En 1989, près de quinze ans après la mise en évidence d’une forme d’hépatite virale « non A-non B », le virus de l’hépatite C (VHC) a pu être isolé et son génome séquencé. En presque vingt ans, de nombreuses avancées techniques majeures ont permis de mieux comprendre le cycle de réplication de ce virus. Cependant, l’infection par ce virus représente actuellement la première indication de transplantation hépatique dans les pays industrialisés. On estime que 3% de la population mondiale est constituée de porteurs chroniques du VHC ; faisant de cette maladie un problème majeur de santé publique. De plus, même si des thérapies anti-virales sont disponibles pour enrayer la réplication du VHC, ces traitements ne sont vraiment efficaces que pour la moitié des patients traités. Malgré une recherche intensive, il n’existe toujours pas de vaccin préventif contre le VHC ayant fait la preuve définitive de son efficacité. La plupart des candidats vaccins en développement reposent sur l’utilisation de formes tronquées des protéines d’enveloppe du virus, constituant des immunogènes probablement moins pertinents que les formes complètes retrouvées sur l’enveloppe virale. L’objectif de ce travail de thèse a donc été de développer et de produire des particules dites sous-virales d’enveloppe constituées uniquement de l’enveloppe lipoprotéique du virus comme candidat vaccin potentiel contre le VHC, en exploitant les stratégies utilisées pour la production du vaccin contre le virus de l’hépatite B (VHB). En effet, le vaccin contre l’hépatite B repose sur la capacité de la petite protéine d’enveloppe S du VHB à générer spontanément des particules d’enveloppe vides sécrétées et non infectieuses. L’utilisation de ces particules comme vaccin a fait ses preuves depuis maintenant plus de vingt ans. Au cours de ce travail, nous avons dans un premier temps développé un modèle d’étude de la morphogenèse de ces particules sous-virales du VHB, basé sur la production de la protéine S du virus à l’aide d’un vecteur dérivé du génome du virus de la Forêt de Semliki (SFV). Ce modèle s’est avéré déterminant pour apporter des informations originales sur la morphogenèse et le trafic intracellulaire des particules sous-virales d’enveloppe du VHB. Nous avons pu montré que le bourgeonnement de ces particules au sein du réticulum endoplasmique (RE) se fait initialement sous forme de structures filamenteuses ; contrairement à ce qui était présumé dans le modèle couramment admis. Empaquetés et transportés vers un compartiment intermédiaire entre le RE et l’appareil de Golgi (ERGIC), ces filaments sont ensuite convertis en particules sphériques qui seront sécrétées. Dans un second temps, ce modèle nous a permis d’étudier les capacités d’assemblage en particules sous-virales d’enveloppe de différentes protéines chimères d’enveloppe VHC-VHB. Nous avons démontré que ces protéines de fusion, contenant la totalité de la protéine d’enveloppe E1 ou E2 du VHC, étaient capables de s’assembler puis d’être sécrétées sous forme particulaire lorsqu’elles étaient co-produites avec la protéine S sauvage du VHB. De telles particules, morphologiquement similaires à celles du vaccin contre l’hépatite B, pourraient donc constituer la base d’un vaccin prototype. Le système d’expression transitoire utilisé pour ces expériences ne permettant pas de produire ces particules en grande quantité, des clones cellulaires de la lignée CHO produisant de manière stable les particules d’enveloppe chimèriques ont été développés. Si comme nous l’espérons ce vaccin prototype donnait des résultats encourageants, sa production pourrait s’appuyer à terme sur les procédures industrielles existantes pour la production du vaccin contre le VHB, dans le but d’obtenir à grande échelle un vaccin protégeant à la fois contre l’hépatite B et l’hépatite C. / N/a

