Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Diversos mecanismos de edición génica se han implementado a lo largo de los años para mutar el genoma del virus herpes simple tipo 2 (VHS-2). Éstos se han basado principalmente en el uso de procesos de recombinación homóloga. Un mecanismo comúnmente utilizado consiste en la realización de recombinación homóloga con un sustrato de intercambio alélico (AES) directamente sobre células transfectadas con genoma viral. Otra aproximación comúnmente utilizada es el desarrollo de recombinación homóloga en bacterias transformadas con un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene el genoma completo del virus herpes simple. La progenie viral mutante es luego obtenida mediante transfección de células con este material genético modificado. Si bien se han desarrollado diversas cepas mutantes de VHS-2 utilizando estas metodologías, ambas metodologías son laboriosas y presentan problemas técnicos tanto previos como posteriores a la generación de la mutación en el genoma. Dadas estas dificultades, se ha buscado desarrollar otros mecanismos más convenientes los cuales faciliten este proceso. Una metodología relativamente reciente que permite realizar modificaciones genéticas de manera más simple es aquella conocida como la tecnología de CRISPR-Cas9. Dada la mayor facilidad y especificidad de esta técnica, comparada a las más antiguas, nos propusimos mutar mediante el sistema CRISPR-Cas9, los genes virales US6, US4 y UL53 del VHS-2 para interrumpir la síntesis de las proteínas virales gD, gG y gK, respectivamente. Si bien se lograron desarrrollar los reactivos para realizar estas mutaciones, lamentablemente no se obtuvieron los aislados mutantes deseados. Se discuten los eventuales problemas que no permitieron lograr el objetivo

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1958. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 80-85).

Les plaques amyloïdes sont l’une des principales caractéristiques pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA). Elles sont composées de peptides amyloïdes-β (Aβ) 1-40 et 1-42 fibrillaires et ont été décrites comme responsable de la réponse inflammatoire et de la neurodégénérescence. L’Herpès simplex virus 1 (HSV-1) a été impliqué comme facteur de risque de la MA et retrouvé à l’intérieur des plaques amyloïdes. Des données récentes suggèrent que les peptides Aβ possèdent une activité antimicrobienne et antivirale in vitro. La première partie des travaux décrits dans cette thèse concerne l’étude du rôle antiviral des peptides Aβ contre les virus HSV-1. Pour cela, des cellules fibroblastiques, épithéliales et neuronales ont été exposées aux peptides Aβ40 et Aβ42 et infectées avec le virus HSV-1. L’analyse quantitative par PCR a montré que les peptides Aβ40 et Aβ42 inhibent la réplication des virus HSV-1, qui possèdent une enveloppe mais n’inhibent pas l’infection par les adénovirus-5 qui n’en possèdent pas. Nos résultats ont aussi montré que les peptides interagissent directement avec les virus HSV-1 dans un modèle acellulaire et inhibent leur entrée dans les cellules. Dans une deuxième partie de l’étude, nous avons utilisé un modèle de cocultures de lignées cellulaires de neuroblastomes (H4) et microgliales (U118-MG) en tant que modèle minimal in vitro afin de déterminer si les cellules H4 produisent des peptides Aβ et si cette production induit une protection antivirale contre le virus HSV-1. Les résultats ont montré que les cellules H4 sécrètent Aβ42 en réponse à une infection par les virus HSV-1 et que les cellules U118-MG internalisent le peptide Aβ42. De plus, le peptide Aβ42 exogène induit une forte production de cytokines pro-inflammatoires mais l’infection des cellules par les virus HSV-1 n’augmente pas significativement cette production. Par ailleurs, la protection antivirale du peptide Aβ42 a été confirmée lors d’expériences de transferts impliquant des milieux de cultures conditionnés provenant de cellules H4 infectées par le virus HSV-1. Ces milieux confèrent une protection Aβ-dépendante, contre les infections par les virus HSV-1 dans des essais de nouvelles cultures de cellules H4. Dans le but de mettre en évidence le mécanisme responsable de l’effet antiviral des peptides Aβ, nous avons proposé que l’homologie de séquence entre les peptides Aβ et la région proximale transmembranaire de la glycoprotéine de fusion B (gB) du virus HSV-1 pourrait être responsable de l’interférence des peptides Aβ avec la réplication des virus HSV-1 en s’insérant dans l’enveloppe externe des virus. Cette explication a été appuyée par des expériences de FRET. Les résultats ont montré que l’interaction peptide Aβ42 et gB-GFP implique une distance de 10 nm ou moins, suggérant que le peptide Aβ42 peut s’insérer dans l’enveloppe virale. L’ensemble de nos données suggère qu’une production de peptides Aβ par les neurones pourrait les protéger lors d’une infection par les virus HSV-1 latents et, contre d’autres pathogènes. Par contre, une surproduction pourrait contribuer à la formation des plaques amyloïdes, expliquant ainsi pourquoi les infections ont un rôle dans la pathogénicité de la forme sporadique de la MA.

