Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Maria Carolina Scatolin do Rio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:03:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_GleidsonSilva_M.pdf: 21908086 bytes, checksum: 84eb6f9c294915ecdd74ee2e9d23a152 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Vassoura-de-bruxa é uma das principais doenças que acometem o cacaueiro (Theobroma cacao L.). Ela é causada pelo fungo hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa. Durante a fase biotrófica, o patógeno coloniza o espaço intercelular e estimula a formação de ramos hipertróficos/ hiperplásicos denominados vassoura verde. No estágio avançado da doença, o fungo passa a colonizar também o interior das células e observa-se a morte do tecido originando a vassoura seca. Homogalacturonano (HG) é um domínio estrutural péctico que constitui a matriz da parede celular primária e define suas propriedades funcionais e estruturais. Durante sua síntese, HG é altamente metilesterificado pela ação de pectinas metiltransferases (PMT) que utilizam S-adenosil-L-metionina (SAM) como fonte de grupos metil. Após ser depositado na parede celular, o padrão de metilesterificações de HG é modelado por pectina metilesterases (PME). Alterações no padrão de metilesterificação de HG são relacionadas à má formação de tecidos, complicações durante o desenvolvimento vegetal e à resistência contra a degradação da parede celular por enzimas microbianas. Neste trabalho, a expressão tecido-específica de genes envolvidos nas reações de síntese de SAM e o grau de metilesterificação do HG foram analisadas em plântulas de T. cacao sadias e infectadas. ESTs (expressed sequence tags) de T. cacao foram utilizadas como molde para a síntese de sondas de RNA específicas para os genes: glicosiltransferase, pectina metiltransferase, pectina metilesterase, S-adenosil-Lhomocisteína hidrolase, adenosina quinase, S-adenosil-L-metionina sintetase (SAMS). Além disso, os anticorpos monoclonais JIM5 e JIM7 foram utilizados na imunolocalização de epítopos de HG com menor ou maior grau de metilesterificação. A detecção de transcritos de SAMS e PMT indicou que esses são diferentemente expressos em plântulas sadias e infectadas. Nas plântulas sadias, o sinal para o gene SAMS foi mais intenso nas amostras coletadas com 14 dias após a inoculação (DAI), comparado com as coletadas 42 DAI. Nas amostras infectadas o sinal não variou, entretanto, foi menos intenso comparado com o de plântulas sadias. A marcação de PMT foi evidente no ápice de plântulas sadias coletadas 42 DAI e ausente nas coletadas com 14 DAI. Interessantemente, a ocorrência foi inversa em plântulas infectadas. Epítopos de HG altamente metilesterificados foram detectados por JIM7 em ambas as amostras sadias e infectadas. Entretanto, com 42 DAI, a ligação de JIM7 foi detectada apenas em plântulas sadias, enquanto resíduos de HG pouco metilesterificados, reconhecidos por JIM5, foram observados nas amostras infectadas. Juntos, os resultados sugerem que 1) com 42 DAI, SAM disponível estaria sendo preferencialmente utilizado como precursor de outros compostos e não para a metilesterificação de pectinas e; 2) a alteração do grau de metilesterificação do HG em plantas infectadas pode ser resultado da menor disponibilidade de SAM, da menor expressão do gene que codifica a enzima PMT e/ou da atividade de PMEs, favorecendo assim, a degradação da parede celular por enzimas do fungo em um período onde a degradação da parede é essencial para progressão da doença. / Abstract: The witches' broom disease is one of the major diseases affecting the cocoa (Theobroma cacao L.). It is caused by the hemibiotrophic Moniliophthora perniciosa fungus. During its biotrophic phase, the pathogen colonizes the intercellular space and stimulates the formation of hypertrophic/hyperplasic branches called green broom. In the advanced stage of the disease, the fungus starts also to colonize the interior of the cells and it is noted the death of tissue originating the dry broom. Homogalacturonan (HG) is a pectic structural domain that constitutes the primary cell wall matrix and defines its functional and structural proprieties. During its synthesis, HG is highly methylesterified by the action of pectin methyltransferases (PMT) which uses S-adenosyl-L-methionine (SAM) as a source of methyl groups. After being deposited in the cell wall, the pattern of HG methylesterifications is modeled by pectin methylesterases (PME). Changes in the pattern of HG methylesterifications are related to poor tissue formation, complications during plant development and resistance to cell wall degradation by microbial enzymes. In this study, the tissue-specific expression of genes involved in the reaction of synthesis of SAM and the degree of HG methylesterification were analyzed in seedlings of healthy and infected T. cacao. ESTs (expressed sequence tags) of T. cacao were used as a template for the synthesis of specific RNA probes for the genes: glycoyltransferase, pectin methyltransferase, pectin methylesterase, S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, adenosine kinase and S-adenosyl-L-methionine synthetase (SAMS). Furthermore, the monoclonal antibodies JIM5 and JIM7 were used in the immunolocalization of HG epitopes with lesser or grater degrees of methylesterification. The detection of transcripts of SAMS and PMT indicated that these are expressed differently in healthy and infected seedlings. In healthy seedlings, the signal of the SAMS gene was more intense than in samples collected 14 days after inoculation (DAI), compared to those collected 42 DAI. In the infected samples the signal did not change, however, it was less intense compared