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:31:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8085_1.pdf: 956174 bytes, checksum: 81cf93e65ab504a80ac0e917913226bf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / O anticorpo contra o antígeno do centro (ou do core), o anti-HBc, do vírus da hepatite B (VHB) é considerado o mais sensível e duradouro marcador sérico da infecção pelo VHB. Algumas vezes o anti-HBc é encontrado na ausência de outros marcadores como por exemplo o anti-HBs ou o HBsAg. O significado clínico do encontro isolado do anti-HBc permanece incerto. Existem algumas explicações para este achado: primeiro, o encontro do anti-HBc pode ser um resultado apenas falso-positivo. Segundo, o indivíduo pode ter ficado imune após contato com o VHB, porém não possui anti-HBs detectável. Terceiro, estes indivíduos com anti-HBc isolado podem ser portadores crônicos do VHB com ausência ou não detecção de HBsAg. Além do que o encontro isolado do anti-HBc pode ser pelo fato do indivíduo se encontrar na fase de janela imunológica quando o HBsAg desapareceu mas o anti-HBs ainda não está detectável. Uma última hipótese menos provável é que a presença do anti-HBc possa ter sido devida a uma passagem passiva deste anticorpo. Exceto a situação de janela imunológica todas as outras explicações hipotéticas teriam teoricamente esclarecimento com o uso de técnicas de biologia molecular. Porém, como é cara e laboriosa não é utilizada de rotina. Haja vista a importância tanto do ponto de vista do indivíduo como para os serviços de saúde de elucidar se o anti-HBc isolado é falso-positividade do teste ou contato prévio com o VHB alguns serviços de saúde têm utilizado a vacinação contra o VHB nestes indivíduos para distinguir entre estas duas situações. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta contra vacina recombinante para VHB em doadores sanguíneos portadores de anti-HBc e negativos para HBsAg e anti-HBs. O modelo do estudo foi do tipo quasi-experimental sem grupo controle, não randomizado. Vinte e quatro doadores entre 22 e 76 anos receberam três doses de 20 mcg de Engerix®-B nos meses 0, 1 e 6. Amostras sanguíneas foram coletadas 30 dias após primeira e terceira dose de vacina e testadas para anti-HBs pela técnica imunoenzimática por fluorescência. Os resultados mostraram que após a primeira e terceira dose de vacina a taxa de soroproteção (anti-HBs >10 miliUI/ml) foi de 61,9% e 87,5%, respectivamente. A taxa de resposta tipo anamnéstica com produção rápida de anticorpos foi de 38% e tipo primária ou lenta foi de 47,6%. A taxa de não respondedores ao final do esquema vacinal foi de 12,5%. Doadores estes potencialmente suspeitos de serem portadores inativos de VHB e que foram submetidos à pesquisa de DNA do VHB pela PCR sendo todos negativos para este teste. O uso da vacina recombinante contra VHB ajudou a elucidar a situação imunológica da maioria dos indivíduos do presente estudo. Portanto, a estratégia da vacinação parece ser prática e pouco laboriosa para esclarecimento diagnóstico neste grupo de doadores

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8721_1.pdf: 550423 bytes, checksum: cde954cd2259423baa47ecb2e039b3a1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Os vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC) são os principais agentes envolvidos na origem e desenvolvimento do Carcinoma Hepatocelular (CHC), variando de relevância de acordo com áreas geográficas. Alguns casos não apresentam etiologia definida, sendo designados como de origem criptogênica. A partir de relatos de casos novos, possíveis agentes são freqüentemente aventados na literatura internacional, principalmente os de natureza infecciosa. Dentre eles encontra-se o Vírus da Hepatite G (VHG). O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência do VHG em pacientes com carcinoma hepatocelular em Pernambuco. O desenho do estudo foi o descritivo do tipo série de casos, incluindo-se 32 pacientes portadores de CHC atendidos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco entre junho de 1996 e julho de 1999, que preencheram os