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Verticillium wilt, caused by Verticillium dahliae Kleb, is one of the most economically important diseases of woody hosts such as ash (Fraxinus spp.), sugar maple (Acer saccharum), and redbud (Cercis canadensis). The causal agent has a broad host range, including not only woody hosts but also important vegetable and field crops, and it is distributed worldwide. Diagnosis of V. dahliae in infected woody hosts is often based on the occurrence of vascular discoloration and time-consuming isolation. However, not all woody hosts exhibit vascular discoloration symptoms, and not all vascular discoloration symptoms are due to infection by V. dahliae. In this study, real-time PCR-based assays were evaluated and employed for rapid and accurate detection of V. dahliae in different woody hosts. DNA was extracted in large quantities from presumptively infected woody hosts by collecting drill-press shavings from sample tissue, bead-beating, and extracting using a CTAB method. Six published primer sets were evaluated against genomic DNA of V. dahliae as well as selected negative controls, and two sets (VertBt-F/VertBt-R and VDS1/VDS2) showed promise for further evaluation using DNA extracts from field samples. The VertBt primers amplified a species-specific 115-bp fragment of the expected size, while the VDS primers amplified the expected specific 540-bp fragment. However, the VertBt primer set exhibited higher sensitivity in detection of V. dahliae even in asymptomatic trees. The PCR-based methods developed here could be used as rapid tools for pathogen detecting and monitoring, thus informing plant pathogen management decisions.

Die bodenbürtigen, pflanzenpathogenen Pilze der Verticillium Familie sind über die ganze Welt verteilt. Bislang gibt es keine Fungiszide, die einen Befall der Wirtspflanzen verhindern können. Auf infizierten Feldern ist dem Pilz für viele Jahre ein Überleben im Boden in sogenannten Dauerformen (Mikrosklerotien, melanisierte Hyphen) möglich. Auch nach langer Zeit können diese auskeimen und der Pilz dann die Wirtspflanzen befallen, was ihn zu einem wirtschaftlichen Problem macht. Die Infektion der Wirtspflanzen erfolgt durch die Wurzeln; und nachdem der Pilz in die Xylemgefäße der Pflanze eingedrungen ist, wächst er innerhalb dieser vasculären Leitungsbahnen. Die infizierten Pflanzen zeigen Infektionssymptome wie frühzeitige Chlorose der Blätter, absterbendes Gewebe sowie verfärbte Gefäße in Stamm und Wurzel. Für die Landwirtschaft ist die Erforschung der Interaktionen zwischen Pflanzen und dem pathogenene Pliz von großer Bedeutung um mögliche Angriffspunkte zur Pilzbekämpfung zu finden. Diese Arbeit fokussiert sich auf zwei spezifische Gene in Verticillium dahliae, die für die Pathogenität des Pilzes eine Rolle spielen. Des Weiteren wurde die Gen­Regulation in Verticillium longisporum durch Analyse eines Transkriptoms untersucht. Die Studie hat zum Ziel die hohe Anpassung des Pilzes an die Bedingungen innerhalb des vaskulären Systems der Wirtspflanze zu zeigen, in dem dem saprophytischen Pilz nur eine limitierten Menge an Nährstoffe zugänglich ist. Das untersuchte V. dahliae Protein VdThi4 ist Teil der Thiamin Biosynthese (Vitamin B1). Dieses Mitochondriell lokalisierte Protein ist mit seinen weiteren Funtktionen in den DNA Reparaturmechanismus und die zelluläre Antwort auf oxidativen Stress (induziert durch ROS) eingebunden. Das Fehlen des Proteins führt im Pilz zum Verlust der pathogenen Eigenschaften auf der Wirtspflanze Solanum lycopersicum. Neben Proteinen wichtiger Stoffwechselwege spielen sekretierte Proteine eine große Rolle bei der Wirtsinfektion. Solche Proteine sind der Erste Kontakt zwischen Pathogen und Wirt und werden von beiden Seiten abgesondert. Infektionsversuche an S. lycopersicum zeigten, dass der Pilz das membrangebundene V. dahliae Protein VdPa14_2 für die Wirtspflanzeninfektion benötigt. Dieses Protein scheint die Resistenz gegen oxidativen Stress in der Zelle zu verringern in der Synthese schwarzen Melanins involviert zu sein. Für die Infektion von Wirtspflanzen und die Pathogenität benötigt V. dahliae viele verschiedene Proteine aus verschiedenen Stoffwechelwegen, wie die analysierten Proteine VdThi4 und VdPa14_2, die in der Zelle verschiedene Funktionen haben, aber beide für die Pathogenität des Pilzes benötigt werden. Um ein umfassenderes Bild der Interaktion zwischen Pilz und Pflanze zu bekommen, wurde die Genregulation in V. longisporum untersucht. Hierfür wurde ein Transkriptom erstellt. Es wurden sowohl die spezifisch- als auch die gleich-regulierten Transkripte während der in situ Kultivierung des Pilzes in Xylem­Saft aus Brassica napus, sowie der in vitro Kultivierung in simuliertem Xylem medium (SXM) untersucht. Beide Medien stellten sich während der Analyse als grundverschieden heraus. Das SXM stellt hingegen früherer Annahmen keine Simmulation der in vivo Konditionen innerhalb des vaskulären Systems einer Pflanze dar.

Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) are plant proteins believed to playa role in the defence against pathogenic fungi. In this study. it was hypothesized that apple PGIPI could be used to confer enhanced resistance against Verticillium-wilt. a major disease of potato caused by the fungus Verticillillm dahliae. Transgenic lines containing the apple pgip1 gene under control of the enhanced CaMV 35S (e35S) promoter had been generated previously. Stable integration of the transgene into the potato genome was shown by the polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot with a DIG¬labelled apple pgip1 fragment as probe. Polygalacturonase (PG)-inhibiting assays (the agarose diffusion assay and reducing sugar assays) were employed to investigate the inhibiting activity of apple PGIP I extracts, prepared from the transgenic potato lines. on the PGs secreted by V. dahliae grown on pectin medium. Inhibition was successful for all but one of the transgenic lines. Active PGIPI was expressed in the leaves of in vitro- and glasshouse grown plants, as well as in roots of in vitro-grown plants. Due to the success of the in vitro inhibition results. it was anticipated that the apple pgip1 transgene would protect the transgenic lines against Verticillium-wilt in a subsequent glasshouse trial. The transgenic lines and untransformed BP I potato control were planted in soil inoculated with V. dahliae microsclerotia and control soil. Assessments of the visual symptoms of yellowing and wilt were made on a scale of 1-5. Colonisation of stem sections was determined by plating onto potato dextrose agar plates. Disease index values were calculated from the symptom and colonisation data. Analysis of variance indicated six lines to be significantly different from the rest when grown in the inoculated soil, but five of them also showed significantly slower senescence symptoms when grown in the control soil. It is proposed that the physiological effect of an extended juvenile phase resulted in the apparent increased disease resistance. This could be caused by transformation or tissue culture¬-induced somaclonal variation of the potato plants. The hypothesis that transformation of the apple pgip1 gene into potato would confer enhanced resistance against Verticillium-wilt was not supported by the data that was obtained. Expression of antifungal genes by pathogen-inducible promoters is a valuable strategy in the development of disease resistant crops of importance. A construct containing the apple pgipl gene under control of the pathogen-inducible gst1 promoter from Arabidopsis thaliana (L.) Heynh was generated. Agrobacterium tumefaciens GV31OI(pMP90RK) was transfonned with the plant transformation vector pCAMBIA2300 containing the gst1 and e35S promoter-pgip1 inserts. A. thaliana was transformed using the floral-dip method, and putative transgenic progeny were selected by kanamycin selection of the seeds. PCR verified the insertion of the transgene into the genomes of T2 and T3 lines. Gene expression from the two promoters was compared by performing PGIP extractions and the agarose diffusion assay. The gst1 promoter was active even without induction by methyl-salicylate. Both constructs led to the expression of active apple PGIP1 against V. dahliae PG in the heterologous plant A. thaliana. / Dissertation (MSc (Plant Biotechnology))--University of Pretoria, 2006. / Plant Science / unrestricted

