we observed that these variants were in genes intolerant to this type of mutation. We also reported new rare loss-of-function variants in the ARHGAP29 gene and its importance in the liability of familial nsOFC. In addition, we suggested the use of a cutoff point based on the ExAC database pLI score as a parameter to prioritize variants in familial nsOFC studies, assuming a mono or oligogenic inheritance model. In addition, we studied the oral microbiome of 6 mothers of newborns up to 1-month-old with nsOFC and 6 mothers of newborns without congenital malformations using the 16S rRNA sequencing in order to verify consistent differences in the composition of the oral microbiome of mothers of children with nsOFC, taking into account the presence or absence of maternal periodontal infectious diseases. The analysis of alpha and beta diversities did not show a significant difference in the composition of the oral microbiome of mothers of nsOFC children and mothers of control children, however, we observed that the group with periodontal infectious diseases has more abundant taxonomic diversity than the healthy group. In summary, in this pilot study, it was not possible to identify alterations in the oral microbiome as an etiological factor of FO-NS. New analyzes in a larger cohort are necessary to confirm this finding

O transtorno do espectro do autismo (TEA) constitui um grupo heterogêneo e altamente prevalente de doenças do neurodesenvolvimento. Análises genômicas recentes têm revelado um grande número de variantes genéticas potencialmente deletérias nos pacientes com TEA, a maioria rara ou privada. Um enorme desafio atual é determinar quais dentre essas variantes são as que de fato estão envolvidas na etiologia do transtorno nos pacientes, e quantas variantes patogênicas são necessárias para a penetrância completa do TEA em cada paciente. Recentemente, por meio do sequenciamento completo do exoma de um subgrupo de pacientes com TEA não-sindrômico - nos quais observamos hiperfuncionamento da via de sinalização intracelular mTORC1 - identificamos que um dos pacientes (referido como F2688) é heterozigoto composto para variantes de substituição de aminoácidos raras e potencialmente deletérias no gene ELN. Este gene codifica Relina, uma grande glicoproteína de matriz extracelular que, por meio da ativação da proteína Dab1 e de diferentes vias de sinalização intracelular, controla a migração e o posicionamento dos neurônios, a arborização de neuritos, e o funcionamento das sinapses em várias regiões do encéfalo, tanto no desenvolvimento embrionário como na vida adulta. Estudos anteriores já haviam descrito variantes em heterozigose potencialmente de perda de função no gene RELN em pacientes com TEA; contudo, nenhum desses estudos investigou disfunção da sinalização Relina-Dab1 nos pacientes e, portanto, os efeitos moleculares e celulares de tais variantes sobre células neurais humanas ainda são poucos explorados. Neste trabalho, utilizando células neuroprogenitoras (NPCs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas do paciente F2688, de outros pacientes com TEA sem mutação em RELN (n=5) e de indivíduos controles (n=5), nós descrevemos que as NPCs do paciente F2688 apresentam: i) disfunção da via de sinalização Relina-Dab1; ii) hiperfuncionamento da via de sinalização mTORC1; iii) crosstalk anormal entre as vias de sinalização Relina-Dab1 e mTORC1, o qual é atenuado com o uso da rapamicina, um inibidor específico de mTORC1. Portanto, nossos resultados sugerem, pela primeira vez, uma relação anormal entre as vias de sinalização Relina-Dab1 e mTORC1 em TEA não-sindrômico / Autism Spectrum Disorder (ASD) is a heterogeneous and highly prevalent group of neurodevelopmental disorders. Whole-genome-based approaches have generated catalogues of thousands of rare and potentially deleterious genetic variants in ASD patients. However, the challenge now is to identify genuine disease-causing/risk variants among the multitude of variants discovered in each exome/genome and how many variants are required to cause the disease. Recently, we performed whole-exome sequencing in a subgroup of ASD patients - in whom we found mTORC1 signaling hyperfunction - and identified rare and potentially deleterious compound heterozygous variants in the RELN gene in one patient (called as F2688). The RELN gene encodes Reelin, a large secreted glycoprotein that controls neuronal migration, layer formation, neurite outgrowth, and plasticity of synapses in both the developing and the adult brain. Evidence from previous studies suggests that certain potential loss-of-function variants in RELN gene can contribute to ASD susceptibility; however, few studies today have directly demonstrated impairment of the Reelin signal transduction cascade in ASD patients and therefore, the molecular and cellular effects of these variants in human neuronal cells are still poorly explored. Here, by using induced pluripotent stem cells derived neuronal progenitor cells from F2688 patient, from other ASD patients who do not carry RELN disrupting variants (n=5) and from control individuals (n=5), we have demonstrated that F2688-derived NPCs show: i) impaired Reelin-Dab1 signaling; ii) overactive mTORC1 signaling; iii) and abnormal crosstalk between mTORC1 and Reelin-Dab1 signaling pathways, which it attenuated by rapamycin (a specific mTORC1 inhibitor). Taken together, our results point to an abnormal interplay between mTORC1 and Reelin-Dab1 networks in nonsyndromic ASD

The aetiology of common diseases is shaped by the effects of genetic and environmental factors. Big efforts have been devoted to unravel the genetic basis of disease with the hope that it will help to develop new therapeutic treatments and to achieve personalized medicine. With the development of high-throughput genotyping technologies, hundreds of association studies have described many loci associated to disease. However, the depiction of disease architecture remains incomplete. The aim of this work is to perform exhaustive comparisons across human populations to evaluate pressing questions. Our results provide new insights in the allele frequency of risk variants, their sharing across populations and the likely architecture of disease / La etiología de las enfermedades comunes está formada por factores genéticos y ambientales. Se ha puesto mucho empeño en describir sus bases genéticas. Este conocimiento será útil para desarrollar nuevas terapias y la medicina personalizada. Gracias a las técnicas de genotipado masivo, centenares de estudios de asociación han descrito una infinidad de genes asociados a enfermedad. Pese a ello, la arquitectura genética de las enfermedades no ha sido totalmente descrita. Esta tesis pretende llevar a cabo exhaustivas comparaciones entre poblaciones para responder diversas preguntas candentes. Nuestros resultados dan pistas sobre la frecuencia de los alelos de riesgo, su presencia entre poblaciones y la probable arquitectura de las enfermedades.