critérios de inclusão e dispunham de amostras sanguíneas armazenadas em soroteca, sendo realizando detecção do ARN do VHG pelo método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os dados foram coletados em ficha previamente elaborada, contendo dados clínicos e de exames complementares. A idade média dos pacientes foi 58 anos, sendo 63% do sexo masculino. Vinte e oito dos 32 pacientes 88% - apresentaram cirrose hepática, com a seguinte distribuição na classificação de Child-Pugh: A = 8, B = 14, C = 6. A pesquisa dos marcadores e/ou genomas virais foi positiva em 26 pacientes (81%), sendo o VHG presente em 9 casos (28%), entretanto em apenas um dos casos de forma isolada. Não houve diferenças nas características clínico epidemiológicas e laboratoriais entre os pacientes positivos ou negativos para o VHG. Em conclusão, este estudo clínico-epidemiológico revelou que, na casuística avaliada, a maioria dos casos de CHC esteve relacionada aos vírus das hepatites B, C ou G. Isoladamente, entretanto, o genoma do vírus da hepatite G foi detectado em apenas um paciente

Le virus de l'hépatite B (VHB) est un virus enveloppé composé d'un ADN partiellement double brin (ADNrc) contenu dans une capside icosahédrique. Le VHB est responsable d'infections aiguës et chroniques. VHB est non cytopathique mais l’inflammation chronique entraîne une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Le VHB se réplique via un intermédiaire à ARN. La transcription nécessite que l'ADNrc soit convertit en un ADN circulaire clos de manière covalente (ADNccc). Cet ADNccc sert de matrice pour la transcription de l'ARN prégénomique (ARNpg), qui est spécifiquement encapsidé grâce aux interactions entre la polymérase virale, l'ARNpg et la protéine core (Cp) qui forme la capside. La polymérase rétrotranscrit l'ARNpg en ADN monocaténaire puis en ADNrc, conduisant à des matrices de capside matures (MatC). Cp avec 185 aa contient un domaine N-terminal structuré, et un domaine C-terminal (CTD) flexible. Le CTD comprend deux signaux de localisation nucléaire (NLS) et un domaine de liaison avec l’importin β (IBB). Le CTD est orienté vers l'intérieur de la capside de part son interaction avec les acides nucléiques simples brins tandis qu'il est exposé vers l'extérieur dans les capsides vides (EmpC) et les MatC. De plus Cp étant surexprimée, cela conduit à l'assemblage des EmpC. Le VHB doit délivrer son génome dans le noyau des cellules infectées pour sa réplication. Le transport nucléaire est médié par la capside qui interagit avec les récepteurs d'import. L’équipe a démontré préalablement que ce transport a besoin des récepteurs Importin α (Imp.α) et Importin β (Imp.β) en induisant le transport des capsides au panier nucléaire où elle est stoppée par l'interaction avec la nucléoporine 153 (Nup153). Nous avons démontré que l’Imp.α, mais pas l'Imp.β, se lie aux MatC suggérant que seule la partie du CTD qui contient les NLS est exposée à l’extérieur des MatC. En comparaison, nous avons analysé les EmpC en collaboration avec Adam Zlotnick (Université d'Indiana, États-Unis) et démontré que les EmpC sont capables de lier directement l'Imp.β. Cette interaction qui est plus forte que l’interaction avec l'Imp.α s'effectue via la reconnaissance du domaine IBB du CTD, ce qui implique une exposition totale du CTD à l'extérieur de la capside. Nous avons aussi montré que la liaison avec l'Imp.