Malgré les avancées considérables de la cancérologie, de nouvelles thérapies sont toujours recherchées étant donné les effets secondaires des traitements actuels. Peu connue, la virothérapie oncolytique consiste à utiliser un virus pour détruire des cellules cancéreuses tout en épargnant les saines. Sur les mutants T1026R1 et TP3R1 du VSV de la famille des vésiculovirus portant un génome à ARN négatif de 11 kb, des efforts sont entrepris afin de prouver qu'ils sont des armes efficaces contre le cancer. Cependant, leur faible pouvoir apoptique ainsi que la persistance démontrée pour T1026R1 dans les cellules H4 les rendent moins attrayants. D'autres mutants du VSV, soit TR5R1 et TP6R1 pourraient également être de bons candidats dans la virothérapie oncolytique. Ils ne persistent pas, ils sont de meilleurs inducteurs d'apoptose et comme les mutants T1026R1 et TP3R1, ils induisent fortement la réponse des interférons. Afin de comprendre les différences quant au phénotype d'infection des mutants TP5R1 et TP6R1, le séquençage du génome entier de la souche sauvage HR ainsi que tous les mutants thermosensibles et thermorésistants a été entrepris. Les mutations responsables de la thermosensibilité vs thermorésistance pourront du même coup être révélées. Les résultats confirment les mutations M51R sur la protéine de la matrice de T1026R1 et de T1026 et V221F-S226R de TP3R1. Les mutants TP5R1 et TP6R1 portent respectivement les mutations E254Q et E254G sur le « PH domain » de leur glycoprotéine. Les mêmes mutations sont retrouvées chez TP5 et TP6 avec en plus la mutation D232G aussi sur le « PH domain ». L'analyse de la structure secondaire montre des changements par rapport au VSV Indiana HR, alors que l'analyse de la structure tridimensionnelle montre que seule la mutation D232G altère la structure. La présence de cette mutation sur les souches thermosensibles T1026, TP5, TP6 et le VSV Indiana San juan ainsi que sa conséquence sur la structure 3D laissent présager qu'elle pourrait être responsable de la thermosensibilité. La cartographie génétique des virus BR, T1026, T1026R1, TP3, TP3R1, TP5, TP5R1, TP6 et TP6R1 permettra d'approfondir la compréhension de leur phénotype d'infection particulier pour éventuellement construire un virus oncolytique recombinant conjuguant les avantages de chacun.

Les virus oncolytiques sont une nouvelle classe d’agents thérapeutiques pouvant être une alternative au traitement des cancers. Plusieurs virus oncolytiques sont actuellement développés en clinique, néanmoins de nombreuses améliorations sont à apporter afin de créer une nouvelle classe de virus plus efficaces et moins toxiques. Le premier objectif de cette thèse a été d’améliorer la spécificité tumorale du virus de la vaccine via le ciblage de l’antigène MUC1 présenté à la surface des cellules tumorales. Pour cela un virus recombinant présentant à sa surface un fragment d’anticorps (scFv) dirigé contre l’antigène tumoral MUC1 a été construit et produit. Les tests in vitro n’ont toutefois pas permis de mettre en évidence un ciblage spécifique du virus recombinant. Un deuxième aspect de cette thèse a été de tester le potentiel oncolytique de virus de la famille des Poxviridae. Durant ce travail de thèse, les capacités oncolytiques de douze poxvirus, appartenant à 8 genres différents, ont été étudiés. Leurs effets sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines ont été évalués. Les virus caractérisés par un effet oncolytique élevé ont été, par la suite, modifiés et armés par ingénierie virale afin d’augmenter leur efficacité. La dernière partie de cette thèse a été consacrée à la génération et la sélection de virus chimériques basées sur la méthode d’évolution dirigée. Cette méthode est utilisée pour mimer le processus naturel de sélection évolutif. Appliqué à la virothérapie oncolytique, ce procédé nous a permis de générer un nouveau virus oncolytique chimérique caractérisé par un potentiel anti-cancéreux amélioré. En résumé, cette thèse a permis, par des techniques d’ingénierie virale, par un criblage de nouveaux virus et par la méthode d’évolution dirigée, de créer et de sélectionner une