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The purpose of this investigation is to study the effects of methylxanthines, catecholamines, and cyclic nucleotides on melanin synthesisand conidiation using the technique of phase contrast microscopy. Verticillium wild type (T9) strain was grown in both sucrose nitrate liquid medium and polygalacturonic acid media (SNLM and PGAM). These media allowed rapid production of conidia and synchronous development of microsclerotia respectively. Even though caffeine has a greater effect on conidiation, both caffeine and theophylline promoted melanization. Dibutyl cyclic AMP to lesser extent inhibited conidiation, while cyclic AMP had little to no effect on conidiation. Dibutyl cyclic AMP inhibited melanin production. Cyclic AMP had a stimulatory effect on melanin production. Isoproterenol a stimulant of adenylate cyclase activity, inhibited conidiation the first two days, but had no apparent effect after day 3. Isoproterenol also induced melanin production in the flask. Propranolol, an antagonist of hormonally induced adenylate cyclase activity, did not repress conidiation when compared to the drug-free SNLM. Melanin was not formed in either SNLM and PGAM, suggesting that the effect of propranolol was opposite that of isoproterenol. Propranolol, a beta blocking agent, reversed the isoproterenol induced inhibition of conidiation. This reversal indicates that there is a receptor which isoproterenol attached itself to - the binding beta receptor site. The isoproterenol effect on conidiation and melanin synthesis indicates that, there might be cyclic AMP involvement in development, since this agent affects cyclic AMP level. Since melanin is known to be associated with microsclerotia, it is possible that cyclic AMP might be involved in this development. In this study, the effects of methylxanthines, catecholamines and cyclic nucleotides on melanin synthesis and conidiation was determined. There is every possibility that cyclic AMP might be involved in the regulation of conidiation process and melanin synthesis.

Die Infektion von Arabidopsis thaliana Col-0 Pflanzen mit dem Verticillium longisporum Isolat VL43 und dem Verticillium dahliae Isolat VdJR2 resultiert in klar zu unterscheidenden Krankheitssymptomen, wie die verfrühte Seneszenz (early senescence) bzw. die Welke (wilting). Um herauszustellen ob VL43- und VdJR2-ähnliche Infektionssymptome Spezies-spezifische Merkmale sind, wurde eine Verticillium Stammkollektion, bestehend aus 21 amphihaploiden V. longisporum und 46 haploiden V. dahliae Isolaten systematisch analysiert und kategorisiert in Bezug auf die Induktion von Krankheitssymptomen auf den A. thaliana Ökotyp Col-0. Die Analysen ließen die Klassifizierung von drei unterschiedlichen Interaktionsklassen zu: „early senescence”, „wilting” und „asymptomatic”. Für die detaillierte Charakterisierung der Interaktionsklassen „early senescence” und „wilting” wurden Verticillium Isolate gewählt, die auf robuste Weise diese Infektionssymptome induzieren. Diese wurden untereinander in Bezug auf ihre Fähigkeit innerhalb der Pflanze zu proliferieren und entwicklungsorientierte Veränderungen innerhalb der Blattvaskulatur der Pflanze zu induzieren verglichen. Die Analysen zeigten, dass Isolate der „wilting“ Interaktionsklasse eine erhöhte Lignifizierung der Xylemzellwände in Blättern auslösen. Im Gegensatz dazu induziert die Infektion mit Isolaten der „early senescence“ Interaktionsklasse die verfrühte Seneszenz der Pflanze, sowie eine entwicklungsorientierte Umprogrammierung der Blattvaskulatur. Interessanterweise stellen entwicklungsorientierte Veränderungen der Blattvaskulatur eine generelle Antwort von Wirtspflanzen auf diese Verticillium Interaktionsklasse dar, da dieses Symptom ebenso in Nicotiana benthamiana, eine Solanaceae Spezies, induziert wird. Somit wurde postuliert, dass Isolate der Interaktionsklasse „early senescence“ spezielle pilzliche Effektormoleküle besitzen, die diese Infektionssymptome auslösen. Um potentielle pilzliche Effektormoleküle zu identifizieren, die spezifisch für die „early senescence” Interaktionsklasse sind, wurden vergleichende Genomsequenzanalysen mit haploiden V. dahliae Isolaten der drei Interaktionsklassen durchgeführt. Die Daten deuteten auf Sequenzen hin, die in der „early senescence” Interaktionsklasse existieren, aber nicht in den Genomen von Isolaten der „wilting” und „asymptomatic” Interaktionsklassen vorkommen und somit möglicherweise Gene für pilzliche Effektoren beherbergen, die in der Symptomentwicklung der verfrühten Seneszenz eine Rolle spielen. Darüberhinaus