β à des concentrations très élevées fournit des forces de déstabilisation menant au désassemblage des EmpC. La libération du génome dans le panier nucléaire implique que l’interaction entre les MatC et Nup153 participe au désassemblage de la capside. Afin de valider cette hypothèse, nous avons exposé des MatC dont le génome est radiomarqué avec un fragment de Nup153 contenant le domaine clé, montré pour interagir avec la capside, en présence de nucléases. Nous avons mis en évidence qu'en présence de ce fragment, les MatC restent stables. Cela suggère la nécessité de facteurs cellulaires additionnels pour le désassemblage des MatC. Cette conclusion est conforme avec nos résultats sur noyaux isolés, dans lesquels nous avons observé une localisation nucléaire des capsides laissant supposer que les facteurs cellulaires nécessaires au désassemblage des MatC sont nucléaires. Afin d'étudier plus en détail l'étape de désassemblage et la libération du génome viral, nous avons mis au point un système permettant de suivre en temps réel le devenir du génome viral. / The Hepatitis B Virus (HBV) is an enveloped virus containing a partially double stranded DNA genome (rcDNA). HBV causes acute and chronic infections. HBV is not cytotoxic but chronic inflammation leads to liver fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV replicates via an RNA intermediate, which is transcribed from a covalently closed circular form of the viral DNA (cccDNA). This pregenomic RNA is specifically encapsidated into the capsid by interaction with the viral polymerase, which also interacts with the core protein (Cp), forming the capsid. The polymerase retrotranscribes the pregenomic RNA into single stranded DNA and subsequently partially double stranded DNA resulting in mature capsids (MatC). Cp is an 185 aa long polypeptide comprising a N-terminal assembly domain, and a flexible C-terminal domain (CTD). The CTD includes two overlapping nuclear localization signals (NLS) of eight aa and an Importin ß Binding Domain (IBB) of 34 aa. The CTD is fixed in the interior of the capsid by interacting with single stranded nucleic acids but translocates to the exterior in MatC and empty capsids (EmpC). Cp is over expressed leading to assembly of EmpC. The virus has to deliver its genome into the nucleus of infected cells for replication. Nuclear transport is mediated by the capsid that interacts with nuclear import receptors. The group has recently shown that MatC need either both, importin  (Imp.) and importin ß (Imp.ß), or Imp.ß alone for transport of the capsids into the nuclear basket. In this structure where genome liberation likely occurs, the transport of the capsid is arrested by interaction between the capsid and the nucleoporin Nup153. In the thesis we demonstrate that MatC binds to Imp.α but not Imp.ß, suggesting that only the part of the CTD, which contains the NLSs is exposed on capsids’ surface. In collaboration with the Adam Zlotnick (Indiana University, U.S.A.) we showed that EmpC, in contrast, bind Imp.β directly without Imp.α acting as an adaptor. This interaction, which is stronger than the one of Imp. occurs needs IBB exposure, meaning that the entire CTD becomes externalized. Furthermore, exposure to very high Imp.ß concentration led to EmpC destabilization. The genome release within the nuclear basket implies that Nup153 is involved in genome liberation from MatC. To verify this hypothesis we used MatC with a radioactively labeled genome, which were exposed to the capsid binding-Nup153 fragment. Investigating the accessibility of the genome to nucleases we found that the Nup153 fragment had no impact on capsids stability, suggesting the need of cellular factors driving disassembly. This conclusion is in agreement with our observation that MatC added to isolated nuclei resulted in nuclear capsid entry, which requires disassembly. To further study the disassembly step and the consequent release of the viral genome, we developed a system to directly visualize the viral genome allowing investigations of genome uncoating in real time. The system is based on the cooperative binding of a fluorescent fusion protein between the bacterial protein OR with GFP to a double stranded DNA sequence called Anch. Using this model we showed that infection of OR-GFP-expressing hepatoma cells with HBV containing a modified Anch genome allowed monitoring genome release into the nucleus. In future, this system may help identifying factors involved in genome release and repair and to decipher their molecular interactions.