nouvelle génération de poxvirus oncolytiques présentant une activité thérapeutique accrue avec un profil de toxicité atténué et pouvant être utilisés dans diverses indications thérapeutiques. / Oncolytiques viruses are a new class of therpeutic agents which could be an alternative for cancer treatment. Currently, several oncolytic viruses are evaluated in clinical trial, nevertheless improvements are needed to create a new class of more efficiente and less toxic viruses. The first objective of this thesis was to improved the vaccinia virus specificity through the targeting of the tumor-associated antigen MUC1. To address this goal, a recombinant virus expressing an scFv targeting the MUC1-protein was engineered and produced. However, in vitro, the demonstration of a specific targeting by the recombinant virus was not possible. A second aspect of this thesis work was to evaluate the oncolytic potential of Poxviridae family viruses. Oncolytic capacities of twelve viruses, belonging to eight genera, were evaluated. Their impact on human cancer cells was tested. In order to increase their efficacity, viruses with the highest oncolytic capacities were then modified and armed by genetic engineering. The third part of this work was devoted to the generation of chimeric viruses based on directed evolution process. This methodology is used to mimic the natural process of evolutionary selection. Applied to oncolytic virotherapy, this technique allowed the generation of a new chimeric oncolytic virus caracterised by an enhanced antitumoral potential. In summary, this thesis has allowed, through viral engineering, poxviruses screening and directed evolution methodology, the creation and selection of a new generation of oncolytic poviruses. These viruses demonstrate an increased therpeutic activity and greatest safety profil enabling their application in several therapeutic indication.

Le cancer ovarien est la 1ère cause de mortalité parmi les femmes atteintes de cancers gynécologiques avec une survie à 5 ans de 45% tous stades confondus et de seulement 17% pour les stades avancés (plus de 50% des patientes) qui présentent un risque de plus de 80% de rechute, d’où l’importance de trouver de nouvelles options thérapeutiques. On sait que les cancers ovariens épithéliaux (90% des cas) présentent une forte expression de la petite guanosine triphosphatase (GTPase) Ran (Ras-related nuclear protein) associée à un mauvais pronostic qui s'améliore lorsqu'on cherche à diminuer son expression, or aucune thérapie ciblant Ran n’existe actuellement. Une étude en 1997 menée par Her et al. déclare que la protéine de matrice du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) bloque Ran. De façon intéressante, il existe une souche oncolytique de VSV, VSVΔ51, utilisée en études cliniques. Les virus oncolytiques sont de puissants outils anticancer qui infectent et tuent spécifiquement les cellules tumorales et induisent une immunité antitumorale sans endommager les tissus sains. Basés sur ces données de littérature, nous avons voulu évaluer le potentiel de VSVΔ51 dans le cadre du cancer ovarien via sa capacité à bloquer Ran. Dans un premier article, nous avons étudié l’interaction entre Ran et VSVΔ51. Tandis que nous n’observons pas d’impact de VSVΔ51 à l’encontre de RanGTP, nous remarquons que Ran améliore l’infection par VSV. Cette fonction jusqu’alors inconnue offre de nouvelles possibilités concernant la virothérapie par VSV et d’autres virus oncolytiques, qui seraient d’autant plus efficaces chez les patientes présentant des cancers ovariens de haut grade connus pour surexprimer Ran. Étant donné que bloquer Ran ne semble pas la meilleure stratégie pour ces patientes, nous nous sommes focalisés, dans un second manuscrit, sur l’optimisation d’une nouvelle virothérapie oncolytique efficace dans le cancer ovarien. Nous avons utilisé la biobanque du CRCHUM nous donnant accès à 32 lignées cellulaires de cancer ovarien issues de patientes. De façon intéressante, près de 2/3 des lignées sont sensibles à la virothérapie par VSVΔ51. Afin d’améliorer la thérapie pour le tiers des modèles résistants à VSV, des combinaisons