wurden vergleichende in planta Transkriptomanalysen mit V. dahliae Isolaten durchgeführt, die Welke oder verfrühte Seneszenz auslösen. Hierbei wurden pilzliche Gene identifiziert, die im Vergleich zur „wilting“ Interaktionsklasse eine erhöhte Transkriptmenge in der Interaktionsklasse “early senescence” aufwiesen. Aus dieser Gruppe von Genen wurden Effektorkandidaten ausgewählt. Bemerkenswerterweise war unter den hochregulierten Effektormolekülen eine Ligninase, CEL, die möglicherweise Lignin hydrolysiert und somit einen Einfluss auf die Unterschiede der Lignifizierungsmenge von Xylemzellwänden hat. Die Gene zweier Kandidateneffektoren, CEL und CE1, wurden bezüglich ihrer Promotersequenzen zwischen den Isolaten der zwei Interaktionsklassen untersucht. Nennenswerterweise wurden keine eindeutigen Sequenzunterschiede in den Promoterregionen der drei Kandidatengene gefunden, die ihre differentielle Expression zwischen der „wilting“ und „early senescence“ Interaktionsklasse erklären würden. Somit wurde angenommen, dass die Expression dieser Gene epigenetisch kontrolliert wird.

Graduation date: 1998

Verticillium wilt of 'Willamette' hops (Humulus lupulus) was investigated to identifY the causal organism, to determine the incidence of the disease, and to explore the possibility of interactions with soil fertility and/or nematodes. In the first year of a three year study, sampling of yards followed a "searching for extremes approach". Selection of yards was based on a preliminary survey of all (35) hop growers in the Willamette Valley. Participating growers (10) were asked to identify one "good" and one "not-so-good" yard. Each of the 20 specified yards was subdivided into 4 plots; two representing a "good" and two representing a "not-so-good" area. In all 80 plots, data were collected to determine incidence of vascular colonization by Verticillium and stem necrosis in vines; soil and root parasitic nematode populations; concentrations of nitrate-N, ammonium-N, P, K, Ca, Mg, and pH in the soil surface, and nitrate-N, ammonium- N , and K in the subsoil; concentrations of total-P, K, and Zn in the leaves; and concentrations of nitrate-N, phosphate-P, and K in the petioles. The causal agents of the wilt were Verticillium dahliae in 13 yards and V. albo-atrum in one yard. Recovery of the pathogen within a yard ranged from 0 to 50% of sampled vines, while stem necrosis ranged from 0 to 68%. The frequency of infection was not significantly different among plots or yards, which suggests that the disease is present in all hop growing districts in Oregon. Soil nematode populations ranged from 0 to 3000 juveniles/100 g of dry soil. Heterodera humili (hop-cyst nematode) was the predominant parasitic nematode, while Pratylenchus (root-lesion nematode) and Paratylenchus (pin nematode) were recovered only occasionally. Densities of nematodes extracted from roots ranged from 0 to 2000 juveniles/g of moist root material and were primarily H. humili. A significant association between nematode populations and Verticillium incidence was not detected. Soil nutrient concentrations exhibited a high degree of variability among yards. The nitrate-N content, measured to a depth of 36" (90 cm) for individual hop yards, ranged between 65 (73) and 417 lb/A (468 kg/ha) with a mean value of 270 lb/A (302 kg/ha). Concentrations of ammonium-N were determined to be approximately one-fourth of the nitrate concentrations. Phosphorus and potassium concentrations ranged from 55 to 155 ppm and 118 to 799 ppm, respectively, in the surface soil. For the same depth, soil pH ranged from 5.15 to 6.78. Petiole concentrations of nitrate-N and potassium ranged from 0.16 to 1.3% and from 1.26 to 6.84%, respectively. While it is believed that the duration of the sampling period may have been responsible for the wide range in nitrate-N values, petiole potassium concentrations are thought to reflect the potassium content in the soil. The concentrations of K in petioles increased steadily with increasing soil test values up to 350 ppm K. Soil and tissue nutrient concentrations found within and among hop yards did not correlate significantly with the incidence of Verticillium wilt. However, petiole nitrate-N concentrations were significantly higher (p < 0.05) in plots infected with Verticillium (0.73%) as compared to noninfected plots (0.56%). / Graduation date: 1991