L’hépatite B est une maladie infectieuse grave et extrêmement contagieuse. Malgré l’existence d’un vaccin efficace plus de 240 millions de personnes souffrent d’une infection hépatique chronique et plus de 780 000 personnes meurent chaque année des conséquences aiguës ou chroniques de l’hépatite B. Les traitements actuels qui consistent en l’utilisation d’interféron et/ou d’inhibiteurs de la réplication virale sont encore insuffisants. De nouvelles thérapeutiques ciblant l’entrée virale sont en développement, notamment le Myrcludex B qui inhibe l’infection en empêchant l’entrée virale. Cependant, les mécanismes d’entrée du VHB dans l’hépatocyte sont encore mal connus. Récemment, l’identification du NTCP comme récepteur spécifique du VHB a permis de mieux comprendre le mécanisme d’attachement de ce virus. Ce récepteur constitue une nouvelle cible pour des antiviraux. C’est aussi un transporteur de sels biliaires fortement régulé par les cytokines pro-inflammatoires. Les objectifs de ce travail étaient : (i) d’étudier la fusion du VHB, étape cruciale de l’entrée d’un virus enveloppé, en établissant un modèle artificiel de fusion entre des particules virales purifiées et des liposomes, et (ii) d’étudier l’effet de l’interleukine 6 sur l’entrée virale. Nous n’avons pas pu mettre en évidence de fusion entre les particules virales et des liposomes suggérant l’incapacité de ce virus à fusionner avec une bicouche lipidique néanmoins il reste possible que des conditions particulières liées aux spécificités du VHB soient requises. Nos résultats ont également montré que l’interleukine 6 inhibait l’entrée virale en diminuant l’expression de NTCP. / Hepatitis B is a severe and extremely contagious infectious disease. Despite an effective vaccine more than 240 million people are suffering from chronic infection and over 780 000 persons die each year from the consequences of acute and chronic hepatitis B. Current treatments consisting in the use of interferon and/or viral replication inhibitors are insufficient. New therapeutics targeting viral entry are in progress, such as Myrcludex B that has been shown to inhibit HBV infection by preventing HBV entry. However, the mechanism of HBV entry into hepatocytes is still poorly understood. Recently, the identification of NTCP as a specific HBV receptor allowed us to better understand the attachment of this virus. This receptor is now a target for antiviral molecules. It is also a carrier for bile salts known to be strongly regulated by pro inflammatory cytokines. The aims of our thesis were: (i) to study HBV entry by establishing an artificial model of fusion between purified viral particles and liposomes, and (ii) to study the interleukin 6 effect on viral entry. Our results with fusion assays suggest an absence of fusion in the entry process of this virus. However, fusion could require peculiar conditions related to HBV specificities. Our results also demonstrated that interleukin 6 inhibits virus entry by down-regulating NTCP expression.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucinete Okamura Kimura.pdf: 3604811 bytes, checksum: 944fcd9a6fb1e06fc9a8b1ff83801f92 (MD5) Previous issue date: 2011-02-03 / Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the most serious public health problems in the world. At least two billion people are infected, with over 350 million showing serological markers of active infection, despite prevention by vaccination. In Brazil, the HBV endemicity is heterogeneous, with the most prevalent disease in the north region. Among the indigenous population, epidemiological serum studies have reported high rates of hepatitis B prevalence in the Brazilian component of the Amazon rainforest. Studies have shown that in some cases the serological markers are not enough to detect viral activity, and in these situations, molecular tests are more sensitive and specific. The proposal of this study was to determine the prevalence of DNA (deoxyribonucleic acid) of hepatitis B virus in indigenous ethnic groups (Kanamary, Matis, Mayoruna, Marubo, Kulina and Korubo) in habitants of the rivers Curuçá and Itaquaí at the Javari Valley, Amazon, Brazil. This was a descriptive, cross-sectional study, such as used in case detection. One hundred and eighty (180) samples were analyzed from the indigenous communities of São Sebastião, Volta Grande, Pedro Lopes, Massapê, Remancinho and Bananeira. The samples were subjected to polymerase chain reaction (PCR) and semi-nested PCR to Hepatitis B virus, S gene. The prevalence for HBV-DNA of S gene was 51.1% (92/180). Among the PCR positive samples for HBV-DNA, 18/49 (36.7%) were from Marubo, 68/125 (54.4%) from Kanamary and 6/6 (100%) from other ethnicities. With regards to socio-demographic data, no significant difference was found (p=0.889) in relation to gender (statistical analysis at 5%). However, when analyzing age it was observed that the natives had lower median age (p<0.001) of 23 years old, suggesting that sexual activity was the main form of HBV transmission. There was no statistical difference found in relation to sources of infection and the presence of HBV DNA, as well as clinical aspects, with the exception of fever (p<0.001). The high prevalence of HBV-DNA of 75% (15/20) in pregnant women (p=0,009) demonstrates association with vertical transmission. The results confirm the high prevalence of HBV DNA in the Javari Valley, making it important to devise strategies for control and a more effective prevention in combating the spread of HBV / A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um dos mais sérios problemas de Saúde Pública do mundo. Estima-se que dois bilhões de pessoas estejam infectadas, com mais de 350 milhões apresentando marcadores sorológicos de infecção ativa, apesar da prevenção pela vacinação. No Brasil, a endemicidade do VHB é heterogênea, sendo a doença mais prevalente na região norte do país. Entre a população indígena, estudos soro epidemiológicos relatam altas taxas de prevalência de hepatite B na Amazônia brasileira. Pesquisas têm demonstrado que, em alguns casos, os marcadores sorológicos não são suficientes para detectar uma atividade viral e, nessas situações, os testes moleculares se mostram mais sensíveis e específicos. O presente estudo se propôs determinar a prevalência do DNA (ácido desoxirribonucléico) do vírus da hepatite B em povos de etnias indígenas habitantes dos rios Curuçá e Itaquaí no Vale do Javari, Amazonas, Brasil, pertencentes às etnias Kanamary, Matis, Mayoruna, Marubo, Kulina e Korubo. Tratou-se de um estudo descritivo, transversal, do tipo detecção de caso. Foram analisadas 180 amostras pertencentes às comunidades indígenas de São Sebastião, Volta Grande, Pedro Lopes, Massapê, Remancinho e Bananeira. As amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) e semi-nested para vírus da hepatite B, gene S. A prevalência encontrada para o DNA-VHB gene S foi de 51,1% (92/180). Entre as amostras positivas para DNA-VHB PCR, 18/49 (36,7%) pertenciam à etnia Marubo, 68/125 (54,4%) à Kanamary e 6/6 (100%) a outras etnias. Quanto aos dados sóciodemográficos dos casos positivos para DNA-VHB PCR, pôde-se verificar que não houve diferença significante ao nível de 5% em relação ao gênero (p= 0,889). No entanto, quando se analisou a idade foi observado que os indígenas com PCR positiva para DNA-VHB apresentavam menores mediana de idade (p<0,001) de 23 anos, sugerindo ser a atividade sexual uma das principais formas de transmissão do VHB. Não foi constatada nenhuma diferença estatística em relação às fontes de contágio e à presença do DNA-VHB, como também aos aspectos clínicos, com exceção da febre (p<0,001). A alta prevalência do DNA-VHB de 75% (15/20) em gestantes (p=0,009) demonstra associação com a transmissão vertical. Os resultados comprovam a alta prevalência do DNA-VHB no Vale do Javari, tornando-se importante traçar estratégias de controle e prevenção mais eficazes no combate à disseminação do VHB

Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est une tumeur de mauvais pronostic caractérisée, comme la plupart de cancers, par l'association paradoxale de télomères courts et d'une importante activité télomérase. Cette attrition télomérique joue un rôle central dans l'instabilité chromosomique à l'origine de la promotion et de l'évolution tumorale. Les premières causes d'HCC correspondent aux infections chroniques par les virus hépatotropes : virus de l'hépatite B (VHB) et virus de l'hépatite C (VHC). Dans une première étape nous avons disséqué les dérégulations télomériques dans les HCC et les cirrhoses liées au VHB, VHC ou encore à l'alcool. Nous avons observé que ces dérégulations sont acquises tôt, au stade prétumoral, et persistent au stade tumoral. Ces dérégulations sont spécifiques d'un carcinogène donné. Aux stades tardifs et tumoraux de l'infection par le VHB, les cellules hépatiques expriment fréquemment une protéine tronquée en partie C-terminale d'HBx ainsi que des formes réarrangées du gène PreS/S telle que PreS2. Dans une seconde étape nous avons trouvé qu'à l'opposé de la forme sauvage, HBx tronquée réprime hTERT, diminue l'activité télomérase, raccourcit les télomères, augmente la proportion de ponts anaphasiques et déclenche la sénescence de cellules primaires. Sachant qu'au stade tumoral les cellules