Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation. / The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event.

Les eucaryotes expriment des variants d'histones non-alléliques en faible quantité en plus des histones conventionnels. De récentes données ont montré que ces variants d'histones sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires dont la réparation de l'ADN, la ségrégation des chromosomes ou encore le contrôle de la transcription. L'objectif de cette étude est d'améliorer la compréhension du rôle biologique des variants d'histones. Les travaux rapportés dans ce manuscrit abordent plus spécifiquement la fonction de deux variants: H2BFWT, qui joue un rôle dans la spermatogenèse chez l'homme; et macroH2A1 qui semble impliqué dans la répression transcriptionnelle.<br />Nous avons montré que malgré sa grande divergence avec H2B, l'incorporation de H2BFWT ne modifie pas la structure globale du nucléosome. Néanmoins, contrairement à l'histone somatique H2B, H2BFWT n'a pas la capacité de recruter les facteurs d'assemblage du chromosome et n'est pas requis pour la condensation du chromosome mitotique. Cette différence de comportement vis-à-vis de l'assemblage des chromosomes suggère que H2BFWT pourrait être impliqué dans l'architecture de structure d'ordre supérieur de la chromatine.<br />Dans le but d'élucider le rôle biologique de macroH2A1 in vivo, nous avons généré une lignée de souris invalidées pour macroH2A1.<br />Malgré l'abondance des investigations portant sur macroH2A1, sa fonction reste inconnue. MacroH2A1 a la particularité d'être trois fois plus grand que H2A, il comporte ainsi une extension C-terminale de fonction inconnue. Initialement macroH2A1 avait été décrit comme principalement localisé sur le chromosome X inactif. La signification biologique de cet enrichissement n'est pas comprise. In vitro, la présence de macroH2A1 interfère avec la transcription. De récentes études ont montré que certaines séquences d'ADN méthylées, incluant les gènes soumis à l'empreinte et les rétrotransposons sont enrichies en nucléosomes contenant macroH2A1. Il a également été démontré que c'est la méthylation de l'ADN, nécessaire pour la répression transcriptionnelle, qui permet le recrutement de macroH2A1 sur les rétrotransposons. Nous émettons l'hypothèse que la méthylation de l'ADN aboutirait à la répression des rétrotransposons via le recrutement de macroH2A1.<br />L'étude du phénotype des souris déficientes en macroH2A1 permet de conclure que contrairement au consensus actuel, macroH2A1 n'est pas nécessaire pour réprimer la transcription des séquences répétées incluant les rétrotransposons.<br />Les examens anatomopathologiques suggèrent que macroH2A1 pourrait être impliqué dans la régulation du métabolisme des acides gras.

Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation.

CENP-A est le variant d’histone qui remplace spécifiquement l’histone H3 au niveau des centromères et confère ses propriétés uniques à la chromatine centromérique. La cristallographie aux rayon X, ainsi que la digestion à la MNase des nucléosomes contenant CENP-A suggèrent une flexibilité de l’ADN entrant et sortant de ce nucléosome. Néanmoins ces déductions restent aujourd’hui au stade hypothétique, en particulier, rien n’est connu sur le rôle éventuelle de cette particularité dans la fonction du nucléosome CENP-A. L’utilisation de la cryo-électromicroscopie nous a permis de déterminer les caractéristiques de la dynamique de l’ADN sortant du nucléosome CENP-A. Nos analyses biochimiques, de protéomiques et de pseudo-génétiques révèlent que la flexibilité élevée de l’ADN du nucléosome CENP-A ne permet pas l’interaction avec l’histone de liaison H1. In vitro, remplacer les 2 tours de l’hélice aN de CENP-A avec les 3 tours de l’hélice aN de H3 permet de restaurer l’interaction de l’histone H1. In vivo, le replacement des nucléosomes CENP-A par des nucléosomes contenant ce même nucléosome hybride aN-CENP-A permet également le recrutement de H1, mais cela conduit également à la délocalisation d’un certain nombre de protéines du kinétochore. Ce kinétochore ne permet pas une ségrégation correcte des chromosomes et il conduit à des phases de mitose et de cytokinèse défectueuses. L’ensemble de ces données montre que la conservation au cours de l’évolution de la flexibilité de l’ADN dans le nucléosome CENP-A est essentielle pour l’accomplissement de la division cellulaire. / CENP-A is a histone variant, which replaces histone H3 at centromeres and confers unique properties to centromeric chromatin. The crystal structure and MNase digestion of CENP-A nucleosome suggests flexible nucleosomal DNA ends but their dynamics in solution remains elusive and their implication in centromere function is unknown. Using electron cryo-microscopy we determined the dynamic solution properties of the CENP-A nucleosome. Our biochemical, proteomic and genetic data reveal that the high flexibility of the DNA ends impairs histone H1 binding to the CENP-A nucleosome. Substituting the 2-turn aN-helix of CENP-A with the 3-turn N-helix of H3 results in particles able to bind histone H1. In vivo replacement of CENP-A nucleosomes with the same NH3-CENP-A hybrid nucleosomes leads to H1 recruitment, delocalization of kinetochore proteins and significant mitotic and cytokinesis defects. Put together, ourdata reveal that the evolutionarily conserved flexible ends of the CENP-A nucleosomes are essential to ensure the fidelity of the mitotic pathway.

La nucléoline, une des protéines non-ribosomique les plus abondantes du nucléole, semble être impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l'ADN en plus de son rôle dans la régulation de la transcription par l'ARN polymérase I, la maturation du pré-ARNr et l’assemblage des ribosomes. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'interaction de la nucléoline avec la chromatine, et de déchiffrer la fonction de la nucléoline dans la régulation de l’expression génique. Il a été rapporté que la nucléoline est nécessaire pour la transcription des gènes codant pour l'ADN ribosomal in vivo, mais le mécanisme par lequel la nucléoline module la transcription d’ARN polymérase I (Pol I) est inconnue. Dans cette thèse, je montre que l’inhibition de l’expression de la nucléoline par siRNAconduit dans les gènes de l’ADNr à une augmentation de la marque hétérochromatine et une diminution des marques caractéristiques de l’euchromatine. La nucléoline est associée à des gènes ADNr non méthylés et ChIP-seq montrent un fort enrichissement de la nucléoline dans le promoteur et la région codante de l'ADNr. La nucléoline est capable d'interférer avec la liaison de TTF-1 sur le terminateur T0 proches du promoteur inhibant ainsi le recrutement du sous-unité NoRC TIP5 et HDAC1 et la création d'un état répressif hétérochromatine. Cette invasion de macroH2A1 dans le nucléole joue un rôle majeur dans l'inhibition de la transcription par la RNA Polymérase I en l'absence de la nucléoline. Ces résultats révèlent l'importance de la nucléoline pour le maintien de l'état euchromatien de l'ADNr et le rôle de macroH2A1 dans la régulation de la transcription de l'ADNr. / Besides the well-known role of the nucleolus in ribosome biogenesis, nucleoli play important roles in the regulation of many fundamental cellular processes, including cell cycle regulation, apoptosis, telomerase production, RNA processing and therefore it is not surprising that many nucleolar proteins appear to be multifunctional proteins. Nucleolin, one of the most abundant non-ribosomal proteins of the nucleolus, has been the focus of many studies since it was first described 35 years ago. It seems to be involved in many aspects of DNA metabolism, chromatin regulation and appeared to be a good pharmacological target for drug development in addition to its role in RNA polymerase I transcription and pre-ribosomal processing and assembly in pre-ribosomes. In eukaryotic cells, DNA is packed into nucleosomes to form chromatin in the nucleus. The cells develop a variety of strategies to overcome the nucleosomal barriers. These strategies include DNA methylation, histone post-translational modifications, incorporation of histone variants and ATP dependent chromatin remodeling. The aim of this thesis is to study the interaction of nucleolin with chromatin, and to decipher the mechanism of nucleolin in gene regulation. It was reported that nucleolin possesses a histone chaperone activity, helps the transcription through nucleosomes, and it is required for ribosomal DNA gene (rDNA) transcription in vivo, but the mechanism by which nucleolin modulates RNA polymerase I (Pol I) transcription is unknown. In the thesis it is shown that nucleolin knockdown results in an increase of the heterochromatin mark H3K9me2 and a decrease of H4K12Ac and H3K4me3 euchromatin histone marks in rDNA genes. Nucleolin is associated with unmethylated rDNA genes and ChIP-seq experiments identified a strong enrichment of nucleolin in the promoter and coding regions of rDNA. Nucleolin is able to interfere with the binding of TTF-1 on the promoter-proximal terminator T0 thus inhibiting the recruitment of the nucleolar remodeling complex (NoRC) subunit TIP5 and HDAC1 and the establishment of a repressive heterochromatin state. In addition, in absence of nucleolin or after inhibition of Pol I by actinomycin D, a strong relocalization of the histone variant macroH2A1 to the nucleolus and on the rDNA genes was observed. This invasion of macroH2A1 in the nucleolus plays a major role in the inhibition of Pol I transcription in absence of nucleolin, as knockdown of macroH2A1 eliminates the repressive effect of nucleolin depletion. These results reveal the importance of nucleolin for the maintenance of the euchromatin state of rDNA required for an efficient production of ribosomal RNAs and the role of macroH2A1 in rDNA transcription.