Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2009

Thesis (doctoral)--Swedish University of Agricultural Sciences, 2000. / Includes bibliographical references.

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in engl. Sprache.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen. / In many cases, it is difficult to draw a clear distinction between extraintestinal pathogenic (ExPEC) and commensal E. coli strains as virulence-associated factors of ExPEC can also be found in commensal strains. Being closely related to the uropathogenic strain CFT073 E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) exhibits expression of several of such “ExPEC virulence factors”. Belonging to those are various fimbriae, siderophores, and proteins involved in biofilm formation. Therefore, the comparison of ExPEC isolates and E. coli Nissle 1917 can reveal insights into the function of these factors within the respective ecological context. E. coli Nissle 1917 exhibits the so-called rdar morphotype, a multicellular structure based on the co-expression of cellulose and curli fimbriae. It can be found in many E. coli and Salmonella species, but is usually restricted to temperatures below 30 °C. However, E. coli Nissle 1917 features this phenotype also at 37 °C which might increase its colonization ability compared to other commensal E. coli. Here, it could be demonstrated that expression of the rdar morphoype in E. coli Nissle 1917 is independent of the two regulators described so far, CsgD and YaiC. Thus, by applying transposon mutagenesis using miniTn5 it was screened for rdar-negative mutants. The aim was to discover a superordinate regulator of this phenotype. During this investigation, several genes were identified which so far had not been reported to influence expression of cellulose or curli fimbriae. While the function of many of the determined ORFs was unknown, the inactivation primarily of genes involved in the biosynthesis of surface structures (fimbriae, capsule, colanic acid, LPS) resulted in an altered phenotype. However, only in a few cases a connection to the biosynthesis of curli fimbriae or cellulose could be established. In conclusion, the regulation of curli and cellulose biosysnthesis proved to be more complex and dependent – at least indirectly – on more factors than previously described. In the second part of this thesis, a genomic island, 55 kb in size and inserted into the asnW-tRNA locus, was investigated, which encodes proteins necessary for the synthesis of a hybrid nonribosomal peptide-polyketide. By PCR the island was proven to be present in extraintestinal pathogenic as well as in commensal isolates of the phylogenetic group B2, among those the strains E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073, and J96. Cocultivation of HeLa cells with those bacteria induced cell cycle arrest and megalocytosis (cytopathic effect). Deletion of the asnW island resulted in abolition of the cytopathic effect, which could be restored by introduction of a BAC vector containing the gene cluster. The cytopathic effect was only observed after direct contact of the bacteria with HeLa cells and could not be achieved using bacterial lysates, killed bacteria or culture supernatants. The PKS/NRPS gene cluster comprises 18 ORFs (clbA to clbR) of which 17 are involved in the synthesis of the active compound. The number of gene products and the sequence of putative domains differ from those of all PKS/NRPS systems described so far. Investigations on the transcription of the island revealed three monocistronically transcribed units and four polycistrons of sizes up to 23 kb. In addition, a constitutive transcription of every ORF was observed, albeit at variable levels. Upon cell contact, neither elevated transcription nor different promoter activities of single ORFs were observed. Thus, the contact dependence of the cytopathic effect does not seem to result from an induction of expression caused by HeLa cells. The contact dependence could not be overcome by induction or overexpression of either a PKS/NRPS (clbB), the putative key enzymes thioesterase (clbQ) and phosphopantetheinyl transferase (clbA), or the potential regulator clbR. Using luciferase reporter gene fusions an influence of diverse media and culture conditions on the promoter activities of singele genes was detected. This was ascribed to the influence of the BarA/UvrY two-component system, which regulates the carbon metabolism of E. coli on the post-transcriptional level via CsrA/CsrBC. The natural uvrY deletion mutant UPEC 536, despite containing the complete PKS/NRPS gene cluster, did not exhibit an cytopathic effect. However, this feature could be restored by complementation with uvrY. This is the first evidence for an regulatory mechanism of the PK/NRP synthesis located beyond the asnW island. The in vivo function of the peptide-polyketide so far remains unclear, but it might affect fitness as well as virulence of E. coli.