transformées ré-expriment hTERT nous avons testé l'effet d'une coexpression de PreS2 et d'HBx tronquée et avons pu montrer que PreS2 contrecarrait l'effet répresseur d'HBx sur hTERT. Néanmoins de façon étonnante, PreS2 ne parvenait pas à rallonger les télomères en présence d'HBx tronquée. Les facteurs protégeant les télomères coopèrent avec la télomérase pour l'élongation et plusieurs de ces protéines sont par ailleurs impliquées dans la réparation des dommages à l'ADN. Nous avons trouvé qu'HBx tronquée modifiait spécifiquement l'expression de la plupart des protéines du télosome selon un patron connu pour inhiber l'effet de la télomérase. Nous avons montré que des dommages à l'ADN télomérique liés à l'incubation de cellules primaires avec la néocarcinostatine inhibaient l'élongation des télomères par hTERT. Ayant trouvé que PreS2 et HBx tronquée induisaient des dommages à l'ADN, nous proposons que cet effet explique l'impossibilité pour PreS2 d'allonger les télomères de cellules exprimant HBx tronquée / Among the numerous genetic defects that underly with hepatocarcinogenesis, telomere abnormalities seem to play a role both in tumor promotion and maintenance. Telomeres, the chromosome extremities, are protected by specific proteins, the Shelterin complex and by additional factors. Besides telomerase dysregulation, changes in the expression of these telomere factors have been observed in cancers. Herewe first tested the hypothesis that such dysregulations might occur in HCC with patterns depending onthe cause of HCC. For HBV-, HCV- and alcool-dependant HCC we found that telomeric dysregulations appear to be carcinogen-specific and occur early during the course of the disease and are persistent in the tumor. At the late stage of HBV-dependent disease and corresponding tumors, hepatocytes produce 3’ deleted mutants of HBx (3’DM HBx) but also a rearranged form of the PreS/S gene: PreS2. We then found that, unlike WT HBx, 3’ DM HBx repress hTERT transcription, decrease telomerase activity, shorten telomere length, increase anaphase bridges and trigger senescence in transfected primary cells. It’s well known that hTERT it re-expressed in tumors, so we tested PreS2 and 3’DM HBx transfection. We show that PreS2 counteracts 3’DM HBx effect on hTERT transcription and telomerase activity. However surprisingly PreS2 wasn’t able to elongate telomeres in 3’DM HBx expressing cells. Telomeric factors interact with telomerase allowing telomere elongation. Moreover many of these factors are implicated in DNA damage repair systems. We found that all Shelterin’s and some other telomeric factors’s expression in dyregulated in 3’DM HBx expressing cells. Moreover we show that neocarcinostatin dependent DNA damage in MRC5 primary cell prevent hTERT-based telomere elongation. Also finding that PreS2 and 3’DM induce DNA damage, we suggest that 3’DM HBx prevents PreS2 and hTERT- based telomere elongation

El objetivo del presente estudio fue conocer la prevalencia del Virus Herpes Bovino 1 (VHB-1), agente causal de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (RIB) en bovinos criollos de crianza extensiva de los distritos de Coracora, Chumpi, Puyusca y Pullo de la provincia de Parinacochas, Ayacucho. Con esta finalidad se consideraron 469 muestras de sueros bovinos procedentes de 25 hatos para la detección de anticuerpos neutralizantes mediante la prueba de neutralización viral. El 67.59 ± 4.24% (317/469) de las muestras presentaron anticuerpos neutralizantes con títulos entre 1:2 a> a 1:256. El 100% de los hatos muestreados tuvieron animales seroreactores. La prevalencia del virus fue similar en los animales de los 4 distritos estudiados. Este estudio reporta la presencia del VHB-1 en bovinos criollos de la provincia de Parinacochas, con una prevalencia superior a lo descrito en bovinos de las principales cuencas lecheras del país. / The seroprevalence of Bovine Herpes Virus-1, the causative agent of Infectious Bovine Rinotracheitis (IBR), in criollo bovines from districts of Coracora, Chumpi, Puyusca and Pullo of the Parinacochas Province, Ayacucho was carried out. Four hundred sixty nine serum samples from twenty five herds were tested by virus neutralisation test to detect neutralizing antibodies. The 67.59 ± 4.24% (317/469) of the samples had antibodies against BHV-1. The seroprevalence of the virus was similar in the animals from the 4 district studied. The antibodies titers ranged from 1:2 to> 1:256. All the sampled herds had seroreactive animals. This study report the presence of the BHV-1 in criollos bovines from Parinacochas Province, with a prevalence superior to described in dairy herds of the country.