to healthy seedlings. The PMT staining was evident in the shoot apex of the healthy seedlings collected 42 DAI and missing in the ones collected 14 DAI. Interestingly, the occurrence was the inverse in infected seedlings. Highly methylesterified HG epitopes were detected by JIM7 in both healthy and infected samples. However, with 42 DAI, the JIM7 binding was detected only in healthy seedlings, while residues of less methylesterified HG, recognized by JIM5, were observed in the infected samples. Taken together, the results suggest that: 1) with 42 DAI, available SAM would be primarily used as a precursor to other compounds and not to methylesterification of pectins and; 2) the changes in the level of HG methylesterification in infected plants may be the result of the lower availability of SAM, lower expression of PMT and/or the activity of PMEs, thereby favoring the degradation of the cell wall by the fungus enzymes in a time where the degradation of the wall is essential to the progression of the disease. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo A. Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiburcio_RicardoAugusto_D.pdf: 13957444 bytes, checksum: 5d1ae127f2574323a433b1478aeb3efe (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora é um fungo basidiomiceto hemibiotrófico causador da vassoura de bruxa no cacau (Theobroma cacao L.). Esta doença é caracterizada pela produção de ramos hiperplásicos e hipertróficos e frutas partenogênicos durante a fase biotrófica, seguido por necrose dos tecidos infectados durante a fase necrotrófica. Esta é a principal doença da produção de cacau na América do Sul e no Caribe, tendo causado uma diminuição de mais de 65% na produção no sul da Bahia, a principal região produtora do país. Vários genes relacionados à patogenicidade foram encontrados em M. perniciosa como parte do Projeto Genoma da Vassoura de Bruxa. No entanto, os padrões de evolução destes genes, que poderiam ajudar a compreender a evolução da fitopatogenicidade dessa espécie, ainda não foram estudados. Também não foram estudados as mudanças ocorridas no genoma desta espécie durante a sua evolução. Estas mudanças são particularmente relevantes uma vez que a maioria das espécies estreitamente relacionadas com M. perniciosa não é fitopatogênica. Desta forma a compreensão da evolução deste modo de vida na espécie poderia ajudar a entender a evolução de fungos fitopatógenos em geral. Este trabalho tem como objetivo ampliar o conhecimento sobre o surgimento da patogenicidade em M. perniciosa analisando a evolução dos genes potencialmente relacionados a ela, aumentando assim o conhecimento sobre a vassoura de bruxa e ajudando na busca por uma maneira de controlar a doença. Para isso, foram estudados os padrões de evolução de diversos genes ligados ao processo de necrose característica da vassoura de bruxa e genes candidatos a terem sido obtidas por transferência horizontal de genes (HGT). Os resultados indicam que a evolução da patogenicidade em M. perniciosa envolveu tanto à aquisição de novos genes quanto a utilização para novas funções de outros já presentes nos ancestrais saprotróficos. Em particular, a busca de genes horizontalmente transferidos encontrou dois genes potencialmente envolvidos na doença que ainda não tinham sido estudados, sugerindo que a análise evolutiva a nível genômico é um instrumento relevante para a escolha de genes candidatos para análises em bancada. / Abstract: Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora is a hemibiotrophic basidiomycete fungus that causes witches' broom disease in cocoa (Theobroma cacao L.). This disease is characterized by the production of hyperplasic and hypertrophic stems and parthenogenetic fruits during biotrophic life-phasee, followed by necrosis of infected tissues during necrotrophic life-phase. This is the main disease affecting the cocoa production in South America and the Caribbean, causing a decrease of more than 65% in the production in southern Bahia, the main producing region. Several genes related to pathogenicity were found in M. perniciosa as part of the Witches' Broom Genome Project. However the patterns of evolution of these genes, that could help to understand the evolution of plant pathogenicity in this species, were not yet studied. Also the changes occurred in this species at a genomic level during its evolution were not studied. These changes are particularly relevant since the majority of species closely related to M. perniciosa is not phytopathogenic and so the understanding of this evolution would help to understand the evolution of plant pathogens in general. This work attempts to increase the knowledge about the emergence of pathogenicity in M. perniciosa studding the evolution of genes potentially related to it, therefore increasing the knowledge about the witches' broom and helping in the search for a way to control the disease. To do that, it were studied the evolutionary patterns of several genes related with the necrosis process characteristic of witches' broom and genes candidate to have been obtained by horizontal gene transfer (HGT). These later were detected by a genome level screening. The results indicate that the evolution of plant pathogenicity in M. perniciosa involved both the acquisition of new genes and the use of genes already present in the saprotrophic ancestral in new functions. In particular, the search for horizontally transferred genes found two genes potentially involved in the disease which were not yet studied, suggesting that the evolutionary analysis at the genomic level is a relevant tool to the choice of genes candidate to laboratory analysis. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular