L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème de santé publique majeur avec plus de 257 millions de porteurs chroniques dans le monde ayant un risque important de développer une cirrhose et/ou un hépatocarcinome. L'histoire naturelle de l'infection est très différente selon l'âge auquel l'infection est contractée. Alors que chez l'adulte l'infection est spontanément résolutive dans la majorité des cas, la contamination materno-infantile ou en bas âge aboutit le plus souvent à une infection chronique. Le cccDNA est la forme de persistance du génome viral dans les hépatocytes infectés et la base de transcription de tous les ARN viraux. La protéine virale HBx joue un rôle crucial dans le recrutement des facteurs épigénétiques sur le cccDNA et favorise son activité transcriptionnelle. Les traitements actuels à base d'interféron et d'analogues nucléos(t)idiques ne permettent pas l'éradication du cccDNA et leur interruption est presque toujours suivie d'une réactivation de la réplication du virus. De nouvelles molécules thérapeutiques ciblant le cccDNA sont donc nécessaires pour espérer obtenir une cure fonctionnelle chez les patients chroniquement infectés. Il existe des liens étroits entre l'infection par le VHB et le métabolisme des acides biliaires (AB). Ainsi, notre équipe a précédemment montré que le récepteur nucléaire des acides biliaires, le farnesoid X receptor alpha (FXRalpha) se fixe sur deux éléments de réponse présents dans la région Enhancer II - promoteur de Core du génome viral et module son activité transcriptionnelle. De plus, le VHB et les AB entrent en compétition pour le même récepteur d'entrée hépatocytaire NTCP, modifiant la concentration cellulaire des AB avec des conséquences sur la fonction et l'expression de FXRalpha. Enfin, HBx interagit avec FXRalphaet modifie son activité. Au cours de cette thèse nous avons dans un premier temps identifié une régulation réciproque existante entre la réplication du VHB et FXRalpha. Puis nous avons montré in vitro, dans des cellules HepaRG différenciées et des hépatocytes primaires humains, que FXRalphaest un facteur proviral pour le VHB et que les agonistes de FXRalpha inhibent l'expression de l'ensemble des marqueurs viraux de manière dépendante ou indépendante de la protéine virale HBx. Enfin, dans un modèle in vivo de souris C3H/HeN transduites par un vecteur recombinant AAV2/8-VHB, nous avons obtenu l'effet inhibiteur des agonistes de FXRalphamais uniquement chez les souris adultes et pas chez les souris jeunes. Compte tenu de l'évolution de la flore intestinale avec l'âge et de son importance dans le métabolisme des AB, ces résultats suggèrent que le fort taux d'évolution chronique chez les jeunes enfants pourrait être lié à l'immaturité du métabolisme des AB. La mise en évidence d'un lien entre microbiote, métabolisme des AB et infection par le VHB contribuerait grandement à une meilleure compréhension de l'histoire naturelle de cette infection. De plus, l'identification de FXRalphacomme un facteur de l'hôte favorisant l'infection et l'existence de molécules capables de moduler l'activité de FXRalphasuggèrent que FXRalphapourrait constituer une cible thérapeutique intéressante ciblant le cccDNA et permettant d'améliorer le traitement des patients infectés par le VHB / Hepatitis B virus (HBV) infection is a major global health problem with more than 257 million chronic carriers worldwide that remain at significant risk for developing cirrhosis and/or hepatocellular carcinoma. The natural history of infection is very different depending on the age at which the infection is contracted. Whereas in adults most HBV infections spontaneously resolve, in infants and young children they usually result in chronic infection. cccDNA is the molecular form of viral persistence in infected hepatocytes and serves as a transcription template for all viral RNAs. The viral protein HBx plays a crucial role in the recruitment of epigenetic factors to the cccDNA and promotes its transcriptional activity. Currently, interferon and nucleot(s)ide analogues are the first-line agents in the treatment of chronic hepatitis B without allowing eradication of cccDNA and their interruption are almost always followed by a reactivation of the replication of the virus. New therapeutic molecules targeting cccDNA are therefore needed to hope for a functional cure in chronically infected patients. HBV infection and bile acid (BA) metabolism are tightly linked. Therefore, our team has previously shown that the bile acid nuclear receptor, the farnesoid X receptor alpha (FXRalpha) bind to two response elements present in the Enhancer II - Core promoter region of HBV genome and modulate its transcriptional activity. Moreover, HBV and BA compete for the same entry receptor of hepatocytes NTCP and modify BA cell concentration with consequences on the function and expression of FXRalpha. Finally, HBx interacts with FXRalpha and modify its activity. During my PhD. we have first identified a reciprocal regulation between HBV replication and FXRalpha. Second, we have showed in vitro, in HepaRG differentiated cells and in primary human hepatocytes, that FXRalpha is a proviral factor for HBV and that FXRalpha agonists inhibit the expression of all HBV markers in a dependent or independent manner of the viral protein HBx. Finally, in an in vivo model of C3H/HeN mice transduced with a recombinant AAV2/8-HBV vector, we obtained the inhibitory effect of FXRalpha agonists but only in adult and not in young mice. Considering the evolution of the gut flora with age and its importance in the metabolism of BA, these results suggest that the high rate of chronic progression in young children might be related to the immaturity of BA metabolism. The identification of a link between BA metabolism, gut microbiome composition and evolution of HBV infection will represent a big step toward the understanding of HBV natural history. Moreover, the identification of FXRalpha as a proviral factor for HBV and the capacity of FXRalpha ligands to modulate the transcriptional activity of cccDNA suggest that FXR ligands might represent a new class of molecules with the aim to obtain functional cure for HBV infected patients

Electrical motors and/or hydraulics and pneumatics cylinders are commonly used methods of actuation in mechanical systems. Over the last two decades, due to arising market needs, novel self-independent mobile systems such as mobility assistive devices have emerged with the help of new advancements in technology. The actuation criteria for these devices differ greatly from typical mechanical systems, which has made the implementation of classical actuators difficult within modern assistive devices. Among the numerous challenges, limited energy storage capabilities by mobile systems have restricted their achievable operational time. Furthermore, new expectations for device weight and volume, as well as actuator structural compliance, have added to this quandary. Electroactive polymers, a category of smart materials, have emerged as a strong contender for the use in low-cost efficient actuators. They have demonstrated great potential in soft robotic and assistive device/prosthetic applications due to their actuation potential and similar mechanical behaviour to human skeletal muscles. Dielectric Elastomers, in particular, have shown very promising properties for these types of applications. Their structures have shown large achievable deformation, while remaining light-weight, mechanically efficient, and low-cost. This thesis aims to characterize, and model the behaviour of 3MTM VHB polyacrylic dielectric elastomer, in order to establish a foundation for its implementation in a proposed novel linear actuator concept. In this thesis, a comprehensive experimental evaluation is accomplished, which resulted in the better understanding of the elastomer’s biaxial mechanical and electro-mechanically coupled behaviours. Subsequently, a constitutive biaxial mechanical model was derived in order to provide a predictive design equation for future actuator development. This model proved effective in providing a predictive tool for the biaxial mechanical tensile response of the material. Finally, a simplified prototype was devised as a proof of concept. This first iteration applied experimental findings to validate the working principles behind the proposed actuator design. The results confirmed the proof of concept, through achieved reciprocal linear motion, and provided insight into the design considerations for prototype optimization and final actuator development.

This diploma thesis is focused on testing drug users. Specifically, this thesis is concerned with testing drug users in low-threshold centres.These low-threshold centres for drug users operate in the area of secondary and tertiary prevention. Furthermore, it describes individual diseases such as HIV, HBV, HCV and syphilis, their mode of transmission, clinical course, diagnosis, treatment and possible prevention, drug policy of the Czech Republic, the conditions for testing the abovementioned diseases in low-threshold centres and the legal framework for testing at these facilities.The practical part is divided into several research studies.The qualitative research is aimed at low-threshold centres. In this part, I am trying to determine the number of HIV, HBV and HCV tests performed in 2014. Next, the purpose of this section is also to define where the testing takes place and who is tested. The research data were obtained using a questionnaire distributed to the low-threshold centres in the CR. According to the Annual Report on Drug Epidemiology from 2014, there are 76 low-threshold centres in the Czech Rep. A total of 32 questionnaires were collected. The questionnaire consisted of 32 questions. Close-ended questions were used to detect the type of facility, whether the facility carries out tests for the chosen types of diseases, what type of test is used, who performs the testing and where the testing is carried out. Open-ended questions were used to determine the number of people tested. The qualitative research consists of 18 interviews with drug users from the Contact Centre Český Krumlov. Thanks to its field program, this centre operates in Český Krumlov, Větřní, Kaplice, Horní Planá, Loučovice, Frymburk, Vyšší Brod and in border regions such as Horní and Dolní Dvořiště or Studánky where the drug abuse is very problematic. The data were collected using a semistructured anonymous interview. The interview consisted of 4 areas:Data for identification purposes. Drug history.Testing.Awareness.30 questionnaires received from the respondents at the Prevent Contact Centre in České Budějovice can be found in the Appendix. The data were collected using an anonymous questionnaire which consisted of three basic areas. The collected data included drug history and identification information, information about testing for infectious diseases and knowledge of health risks. The thesis states 6 goals. The first 3 goals deal with mapping of HBV, HCV and HIV testing among drug users at low-threshold centres in 2014. The purpose of the fourth goal is to determine how the testing is carried out in low-threshold centres. The fifth goal attempts to establish whether drug users are interested in HBV, HCV and HIV testing. Finally, the sixth goal determines whether drug users were tested in 2014.After processing the results I established the following hypotheses which resulted from the research.H1: Drug users are interested in their health.H2:Drug users are aware of risks that result from these diseases.H3: The possibility of testing at low-threshold centres is not chosen very often by drug users.The research showed that drug users have adequate information about the risks that are associated with drug injection and injecting equipment sharing, but the average amount of performed tests is relatively low.To sum up, drug users need to be constantly informed about the importance of regular testing. In order to increase the number of tested people, it would be advisable to adapt the testing to the users' needs and also to perform more tests within field programs. It would also be helpful to link health facilities to contact centres locally.

Le diagnostic et le suivi des infections par le VIH, VHB et VHC restent un défi dans les pays à faibles ressources qui sont par ailleurs les plus touchés. Il est urgent de pouvoir disposer d'outils de biologie simples, fiables et peu chers pour le contrôle de ces infections virales. Le défi est immense d'un point de vue clinique et politique de santé. L'objectif de ce travail de recherche effectué dans le cadre de la présente thèse est de développer et valider des stratégies et de nouveaux outils de biologie adaptés au diagnostic et au suivi des hépatites virales et de l'infection VIH dans les pays à ressources limitées. Dans un premier temps, nous avons investigué sur les résultats de sérologie VIH discordants, car en biologie et en pratique clinique, il est important d'établir le statut sérologique réel des personnes dépistées avec des résultats clairs pour une prise de décision adéquate à l'échelle individuelle. Dans ce travail, nous avons trouvé que les résultats discordants par l'algorithme de dépistage des femmes enceintes au Burkina Faso, étaient dans 94% des cas de faux positifs dus au test Determine™ HIV-1/2 et 4% de faux négatifs liés au test Genie II™ HIV-1/HIV-2. En matière de santé publique, les femmes présentant ce type de résultat peuvent être considérées comme séronégatives dans les centres où des investigations supplémentaires ne sont pas possibles, surtout dans les pays comme le Burkina Faso où la prévalence de l'infection est basse avec une faible diversité génétique. Dans un second temps, nous avons focalisé nos travaux sur la faisabilité d'une stratégie de dépistage qui combine la détection des trois infections (VIH, VHB et VHC) sur une seule carte DBS. Dans cette étude pilote, nous avons démontré que le DBS collecté en parallèle au test rapide VIH dans un centre de dépistage volontaire permet d'une part de faire la confirmation du VIH par immunoblot, et d'autre part de compléter par le diagnostic des hépatites B et C par ELISA suivi de western blot et PCR pour la confirmation pour le VHC. Cette stratégie peut servir de modèle pour promouvoir et vulgariser le dépistage des hépatites virales B et C dans les pays à ressources limitées. Le DBS peut servir de contrôle et de confirmation du diagnostic du VIH, VHB et VHC. Par la suite, nous avons évalué la performance de deux tests de 4ème génération immunoluminométriques (Elecsys® HIV Combi PT assay, Roche Diagnostics et Liaison® XL Murex HIV Ab/Ag test, DiaSorin) sur des échantillons séchés sur papier filtre en comparaison au test de diagnostic rapide et aux échantillons de sérum frais prélevés chez les patients en primo-infection VIH. Ces travaux ont clairement montré que les deux tests de 4ème génération réalisés sur papier filtre offrent de bonnes performances dans le diagnostic de la primo-infection par rapport aux tests de diagnostic rapide sur sérum frais. Cette méthode peut être utilisée pour détecter précocement le VIH chez les personnes difficiles à atteindre et les populations vivant dans des zones périphériques des pays à ressources limitées. Enfin, nous avons mis au point une technique de PCR en temps réel de détection et de quantification de l'ADN du VHB. A cet effet, nous sommes partis de deux PCR « maison » ciblant deux régions génomiques différentes (gène X pour la qPCR 1 et gène S pour la qPCR 2) en comparaison à un test commercial de charge virale (Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV Test, version 2.0, Roche Diagnostics). La qPCR 2 avec un seuil de détection à 91 UI/ml (vs 104 UI/ml pour la qPCR 1) a montré une meilleure performance dans la quantification de l'ADN du VHB. Cette qPCR 2 peu chère est aujourd'hui produite sous forme de kit par une start-up appelée OMUNIS. Ce kit en développement fera l'objet d'une évaluation multicentrique en France, en Afrique et en Asie du Sud-Est à travers un réseau de laboratoires sous la promotion de l'ANRS. / Diagnosis and management of hepatitis B, hepatitis C and HIV infections are a real challenge in middle and low-income countries. There is an urgent need for simple, reliable and inexpensive tools to control these infections in high prevalence sittings like Africa and Asia. The challenge is immense in clinical and public health policy hands. The main goal of this research work performed for our PhD is the development and validation of strategies and tools to diagnose and monitor HIV, HBV and HCV infections in resource-constrained countries. At a first step, we investigated the results of HIV discordant results, since it is important to establish the real HIV status of people tested with clear results for appropriate decision-making in biological and clinical practice. This work show that discordant results obtained in the algorithm of HIV screening among pregnant women in Burkina Faso, are false positive results in 94% of cases due to the Determine™ HIV-1/2 immunochromatographic test and false negative results in 4% of cases due to the Genie II ™ HIV-1 / HIV-2 test. In public health practice, women with this type of result can be considered as negative for HIV testing in centers where additional investigations are not possible, especially in countries like Burkina Faso with a low incidence and a low genetic diversity of HIV.In a second step, we focused our work on the feasibility of a screening strategy that detects HIV, HBV and HCV infections into a single card of DBS. In this pilot study, we demonstrated that DBS collected in parallel to HIV rapid testing in a voluntary counseling and testing center allows HIV confirmation using immunoblotting, and an additional testing by diagnosing HBV and HCV using ELISA followed by immunoblotting and PCR for HCV confirmation. This strategy can serve as a model to promote and scale-up the screening of HBV and HCV in resource-limited countries. DBS can be served as control and confirmation of HIV, HBV and HCV diagnosis. Furthermore, we evaluated the performance of two 4th generation chemiluminescent immunoassays (Elecsys HIV Combi PT assay, Roche Diagnostics and Liaison XL Murex HIV Ab/Ag test, DiaSorin) tested on filter paper samples in comparison to rapid diagnostic test and fresh serum samples from patients with acute HIV infection. These studies have clearly shown that the two 4th generation tests performed on filter paper offer good performance in terms of sensitivity for the diagnosis of HIV infection in its early phases compared with rapid diagnostic tests. This approach may be used in combination with HIV rapid tests in hard-to-reach individuals and populations living in remote areas of when an early HIV infection is suspected since rapid tests do not offer appropriate performance in this case.Finally, we developed a real-time PCR for HBV DNA detection and quantification. In this study, we evaluated two in-house PCR targeting two different regions of HBV genome (X gene for qPCR 1 and S gene for qPCR 2) in comparison with a commercial Roche HBV DNA test (Cobas AmpliPrep / Cobas TaqMan HBV Test, version 2.0, Roche Diagnostics) as a gold standard. The qPCR 2 with a low detection limit of 91 IU/ml (vs 104 IU/ml for 1 qPCR) showed a better performance in HBV DNA quantification. This inexpensive qPCR with best performance characteristics is producing by a start-up called OMUNIS. This kit will be evaluated in France, in Africa and in South and East Asia in a research study funded by ANRS (France REcherche Nord & sud Sida-hiv Hépatites).

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la principale forme de cancer primitif du foie. Le CHC présente des variations d'incidence géographique qui reflètent les variations de prévalence des infections chroniques par les virus de l'hépatite B (VHB) et/ou C (VHC), ainsi que l'exposition alimentaire aux aflatoxines. Dans les régions de haute incidence, une mutation spécifique au le codon 249 du gène TP53 est très fréquemment détectée dans les CHC et a été proposée comme un marqueur moléculaire de l'exposition aux aflatoxines. La protéine mutée correspondante, p.R249S, interagit avec l'oncogène viral HBx, qui module la réplication virale, la prolifération et la survie cellulaire. Des séquences HBX sont détectables dans l'ADN génomique de plus de 80% des CHC liés au VHB. Nous avons étudié les associations de mutation R249S avec les caractéristiques moléculaires de HBX et la progression du CHC en utilisant des spécimens obtenus dans deux études cas-témoins développées Thaïlande et en Gambie. Nos résultats démontrent (1) que la mutation R249S est préférentiellement associée aux CHC qui se développent en l'absence de cirrhose hépatique préexistante ; (2) que la mutation est associée à la présence de polymorphismes dans l'intron 1 de TP53, suggérant l'influence de facteurs de susceptibilité génétique sur la formation des mutations ; (3) que la mutation est généralement associée à la rétention dans les cancers de séquences de HBX complètes. Ces résultats suggèrent que la protéine mutée p.R249S coopère avec HBx pour favoriser le développement de CHC sans cirrhose, et que la susceptibilité à la formation de cette mutation est influencée par la structure polymorphique de TP53 / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the main form of primary liver cancer. HCC presents geographical variations in incidence that reflect variations in the prevalence of chronic infections by hepatitis B virus (HBV) and / or C (HCV) and dietary exposure to aflatoxins. In areas of high incidence, a specific mutation at codon 249 of TP53 gene is frequently detected in HCC and has been proposed as a molecular hallmark of aflatoxin exposure. The corresponding mutated protein p.R249S, interacts with the viral oncogene HBx, which modulates viral replication, proliferation and cell survival. HBX sequences are detectable in the genomic DNA of more than 80% of HBVrelated HCC. We investigated the associations of mutation R249S with the molecular characteristics of HBX and progression of HCC using specimens obtained in two case-control studies developed in Thailand and in The Gambia. Our results demonstrate (1) that the mutation R249S is preferentially associated with HCC that develop in the absence of pre-existing liver cirrhosis, (2) that the mutation is associated with the presence of polymorphisms in intron 1 of TP53, suggesting influence of genetic susceptibility factors on the formation of mutations, (3) that the mutation is usually associated with the retention of cancers with complete HBX sequences. These results suggest that the mutated protein p.R249S cooperates with HBx to promote the development of HCC without cirrhosis, and that susceptibility to the formation of this mutation is influenced by the polymorphic structure of TP53

Les tests de laboratoire basés sur des techniques de biologie moléculaire sont des outils inestimables pour le suivi des patients, en particulier dans le cadre de l’infectiologie. Dans ce contexte clinique, ils peuvent permettre d’établir un diagnostic, un pronostic ainsi que de déterminer la stratégie thérapeutique antivirale la plus adaptée. Les virus hautement variables tel que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), de l’hépatite B (VHB) et de l’hépatite C (VHC) sont présents sous forme de quasi-espèces au sein de leur environnement réplicatif. Lorsque des pressions de sélection s’exercent telle que l’administration d’un antiviral, une redistribution des variants majoritaires est fréquemment observée en variants mutés pour mieux s’adapter à cet environnement. Nos travaux ont permis, dans ce contexte, de valider l’impact clinique des mutations majoritaires mais aussi minoritaires grâce à la mise en œuvre de plusieurs techniques de séquençage (pyroséquençage, séquençage à haut débit et PCR en allèle spécifique). Nous avons également validé l’utilisation d’un logiciel simple, fiable et utilisable en routine par le clinicien pour l’interprétation clinique de la masse de données générées par le séquençage à haut débit. Enfin dans le contexte du test diagnostique, nous avons cliniquement validé sur une cohorte de patients infectés par le VHB, l’utilisation du papier buvard (Dried Blood Spot) comme support de prélèvement alternatif non invasif de diagnostic, en particulier pour les populations n’ayant pas accès aux structures classiques de soins et pour les pays en voie de développement. / Molecular biology based assays are invaluable tools for the patients follow-up. They can help to establish the prognosis, guide for the treatment decisions and assess the virological response to therapy. Highly variable viruses like Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B Virus (HBV) and Hepatitis C virus (HCV) which have a quasispecies distribution. Selection pressure on viral replicative environment such as an antiviral drug treatment, generally lead to a redistribution of the viral quasispecies with an increasing of the best adapted viral mutant. Our work allowed in this context to validate the clinical impact of majority but also minority mutations through the implementation of several sequencing techniques (pyrosequencing, high-throughput sequencing and allele-specific PCR). We also validated the use of a simple, reliable and routinely software solution by clinician for clinical interpretation of the mass of data generated by high-throughput sequencing. Finally, in the context of the diagnostic testing, we clinically validated in a cohort of patients infected with HBV, use the Dried Blood Spot technique as a supporting noninvasive diagnostic alternative sampling, especially for populations that have no access to conventional health structures and developing countries.

Les cellules NK sont des lymphocytes de l’immunité innée qui ont un rôle majeur dans le contrôle précoce des infections virales et dans l’immunosurveillance des tumeurs. Cependant, en cas de stimulation chronique, un état d’anergie, où les cellules NK n’exercent plus leur fonction a été mis en évidence. Les mécanismes conduisant à cette perte de fonction demeurent mal caractérisés et s’il s’agit d’une cause ou d’une conséquence de la chronicité n’est pas non plus déterminé. Cibler les cellules NK constitue une perspective thérapeutique de choix mais nécessite une meilleure compréhension de ces aspects. L’objectif de ce travail de thèse s’articule autour de trois points. Premièrement, nous avons généré un modèle tumoral murin sensible aux cellules NK permettant l’étude de la réponse anti-tumorale et l’établissement d’une stimulation chronique. Deuxièmement, l’utilisation de ce modèle a permis d’investiguer les mécanismes conduisant à la perte de fonctionnalité des cellules NK et de tester des stratégies de restauration. Enfin, nous avons mené une étude parallèle, chez l’homme, par analyse d’une cohorte de patients chroniquement infectés par le virus de l’Hépatite B dans le but de déterminer le phénotype des cellules NK et d’identifier les causes conduisant à leur perte de fonction dans ce contexte / NK cells are innate lymphocytes which play a crucial role in the early control of viral infection and in tumor immunosurveillance. However, a state of tolerance, where NK cells are poorly functional, occurs in the context of chronic stimulation. The mechanisms leading to this process remain poorly understood and whether this is a cause, or a consequence of chronicity is unknown. Targeting NK cells appears to be a potent therapeutic strategy but requires further investigation. With the lack of clarity in the field this work had three main objectives. First, we engineered a tumoral mouse model that was strongly immunogenic for NK cells and thus allowed us to study the anti-tumoral response of NK cells and to trigger chronic stimulation. Then, we used this model to investigate the mechanisms driving NK cell loss of function and to test potential therapeutic strategies to reverse this state. Finally, in the context of human chronic infection we analyzed samples from HBV infected patients in order to determine the phenotype, function and signaling capacity of NK cells to identify the drivers of NK cell dysfunction

This thesis presents the results of testing and modeling conducted to characterize the performance of 3M™ VHB™ structural glazing tape in both shear and tension. Creep rupture testing results provided the failure time at a given static load and temperature, and ramp-to-fail testing results provided the ultimate load resistance at a given rate of strain and temperature. Parallel testing was conducted on three structural silicone sealants to compare performance. Using the time temperature superposition principle, master curves of VHB tape storage and loss moduli in shear and tension were developed with data from a dynamic mechanical analyzer (DMA). The thermal shift factors obtained from these constitutive tests were successfully applied to the creep rupture and ramp-to-fail data collected at 23°C, 40°C, and 60°C (73°F, 104°F, and 140°F), resulting in master curves of ramp-to-fail strength and creep rupture durability in shear and tension. A simple linear damage accumulation model was then proposed to examine the accumulation of wind damage if VHB tape is used to attach curtain wall glazing panels to building facades. The purpose of the model was to investigate the magnitude of damage resulting from the accumulation of sustained wind speeds that are less than the peak design wind speed. The model used the equation derived from tensile creep rupture testing, extrapolated into the range of stresses that would typically be generated by wind loading. This equation was applied to each individual entry in the data files of several real wind speed histories, and the fractions of life used at each entry were combined into a total percentage of life used. Although the model did not provide evidence that the established design procedure is unsafe, it suggested that the accumulation of damage from wind speeds below the peak wind speed could cause a VHB tape mode of failure that merits examination along with the more traditional peak wind speed design procedure currently recommended by the vendor. / Master of Science

Abstract In plants, there are at least three types of haemoglobins (Hbs): symbiotic, non-symbiotic and truncated. Symbiotic Hbs are known to participate in nitrogen fixation, but the roles of the latter two groups are more obscure. Previous reports have connected both plant non-symbiotic and truncated Hbs to the scavenging of an important signal molecule, nitric oxide (NO). The aim of the present thesis was to study the effects of a bacterial Hb of Vitreoscilla sp. (VHb) on a woody model organism, hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides), and the role of endogenous hybrid aspen Hbs. To store the produced hybrid aspen lines, the suitability of different cryopreservation methods was also tested. VHb-expressing hybrid aspens were generated by Agrobacterium-mediated gene transfer. The effects of VHb expression were examined in standard greenhouse conditions, under elevated UV-B light as well as during culture with ectomycorrhizal fungi. Both slow cooling and vitrification methods were applied in cryostoring samples of the different genetic backgrounds. Hybrid aspen non-symbiotic and truncated Hb genes PttHb1 and PttTrHb, respectively, were also isolated. The function of the genes and corresponding proteins PttHb1 and PttTrHb were studied using non-transgenic and VHb hybrid aspen lines as well as a mutant yeast (Saccharomyces cerevisiae) defective in NO resistance. VHb expression did not improve the general growth of hybrid aspen but resulted in enhanced starch accumulation in chloroplasts, pointing to changes in energy metabolism. Of the studied cryopreservation protocols, the slow cooling of dormant in vivo buds proved to be the most feasible way of cryostoring hybrid aspen lines. The culture with the ectomycorrhizal fungus was shown to increase the expression of both PttHb1 and PttTrHb in the roots of non-transgenic lines. However, the fungi did not up-regulate the hybrid aspen Hb genes in the VHb lines. Therefore, it is hypothesized that endogenous Hbs may contribute to the growth of roots and that VHb may compensate this function. When expressed alone in the mutant yeast, the recombinant PttHb1 and PttTrHb did not protect cells against the toxicity of NO. Subsequently, a novel mRNA transcript of the heterotrophic ferredoxin NADP+ oxidoreductase gene PtthFNR was found. The absence of a plastid presequence in the transcript suggests targeting of the encoded protein into cytosol. The coexpression of PttHb1 and cytosolic PtthFNR partially rescued the mutant yeast during NO treatment, demonstrating for the first time that plant Hb1 with an applicable reductase scavenges NO in vivo at a physiologically relevant rate. This thesis extends current knowledge about plant Hbs and the effects of VHb on a phenotype of a tree. It also provides new information about plant ferredoxin reductase genes. / Tiivistelmä Kasvihemoglobiinit jaetaan symbioottisiin, ei-symbioottisiin sekä ns. katkaistuihin eli truncated-hemoglobiineihin. Symbioottisten hemoglobiinien tiedetään osallistuvan typen sitomiseen, kun taas kahden muun ryhmän toiminta tunnetaan heikosti. Aiemmissa tutkimuksissa ei-symbioottiset ja truncated-hemoglobiinit on yhdistetty tärkeän signaalimolekyylin, typpimonoksidin (NO), haitallisuuden vähentämiseen. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia Vitreoscilla sp. -bakteerin VHb-hemoglobiinin vaikutuksia puuvartiseen mallikasviin, hybridihaapaan (Populus tremula x tremuloides), sekä hybridihaavan omien hemoglobiinien merkitystä. Lisäksi työssä kokeiltiin eri nestetyppisäilytysmenetelmiä hybridihaapalinjojen varastoimiseksi. VHb:tä ilmentävät hybridihaavat tuotettiin Agrobacterium-välitteisellä geeninsiirrolla. VHb:n vaikutuksia tutkittiin kasvihuoneolosuhteissa, kohotetussa UV-B-säteilyssä sekä sienijuurikasvatuksen aikana. Eri linjojen nestetyppisäilytykseen sovellettiin sekä hidasta että nopeaa jäähdytystä. Tutkimuksissa myös eristettiin hybridihaavan PttHb1- ja PttTrHb-hemoglobiinigeenit. Näiden geenien sekä niiden koodaamien PttHb1- ja PttTrHb-proteiinien toimintaa tutkittiin siirtogeenittömien ja VHb-hybridihaapalinjojen sekä NO-herkän hiivamutantin (Saccharomyces cerevisiae) avulla. VHb-ilmennys ei parantanut hybridihaavan kasvua, mutta lisäsi tärkkelyksen kertymistä viherhiukkasiin, mikä viittaa muutoksiin energia-aineenvaihdunnassa. Tutkituista menetelmistä parhaiten hybridihaapalinjojen nestetyppisäilytykseen soveltui lepovaiheessa olevien in vivo -silmujen hidas jäähdytys. Toisin kuin VHb-kasveissa, sienijuurikasvatus voimisti sekä PttHb1:n että PttTrHb:n ilmenemistä siirtogeenittömien hybridihaapojen juurissa. Tästä johtuen esitettiin, että hybridihaavan hemoglobiinit voivat vaikuttaa juurien kasvuun ja VHb pystyy korvaamaan tämän toiminnon. Kun PttHb1 ja PttTrHb ilmennettiin yksin mutanttihiivassa, proteiinit eivät suojanneet soluja NO:n myrkyllisyydeltä. Tämän jälkeen työssä kuvattiin heterotrofisen ferredoksiini-NADP+-oksidoreduktaasi-geenin PtthFNR:n uusi mRNA-muoto. Plastidiin ohjaavan sekvenssin puuttuminen geenituotteesta viittaa siihen, että mRNA:n koodaama proteiini sijoittuu solulimaan. PttHb1:n ja PtthFNR:n yhtäaikainen ilmentäminen mutanttihiivassa paransi solujen elossa säilymistä NO-käsittelyn aikana, mikä osoittaa ensimmäistä kertaa, että kasvin Hb1 pystyy sopivan reduktaasin kanssa vähentämään NO-pitoisuutta elävässä eliössä. Tämä työ laajentaa tietämystä kasvihemoglobiineista sekä VHb:n vaikutuksesta puiden ilmiasuun. Työ myös lisää tietoa kasvien ferredoksiinireduktaasi-geeneistä.

Le VHB est un problème majeur puisque les 350 millions de porteurs chroniques existant ont un risque accru de développer une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire. Compte tenu du manque de système d'étude du VHB in vitro qui soit facile d'accès et pleinement satisfaisant, l'objectif était d'améliorer l'un de ceux qui utilisent des baculovirus VHB recombinants pour délivrer le génome VHB dans des cellules hépatocytaires. La pertinence de ce système pour réaliser des tests phénotypiques et étudier le « fitness » des mutants résistants aux antiviraux a ensuite été démontrée. Enfin, l'utilisation de ces baculovirus VHB recombinants dans des cellules HepaRG a permis de mettre en évidence une réponse IFN efficace de l'hépatocyte suite à la synthèse des protéines du VHB. Ceci constitue une donnée nouvelle dans l'étude des interactions virus/cellules puisque le VHB était considéré jusqu'à présent comme un virus silencieux vis-à-vis de la réponse innée cellulaire. L'ensemble de ces résultats a des implications importantes dans la compréhension des mécanismes de persistance du VHB et le développement de nouveaux modèles cellulaires d'infection.