Reproduction de : Thèse d'exercice : MEDECINE : Nancy 1 : 2000. / 2000NAN11107. Titre provenant de l'écran-titre.

La protéine HBx du virus de l'hépatite B (VHB) potentialise la survenue du carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, les mécanismes par lesquels, HBx favorise l'instabilité génétique lors de la prolifération hépatique restent flous. La polyploïdisation hépatocytaire participe à la diversité génétique dans le foie. La modulation de la polyploïdie par l'HBx contribuerait-elle au développement de la maladie hépatique ? Ainsi, la polyploïdisation au cours du développement et de la maladie hépatique induite par le tétrachlorure de carbone ou le diéthylnitrosamine, a été évaluée dans les souris transgéniques FL-HBx (forme complète). Au cours du développement postnatal et dans la maladie hépatique, FL-HBx inhibe la binucléation hépatique au profit de noyaux polyploïdes (? 4n) par la dérégulation des transitions G1/S et G2/M, et l'accumulation d'ADN altérés. Une polyploïdisation similaire a été observé dans des souris avec un foie humanisé et infecté par le VHB. Dans les souris FL-HBx, l'initiation du CHC est associée à l'inactivation de ChK1, l'inhibition de Mre11, Rad51 et de l'apoptose, et à la surexpression d'IL-6 tandis que dans la fibrose, l'augmentation d'?-sma, PdgfR-?, TGF-?, TNF-? et la perte de l'expression de la glutamine synthétase ont été observées. De plus, les hépatocytes FL-HBx traitées présentent une prolifération anormale avec une forte expression de Ly6D, GpC3 et AFP. En conclusion, nos résultats montrent que par la surexpression de PLK1 via p38/ERK, FL-HBx induit une polyploïdisation pathologique du foie conduisant à la propagation d'ADN altérés et à l'apparition de marqueurs tumoraux au cours de la fibrose hépatique et de l'initiation du CHC. / Hepatitis B virus X protein (HBx) is involved in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). However, how HBx promotes genetic instability or DNA damage during liver proliferation remains unclear. For that, we used mice transgenic for the full-length HBx (FL-HBx) to investigated the impact of HBx expression on polyploidization during normal liver proliferation and in liver diseases (fibrosis : carbon tetrachloride and HCC : diethyl nitrosamine, treatments). During postnatal liver development as well as in liver diseases, FL-HBx inhibits liver binucleation and triggers early production of polyploid nuclei (≥ 4n). These features were associated with aberrant G1/S and G2/M transitions and the propagation of DNA damage. Furthermore, hepatitis B virus infection, in liver humanized mouse model, shows similar deregulation of hepatocytes polyploidization. In FL-HBx animals, HCC initiation was associated with impairment of ChK1 activation and Mre11 and Rad51 expression (DNA repair proteins), inhibited apoptosis and upregulated IL-6 transcription while in fibrosis, increased expression of α-sma, PdgfR-β, TGF-β, TNF-α as well as a defect in glutamine synthetase expression were observed. In addition, treated FL-HBx animals displayed marked alterations to the cell cycle associated with stronger expression of HCC progenitor cell markers (Ly6D, GpC3, AFP). Finally, we showed that FL-HBx protein induces pathological polyploidization of hepatocytes by upregulating PLK1 through p38/ERK Mapks pathways. That promotes a loss of genomic integrity and an increase of hepatocytes expressing tumor progenitor cell markers during liver fibrosis and HCC initiation.