avec différentes drogues ont été testées. Bien qu’aucune des thérapies actuelles en cancer ovarien n’ait aidé la virothérapie, aucune de ces combinaisons n’a induit une diminution de l’infection virale. De plus, nous avons montré que les lignées résistantes à VSV sécrètent et répondent à l’interféron, et deviennent sensibles lorsque nous bloquons cette voie à l’aide d’inhibiteur de Janus kinase (JAK). Cette étude offre de nouvelles perspectives pour les patientes atteintes de cancers ovariens qu’elles soient sensibles ou résistantes à la virothérapie par VSV seule, afin de prolonger leur survie ainsi que leur qualité de vie. Ce projet de recherche montre que RanGTP, en plus d’être un marqueur pronostique, pourrait également servir de critère de sélection thérapeutique pour la virothérapie de patientes atteintes de cancer ovarien. De plus, on sait désormais que ces patientes pourraient bénéficier de la virothérapie par VSV en combinaison avec des inhibiteurs de JAK afin d’augmenter leurs chances de survie. / Ovarian cancer is the deadliest gynecologic cancer with a 5-year survival rate of only 45%. At diagnosis, more than 50% of patients present a high-grade cancer associated with a 5-year survival rate of only 17% as well as a probability of relapse of 80% hence the importance of finding new therapeutic options for these patients. Epithelial ovarian cancers (90% of the cases) present a high expression of the small guanosine triphosphatase (GTPase) Ran (Ras-related nuclear protein) which is associated with a poor prognosis. Inhibition of Ran leads to a better survival, however there is still no therapy targeting Ran. The study of Her et al. in 1997, claimed that the vesicular stomatitis virus (VSV)’s matrix protein inhibited Ran. Interestingly, VSVΔ51, an oncolytic variant of VSV, is largely studied in clinical studies. Oncolytic viruses, such as VSVΔ51, represent a promising immunotherapeutic option leading to infection and killing of tumour cells as well as the induction of an antitumour immune response, leaving healthy cells undamaged. Based on the literature, we sought to evaluate VSVΔ51’s therapeutic potential in ovarian cancer via its capacity to block Ran. In a first scientific paper, we studied the interplay between Ran and our model virus. Even though we did not find Ran to be inhibited by VSV, we discovered a previously unknown pro-viral function of Ran. This offers new possibilities for virotherapy using VSV, and other viruses, which are thought to be even more efficient in high grade ovarian cancers that are known to highly express Ran. Although the results of our first study show that VSV is a promising treatment for ovarian cancers, our initial hypothesis has not been confirmed and using VSV to block Ran is not a good strategy for patients with ovarian cancer. In a second paper, we focused on the optimization of a new effective oncolytic virotherapy for these patients. We took advantage of the CRCHUM’s ovarian cancer biobank giving us access to 32 cell lines derived from patients. Interestingly, nearly 2/3 of the cell lines are sensitive to VSVΔ51 virotherapy. In order to improve therapy for the third of patients not responding optimally to VSV alone, combinations with drugs have been tested. Although none of the combinations with current therapies in ovarian cancer improved VSV virotherapy, there was no decrease in viral infection. Moreover, we have shown that lines resistant to virotherapy secrete and respond to interferon and become sensitive upon interferon blockade using JAK inhibitors. This study offers new treatment possibilities for patients with ovarian cancers, whether they are sensitive or resistant to VSV virotherapy alone, in order to improve their survival and quality of life. This research project shows that RanGTP, in addition to being a prognostic marker, can also be used as a therapeutic selection criterion for virotherapy of patients with ovarian cancer. In addition, we now know that patients with ovarian cancer could benefit from VSV virotherapy in combination with JAK inhibitors as a new therapeutic option to increase their chances of survival.