Der human pathogene Erreger Streptococcus pneumoniae besiedelt symptomlos den Nasenrachenraum des Menschen, löst aber auch Infektionen wie Otitis Media und invasive Erkrankungen wie Pneumonie und Meningitis aus. Einen essentiellen Schritt für den Infektionsprozess stellt die Anheftung von S. pneumoniae an die Epithel- und Endothelzellen des Wirtes dar. Im Infektionsverlauf ist auch das nachfolgende Eindringen der pathogenen Mikroorganismen in das humane Gewebe von wichtiger Bedeutung. An dieser Interaktion zwischen Erreger und Wirtszellen sind sowohl bakterielle Virulenzfaktoren als auch Komponenten des Wirtes beteiligt. Der pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) von S. pneumoniae ist ein Fibronektin-bindendes Oberflächenprotein und ist essentiell für die Virulenz in einem Sepsis- und einem Pneumonie-Mausinfektionsmodell (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte PavA zusätzlich in einem experimentellen Maus-Meningitis-Modell als Virulenzfaktor identifiziert werden. In in vitro Infektionsstudien zeigten pavA-defiziente Pneumokokkenmutanten eine signifikant verringerte Adhärenz an und Invasion in alveoläre Epithelzellen A549 von Typ II Pneumozyten, in Larynxkarzinomzellen HEp-2, in humane Hirnendothelzellen HBMEC und in humane Nabelschnurendothelzellen HUVEC. Diese Zelllinien repräsentieren modellhaft typische Gewebezellen, mit denen S. pneumoniae während des Infektionsprozesses in Kontakt treten kann. Die signifikante Reduktion der Adhärenz der pavA-Mutante ist auf die Mutagenese des pavA-Gens zurückzuführen, da die Komplementierung mit einem aktiven pavA-Gen die Adhärenz an die humanen Zellen wiederherstellte. In Inhibitionsstudien blockierte anti-PavA-Antiserum die bakterielle Bindung an immobilisiertes Fibronektin, die über den C-terminalen Bereich des PavA-Proteins vermittelt wird. Im Gegensatz dazu wurde die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Wirtszellen in Inhibitionsstudien mit anti-PavA-Antiserum oder rekombinantem PavA-Protein nicht blockiert. Zusammenfassend ist PavA ein wichtiger Virulenzfaktor für die Infektion und das Überleben der Erreger in vivo und spielt gleichzeitig auch eine Rolle während der Adhärenz von Pneumokokken an die humanen Wirtszellen in vitro. Allerdings beeinflusst PavA den Anheftungsprozess nicht direkt als Adhäsin, sondern scheint die Funktion anderer, wichtiger, bisher unbekannter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae zu regulieren. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Interaktion von S. pneumoniae mit dem Glykoprotein Fibronektin und deren Bedeutung für die Kolonisierung und den Infektionsmechanismus in vitro untersucht. S. pneumoniae bindet direkt an immobilisiertes Fibronektin (van der Flier et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pneumokokken Fibronektin sowohl wirtsunabhängig aus dem Plasma rekrutieren als auch reines lösliches Fibronektin binden können. Dabei binden Pneumokokken sowohl die multimere, zelluläre Form des Fibronektins als auch das lösliche, dimere Plasma-Fibronektin. Die Zugabe von Fibronektin verstärkt die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Nasopharynxepithelzellen Detroit 562, die Larynxzellen HEp-2, die Bronchialepithelzellen A549 und die Hirnendothelzellen HBMEC. Die Fibronektin-vermittelte Anheftung von Pneumokokken an die Nasopharynxzellen Detroit 562 und die Hirnendothelzellen HBMEC erfolgt wahrscheinlich über die Heparin-Bindungsdomäne, da die bakterielle Adhärenz durch die Zugabe von Heparin inhibiert wird. Weitere Inhibitionsstudien zeigten, dass weder die Präinkubation der Erreger mit anti-PavA-Antiserum noch die Zugabe von rekombinantem PavA-Protein die Fibronektin-vermittelte Adhärenz an die Wirtszellen blockierte. Die Interaktion von S. pneumoniae über das Brückenmolekül Fibronektin mit den humanen Wirtszellen findet damit nicht über das Fibronektin-bindende Oberflächenprotein PavA statt. Fibronektin vermittelt nicht nur die Adhärenz von S. pneumoniae an die Wirtszellen, sondern auch deren Internalisierung. In Inhibitionsstudien mit spezifischen Inhibitoren des Aktin-Zytoskeletts und der Mikrotubuli konnte gezeigt werden, dass die Dynamik des Zytoskeletts eine essentielle Rolle für die Fibronektin-vermittelte Internalisierung der Pneumokokken in die Wirtszellen spielt. Außerdem wurde durch die Zugabe von pharmakologischen Inhibitoren der Tyrosin Kinasen, der Familie der Src-Kinasen und der Phosphatidylinositol (PI-3)-Kinase die Fibronektin-vermittelte bakterielle Invasion in humane Zellen signifikant blockiert. Die Invasion von S. pneumoniae in Mausfibroblasten, die defizient für die fokale Adhäsionskinase (FAK) waren, war im Vergleich zu der bakteriellen Invasion in die Wildtyp-Fibroblasten reduziert. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung der Src-Kinasen, der PI-3-Kinase und der FAK an der Signaltransduktion, die für die Fibronektin-vermittelte Invasion von S. pneumoniae in eukaryotische Zellen notwendig ist. / The human pathogen Streptococcus pneumoniae causes infections such as otitis media, pneumonia and meningitis. Pneumococci colonize asymptomatically the human nasopharynx. But they can migrate also to the lungs and after breaching the lung barrier spread throughout the human body and induce severe invasive diseases. Adhesion of S. pneumoniae to epithelial and endothelial host cells is an essential first step for the establishment of colonization and invasive infections. Moreover subsequent bacterial invasion into the human tissue is important for developing disease as well. Both, bacterial virulence factors and host components participate in the interaction of pneumococci and human cells. The pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) of S. pneumoniae is a fibronectin binding surface protein and a crucial virulence determinant in a sepsis and in a pneumonia mouse model of infection (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). Within this study, PavA was identified as an important factor causing disease and promoting survival in an experimental mouse meningitis model. PavA-deficient mutants of S. pneumoniae showed significantly reduced adherence and invasion into the alveolar epithelial cell type A549 of type II pneumocytes, larynx carcinoma epithelial cells HEp-2, human brain derived endothelial cells HBMEC and human umbilical vein derived endothelial cells HUVEC. These cell lines represent typical cells of the human tissue that are involved in the progression of pneumococcal infections. The adhesion level of a pavA-knockout mutant was restored by re-introducing the entire pavA gene, indicating that the observed effect was due to pavA-deficiency. In inhibition studies the addition of anti-PavA antisera inhibited pneumococcal attachment to immobilized fibronectin. Binding of fibronectin was mediated by the C-terminal part of the PavA protein. In contrast, bacterial adherence and invasion into host cells was not influenced by addition of anti-PavA antisera or recombinant PavA protein. In conclusion, PavA plays a pivotal role in pneumococcal adherence to host cells in vitro and is an important virulence factor for the progression of pneumococcal disease and survival in vivo. PavA is not directly involved in the pneumococcal adhesion process by acting as an adhesin. The results indicated that PavA affects colonization and pneumococcal survival by modulating the function of important but yet unknown virulence determinants of S. pneumoniae. In the second part of this study the interaction of S. pneumoniae with the host glycoprotein fibronectin and its role in colonization in vitro was investigated. S. pneumoniae binds directly to immobilized fibronectin (van der Flier et al., 1995). In this study is shown that pneumococci recruite fibronectin from plasma in a species-unspecific manner and bind pure soluble fibronectin. S. pneumoniae interacts with the multimeric cellular form of fibronectin as well as with the soluble dimeric plasma fibronectin. Host-cell bound fibronectin significantly enhances pneumococcal adherence to the human nasopharyngeal epithelial cell line Detroit 562, to larynx cells HEp-2, to alveolar cells A549 and to brain endothelial cells HBMEC. Fibronectin-mediated pneumococcal adherence to the nasopharyngeal cells Detroit 562 and to the brain endothelial cells HBMEC is probably mediated by the heparin binding site due to the fact that bacterial adherence is inhibited by the addition of heparin. Further inhibition studies demonstrated that neither pneumococcal preincubation with anti-PavA antisera nor addition of recombinant PavA protein inhibited fibronectin-mediated adherence. These results indicate that fibronectin-mediated adherence was not due to binding of PavA to fibronectin. Fibronectin plays a key role in pneumococcal adherence to host cells and, in addition, promotes pneumococcal internalization. Inhibition studies with specific inhibitors of the actin cytoskeleton an the microtubulis showed an essential impact of the cytoskeleton dynamic on the fibronectin-mediated pneumococcal invasion into host cells. In addition, presence of pharmacological inhibitors of tyrosine kinases, Src-kinases and Phosphatidylinositol (PI-3)-kinase significantly blocked fibronectin-mediated bacterial invasion in human cells. Pneumococcal invasion into fibroblasts deficient for the focal adhesion kinase (FAK) was reduced compared to wildtype fibroblasts. These results indicate the involvement of Src-kinases, PI-3-kinase and FAK in signal transduction leading to fibronectin-mediated internalization of S. pneumoniae in eukaryotic cells.