Verticillium longisporum ist ein bodenbürtiges vaskuläres Pflanzenpathogen, das im europäischen Raum eine ernsthafte Bedrohung des agronomisch wichtigen Raps, einer Quelle für Biokraftstoff und Speiseöl, darstellt. Infektionsanalysen mit V. longisporum zeigten in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana eine neue Funktion des Jasmonoyl-Isoleucin- (JA-Ile) Rezeptors COI1, die unabhängig von JA-Ile oder pilzlichen Analoga dieses Pflanzenhormons Suszeptibilität gegenüber dem Pathogen vermittelt. Pfropfungsexperimente führten zu der Erkenntniss, das COI1 in Wurzeln für die Ausprägung von Krankheitssymptomen im Spross benötigt wird (Ralhan et al., 2012). Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, welche Gene unter der Kontrolle der JA-Ile-unabhängigen COI1-Funktion stehen und inwieweit sich die Signaltransduktionskette von der bekannten, durch COI1 aktivierten, Signaltransduktion unterscheidet. RNA-Sequenz-Analysen von infizierten und nicht-infizierten Wurzeln des Wildtyps, der coi1-Mutante und der JA-Biosynthesemutante aos ergaben zunächst, dass unter den gewählten Infektionsbedingungen nur wenige Gene durch den Pilz beeinflusst werden. Beim Vergleich der Transkriptomdaten von coi1- und aos-Wurzeln fiel jedoch auf, dass eine Gruppe von 113 Genen in der coi1-Mutante konstitutiv stärker exprimiert wurde als in der JA-Biosynthesemutante. Im Gegensatz dazu gab es nur wenige Gene, die in der coi1-Mutante geringer exprimiert waren als in aos und deren Expressionsmuster sich in unabhängigen Proben als nicht reproduzierbar erwies. Als Markergene für die Gruppe von Genen, bei der COI1 unabhängig von JA-Ile, d.h. auch in der aos-Mutante, als negativer Regulator der Genexpression wirkt, wurden aufgrund robuster Effekte der hochregulierten Transkriptmenge in der coi1-Mutante die Gene Phosphoglyceratmutase, Germin 2 und Cysteine-rich Receptor-like Kinase 15 (CRK15) gewählt. Durch Mutationen der Ligandenbindestelle von COI1 für JA-Ile wurde gezeigt, dass ein mutiertes COI1-Protein, das in der Pflanze JA-Ile-abhängige Funktionen wie Fertilität, JA-sensitives Wurzelwachstum und JA-induzierbare JAZ10-Expression nicht mehr ausführen konnte, ähnlich wie das WT-COI1 die Expression der Markergene weiterhin reprimieren konnte. Die Suszeptibilität-vermittelnde JA-Ile-unabhängige Funktion von COI1 gegenüber V. longisporum konnte mit diesen Konstrukten jedoch nicht eindeutig gezeigt werden, da die entsprechenden Leervektorkontrollen unerwarteterweise stark ausgeprägte Krankheitssymptome nach Infektion mit V. longisporum aufwiesen. Weitere bekannte Signalkomponenten der JA-Signaltransduktion wurden bezüglich ihrer Rolle in der JA-Ile-unabhängigen Funktion des COI1-Proteins analysiert. Dabei konnte über die Beteiligung der JAZ-Proteine keine Aussage getroffen werden, da eine beschriebene dominant-negative Wirkung des JAZ1∆3-Proteins in dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Da-hingegen konnte gezeigt werden, dass Komponenten wie NINJA und MYC2,3,4 keinen Einfluss auf die reprimierende Funktion von COI1 bezüglich der Phosphoglyceratmutase haben. Demnach konnte in dieser Arbeit durch Expressionsanalysen der Phosphoglyceratmutase, einem Schlüsselenzym der Glykolyse, demonstriert werden, dass sich die neue Funktion von COI1 stark von der klassischen und bekannten Funktion als JA-Ile-Rezeptor und Aktivator downstream agierender Prozesse der JA-Signaltransduktion unterscheidet. Es wird postuliert, dass es sich dabei um eine anzestrale Funktion des Proteins handelt, die mit der Entwicklung der JA-Synthese in Pflanzen aufgrund hoher Affinität des Rezeptors zu seinem Liganden in den Hintergrund gestellt wurde.