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are important emerging pathogens responsible for the development of diarrheal diseases, ranging from unbloody diarrhea to hemorrhagic colitis, and of life-threatening extraintestinal complications like the hemolytic-uremic syndrome. The most important virulence factors of this pathogen are the mostly phage-encoded Shiga toxins (Stx) and the factors involved in the development of so-called "attaching and effacing lesions" on gut epithelial cells. Children and the elderly are mainly affected by these infections, which often occur as outbreaks. The infections are predominantly transmitted by fecally contaminated food. The treatment of EHEC infections with some antibiotics may promote the development of extraintestinal complications. Therefore, the best way to combat this infectious agent would be the vaccination of the endangered people. Another way would be the eradication of the organism in its asymptomatic carrier animals involved in the transmission of EHEC into the human food chain. The objective of this thesis was to lay the basis for the development of a life vaccine strain for people or cattle against EHEC infections. Therefore, different strategies aiming at the attenuation of a Stx2-producing EHEC wildtype strain were followed. One strategy for the attenuation of EHEC is the direct knockout of virulence factor structural genes, like the toxin genes. Therefore, a stx2-negative mutant of the EHEC strain O157:H7 86-24 was constructed by deleting the central part of the stx2 gene cluster, leading to the fusion of the 154 N-terminal aminoacids of StxA2 with the 62 C-terminal aminoacids of StxB2. The characterisation of the mutant revealed that the toxin-converting bacteriophage was still intact, but that the fusion protein had completely lost its cytotoxic activity and that it could be detected using Stx2-specific pig antiserum. It has been concluded that the respective mutant protein had kept part of its antigenic structure and that it could potentially be used for vaccination against Stx2-specific damage. Another strategy aiming at the attenuation of EHEC-strains was the deletion of genes involved in the regulation of virulence factors in order to prevent the expression of the respective factors. Firstly, the identification and characterisation of a formerly postulated bacteriophage-encoded toxin-specific regulator which had the capability to induce the expression of a stx2-specific reporter gene after induction of the phage was attempted. A transposon-mutagenesis of the Stx2-converting phage 933W yielded a variety of phage mutants with altered expression of the reporter gene upon phage induction. Toxin production as well as the capability to produce phage particles did not correlate well with the reporter gene phenotypes. The transposon of the mutant with the lowest induction of the reporter gene was inserted into ORF L0065 located immediately upstream of the phage's int/xis genes. The cloned wildtype ORF was not able to trans-complement the transposon mutant. It was concluded that the mutant's phenotype was due to a reduced excision of the phage genome caused by a polar effect of the transposon on int/xis and therefore reduced phage induction leading to reduced reporter gene induction. Neely et al. (1998) identified the phage antiterminator Q as a possible candidate for the postulated phage-encoded stx2 regulator. The specific deletion of this general phage regulator might help to attenuate EHEC by disturbing regular phage functions. Secondly, recA-negative mutants of the EHEC-strains O157:H7 86-24 and EDL933 were examined in different mouse models as part of a project of Dr. I. Muehldorfer. It was demonstrated that the deletion of recA brought about a massive virulence loss due to a drastic reduction of toxin production, which was indirectly caused by the lack of recA. Thus, the deletion of recA attenuates pathogenic EHEC strains in the mouse model. In contrast, the deletion of recA in UPEC strain O6:K15:H31 536 did not alter the virulence of this strain. The analysis of the revealed virulence data was performed as part of this thesis. In addition, the deletion of recA is an important safety measurement for preventing the integration of foreign DNA into attenuated strains and thus, it helps preventing reversion of the vaccine to pathogenicity. Thirdly, the consequences of a deletion of the gene leuX coding for the minor Leucin specific tRNA5Leu on the expression of virulence factors in EHEC were examined by the construction and characterisation of an EHEC O157:H7 86-24 leuX-deletion mutant. In UPEC strain 536, the deletion of this tRNA lead to an attenuation of this strain due to reduced expression of diverse virulence factors. It was demonstrated that in EHEC, like in UPEC, the production of flagella and enterobactin was reduced. In addition, Hemin utilisation was impaired. The deletion of leuX also diminished the expression of various proteins of the outer and inner membrane as well as of an antigen cross-reacting with serum specific for type 1-fimbriae. In contrast, it did not influence the production of Stx2 as well as the in vivo pathogenicity of the strain in mice. Enterohaemolysis and the expression of Intimin were enhanced. Thus, it was demonstrated that the typical EHEC virulence factors were not reduced in the leuX mutant. In addition, it became obvious that the impact of leuX on the expression of the respective genes is not only based on a translational reduction due to a lack of tRNA availability but seems to involve further mechanisms. We concluded that apparently, an attenuation of EHEC is not possible by the deletion of leuX.

Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden. / Escherichia coli is one of the common causes of urinary tract infections. Pathogenic E. coli differ from non-pathogenic E. coli variants by the presence of certain virulence factors which contribute to their ability to cause disease. The uropathogenic E. coli strain 536 (O6:K15:H31) is able to produce different virulence factors such as a-hemolysin, fimbrial adhesins (P-, type 1 and S-fimbriae) and specific capsules. Furthermore the bacteria produce iron uptake systems like enterobactin and yersiniabactin and have the capacity to survive in human serum. The development of pathogenicity is connected to pathogenicity islands (PAI I536-V536). All four PAIs are associated with tRNA genes. The deletion of PAI I536 and PAI II536 results in the truncation of the associated tRNA gene and loss of virulence. The deletion of PAI II536 results in the truncation of the leuX gene. PAI II536 as well as leuX deletion mutants show a reduced production of type 1 fimbriae, flagellae and of the iron uptake system enterobactin. Furthermore, they show delayed hemolysin production and a reduced serum resistance. Additionally, the leuX-encoded tRNA5Leu may also regulate the expression of various other genes. The aim of this work was the further characterization and analysis of the role of PAI I536/II536 and of the tRNA5Leu for protein expression as well as for the regulation and expression of two site-specific recombinases, FimB and FimE, of the E. coli strain 536. Firstly, the protein expression patterns of E. coli 536 and different derivatives were studied. Differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536, its mutants 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) and strain 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With the help of preparative 2 D-gel electrophoresis 39 differentially expressed intracellular proteins could be identified. The identities of 37 proteins have been determined by MALDI-TOF mass spectrometry in Halle. Two of these proteins show no matches in sequence databases. The preparations of the culture supernatants resulted in 2 D proteinpatterns from which three protein spots whose expression is markedly altered in the different strains are identified. The influence of the tRNA5Leu on the expression of outer membrane proteins was also studied. Differences in the protein expression patterns of the wild-type strain 536 and the mutants were analyzed by one- and two-dimensional gel electrophoresis. The analysis of 2 D protein patterns of outer membrane preparation resulted in the detection of some proteinspots whose expression was altered in the different strain backgrounds. It was identified during the proteom analysis that tha expression of the YgaG protein was shown to be reduced in a leuX-negative background. This protein shows a strong homology to the LuxS protein of Vibrio harveyi. The LuxS protein is a component of the quorum sensing system. It has been shown that many bacteria express proteins similar to LuxS of V. harveyi and that quorum sensing may play a role in pathogenicity. To investigate whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli strain 536, a ygaG deletion mutant was made. In addition, differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536 and the ygaG mutant were analyzed by 2 D gel electrophoresis. Whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli Strain 536 has not be investigated. In order to get a deeper insight into the role of the tRNA5Leu as a potential regulator of the expression of the typ 1-fimbriae, a transcriptional fusion between the promotor area of fimB and fimE and the lacZ gene lacking its own promotor was constructed. However the transcription of fimB and fimE did not show any significant differences between the wild-type strain 536 and the leuX-mutant 536D102.

Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro über einen ausschließlich Mikrotubuli-abhängigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identität zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 Stämmen Invasivität. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adhäsindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Invasionsfähigkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 Stämme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. Für die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Phänotyps demonstriert. Darüber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der für die Invasivität essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut überein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 Stämmen gelang es in Westernblots, das Adhäsin FimCfH an der Bakterienoberfläche nachzuweisen. Dies konnte auch für FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 Stämmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 Stämmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli über das Adhäsin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren vermögen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli Stämmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsfähigkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adhäsintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollständig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den übrigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den übrigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim ähnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli Stämme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend für die Invasivität. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert. / Citrobacter freundii, which belong to the family of Enterobacteriaceae, are Gram-negative, motile and rod shaped bacteria. As an opportunistic pathogen they are known to be involved in urinary tract infections as well as in newborn meningitis. In vitro, the internalization of C. freundii 3009 into the endosomes of the urinary bladder epithelial cell line T24 exclusively follows a microtubule dependent mechanism. Previously, a chromosomal invasion determinant of C. freundii 3009 has been identified and cloned in plasmid pTO3. This invasion determinant shows high identity to the type 1 fimbrial gene cluster (fim) of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Interestingly, non-invasive E. coli K12 strains become invasive, when they are transformed with plasmid pTO3. In contrast, recombinant E. coli K12 strains harbouring the fim operon of either S. enterica serovar Typhimurium and E. coli, respectively, or other E. coli adhesin determinants were not invasive. In this work the genes of this chromosomal determinant, which are essential for invasiveness, were identified. This was achieved on one hand by subcloning parts of the invasion determinant of plasmid pTO3. Subsequently, the ability of the resulting plasmids to confer invasiveness to E. coli K12 strains was examined by gentamicin protection assays. Interestingly, the internalization of those recombinant E. coli K12 strains is not only inhibited by an analogue of the natural receptor of the adhesin FimCfH, namely mannose, but also by chitin hydrolysate [(GlcNAc)n]. On the other hand, mutants of wild type C. freundii 3009 were constructed by deleting the central part of this particular invasion determinant. These chromosomal deletion mutants showed a considerable lower invasion rate of the human epithelial cell line T24 in comparison to the wild type. Complementation of one of these mutants fully restored the wild type phenotype. Furthermore, it is known that C. freundii 3009 is capable to invade and replicate in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC). The results presented here demonstrate that not only C. freundii 3009 is capable to breach the blood-brain-barrier in a newborn rat animal model, but also recombinant E. coli strain HB101pPH1 which carries the chromosomal fimCf determinant. In addition to the functional analysis of the C. freundii 3009 fim determinant by performing gentamicin protection assays and mannose sensitive yeast agglutination, the expression of the corresponding gene products was shown. Proteins essential for invasion, namely FimCfA, FimCfD, FimCfF and FimCfH, were specifically radio labelled using a T7 phage expression system and their molecular weight was determined. The observed molecular weights are in agreement with the calculated ones from deduced amino acid sequences. Furthermore, the presence of the fimbrial adhesin minor subunit FimCfH on the outer surface of C. freundii 3009 as well as appropriate recombinant E. coli K12 strains was shown using Westernblot technique. Expression of the minor subunit FimCfF on the outer surface was also shown for the recombinant E. coli K12 strains using the same technique. However, electron microscopic studies of C. freundii 3009 or E. coli K12 strains harbouring the fimCf determinant indicate that FimCf protein subunits are not assembled in hair like appendages called fimbriae. Since certain type 1 fimbrial variants of E. coli are able to induce bacterial internalization by bladder epithelial cells via the adhesin FimEcH, the fimEc gene cluster from human pathogenic E. coli strains 536 (uropathogenic isolate) and IHE3034 (newborn meningitis isolate) were cloned in order to examine the role of type 1 fimbriae of these strains in invasiveness. In addition, E. coli K1 strain IHE3034 and the isogenic fim negative insertion mutant IHE3034-2 were characterized for their invasion capability. Although type 1 fimbriae are known to be an indispensable virulence factor of uropathogenic E. coli (UPEC), several clinical UPEC strains, which are incapable of expressing this particular adhesin, were isolated and identified. By performing genetic analysis, it could be demonstrated that the fimEc operon is completely deleted from the chromosome in 11 of those isolates. In another 6 isolates the presence of only the 3´-end of the gene fimECH could be found. Furthermore, an IS1 element inserted in the fim deletion was identified in these 6 strains. In the remaining 11 isolates also the DNA region adjacent to the fimEc cluster was affected by this deletion process. In conclusion, it was ascertained that in C. freundii 3009 a fim like determinant functions as an invasion system. Type 1 fimbriae of E. coli strains 536 and IHE3034 are necessary but not sufficient to confer invasiveness. Although type 1 fimbriae of uropathogenic E. coli are known to be an important virulence factor, in several clinical uropathogenic E. coli strains the fimEc operon was deleted.

Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und über das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen häufig Gene für Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate näher untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden für Gene, die für die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zusätzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen Stämmen mit Derivaten, bei denen Pathogenitätsinseln deletiert sind, bestätigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenitätsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten Stämme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die größten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms gehören und charakteristisch für das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch Änderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinflüsse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abhängige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erhöhte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberflächenprotein als Hauptfaktor für die RfaH-abhängige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verkürzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verstärkte Biofilmbildung. Vermutlich verstärkte die verbesserte Präsentation von Agn43 durch ein verkürztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberflächenstrukturen, wie die Colansäure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der Stämme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenitätsinseln waren temperaturabhängig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch phänotypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der äußeren Membran durch eine veränderte LPS-Struktur und die Expression von Adhäsinen die Biofilmbildung beeinflussen können. / Evolutionary adaptation is the driving force for the variability observed within genomes of all different Escherichia coli pathotypes. Beside the core genome, shared by all strains, also variable regions, which can be strain-specific, are scattered on the chromosome. These flexible regions mostly encode virulence factors as well as other fitness factors and are acquired through horizontal gene transfer but are also characterised by their instability. To shed a closer light on the distribution of these virulence factors among different clinical isolates, DNA-arrays were used for genome comparisons. One aim of this Ph.D. thesis was the design of a DNA-array with specific probes for typical virulence-related genes of pathogenic E. coli. With this tool in hand, the distribution of virulence genes among several E. coli isolates was analysed. In addition to virulence related genes, also differences in the core genome of well-known uropathogenic isolates of E. coli were detected using DNA-array technology. Furthermore, the core genome of different wildtype strains was compared with derivatives shown to have lost pathogenicity islands. The results confirmed the assumption that PAI deletion from core genome is a specific process and underlies a specific mechanism. The core genome itself was very conserved and the observed small differences related to genes derived from different bacteriophages. The majority of differences were detected for the flexible regions, which differ in a strain-specific manner. DNA-array technology is also a versatile tool to gain insights in changes of gene expression levels caused by gene function disorders or environmental differences. The expression profiling approach using DNA-arrays was employed in the second part of this thesis. In this work, the RfaH-related regulon was studied by transcriptome analysis. Besides the already known effect of RfaH on facilitated capsule, LPS and alpha-haemolysin expression, the focus was set on genes involved in biofilm formation. Comparison of the 536rfaH and the wildtype strain transcriptomes revealed a significant upregulation of agn43 transcript levels. In order to study the underlying mechanisms of RfaH-dependent increased biofilm formation, selected mutants of E. coli K-12 and 536 were generated and tested for their biofilm forming capacities. In MG1655rfaH we could show that Agn43 is the major factor leading to biofilm formation. In addition, this phenotype was dependent on the LPS core truncation coming along within rfaH deficient strains. In conclusion, these results demonstrated that the LPS core truncation leads to unshielding of Agn43 in this strain, thus supporting autoaggregation and biofilm formation. Other surface structures like colanic acid had no influence on this effect. Besides the expression profiles of strains E. coli 536 and 536rfaH at 37 degrees, also expression profiles at 30 degrees and in biofilms were analysed. Typical differences in either stage were characterised. In general, when comparing the expression profiles from wildtype and mutant the changes observed were very small. However, the influence of temperature and also the mode of growth (planktonic cells vs. biofilm) affected the expression profiles in both strains more severely. In conclusion, E. coli strains not only differ in their genotypes, moreover complex phenotypic differences are observable. The obtained phenotypic differences in biofilm formation were shown to be multifactorial. The phenotype was attributed to variances in the composition of the outer membrane. In this context, the influence of LPS structures and adhesin expression was pointed out.