El objetivo del presente estudio fue conocer la prevalencia del Virus Herpes Bovino 1 (VHB-1), agente causal de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (RIB) en bovinos criollos de crianza extensiva de los distritos de Coracora, Chumpi, Puyusca y Pullo de la provincia de Parinacochas, Ayacucho. Con esta finalidad se consideraron 469 muestras de sueros bovinos procedentes de 25 hatos para la detección de anticuerpos neutralizantes mediante la prueba de neutralización viral. El 67.59 ± 4.24% (317/469) de las muestras presentaron anticuerpos neutralizantes con títulos entre 1:2 a> a 1:256. El 100% de los hatos muestreados tuvieron animales seroreactores. La prevalencia del virus fue similar en los animales de los 4 distritos estudiados. Este estudio reporta la presencia del VHB-1 en bovinos criollos de la provincia de Parinacochas, con una prevalencia superior a lo descrito en bovinos de las principales cuencas lecheras del país. / The seroprevalence of Bovine Herpes Virus-1, the causative agent of Infectious Bovine Rinotracheitis (IBR), in criollo bovines from districts of Coracora, Chumpi, Puyusca and Pullo of the Parinacochas Province, Ayacucho was carried out. Four hundred sixty nine serum samples from twenty five herds were tested by virus neutralisation test to detect neutralizing antibodies. The 67.59 ± 4.24% (317/469) of the samples had antibodies against BHV-1. The seroprevalence of the virus was similar in the animals from the 4 district studied. The antibodies titers ranged from 1:2 to> 1:256. All the sampled herds had seroreactive animals. This study report the presence of the BHV-1 in criollos bovines from Parinacochas Province, with a prevalence superior to described in dairy herds of the country.

Thesis (Ph. D.)--University of Sydney, 2005. / Title from title screen (viewed 20 May 2008). Submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy to the Faculty of Medicine. Degree awarded 2005; thesis originally submitted 2004, corrected version submitted April 2005. Includes bibliographical references. Also available in print form.

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Le virus Herpes Simplex de type 1 (HSV-1) possède un mode d'infection particulier dit bimodal. Il peut soit se répliquer de manière active lors d'une phase dite lytique soit migrer dans les neurones et rester en latence. Il peut réactiver pour rétablir une infection lytique. Une protéine virale majeure dans la réactivation de HSV-1 est ICP0. C'est une protéine nucléaire à activité E3 ubiquitine ligase, qui possède la particularité d'induire la dégradation par le protéasome de plusieurs protéines centromériques constitutives, ce qui provoque une déstabilisation du centromère interphasique. Mon équipe a découvert une réponse cellulaire à l'instabilité centromérique, induite par la protéine ICP0, et nommée iCDR (pour interphase Centromere Damage Response.). L'objectif général de ma thèse est de déterminer les modifications structurales que subissent les centromères endommagés par ICP0 à l'origine de l'iCDR et probablement de la réactivation. J'ai pu démontrer qu'ICP0 affectait toute la structure protéique étroitement associée aux centromères durant l'interphase. Suite à ces résultats, j'ai pu démontrer, par des analyses de digestion de chromatine à la nucléase microccocale (MNAse), que l'occupation nucléosomique de la chromatine centromérique suite à l'activité d'ICP0 était affectée de façon significative. Une étude in vivo effectuée à partir de tissus nerveux provenant de souris infectées de manière latente, a permis de démontrer une co-localisation entre les génomes HSV-1 latents et les centromères. Cette co-localisation est associée à une répression transcriptionnelle du virus. Les résultats de ma thèse montrent donc que les effets d'ICP0 sur la déstabilisation des centromères sont en relation avec un rôle de ces centromères durant la latence. Ceci suggère fortement une implication de la déstabilisation des centromères dans le processus de réactivation contrôlé par ICP0.

Le virus Herpes Simplex de type 1 (HSV-1) possède un mode d’infection particulier dit bimodal. Il peut soit se répliquer de manière active lors d’une phase dite lytique soit migrer dans les neurones et rester en latence. Il peut réactiver pour rétablir une infection lytique. Une protéine virale majeure dans la réactivation de HSV-1 est ICP0. C’est une protéine nucléaire à activité E3 ubiquitine ligase, qui possède la particularité d’induire la dégradation par le protéasome de plusieurs protéines centromériques constitutives, ce qui provoque une déstabilisation du centromère interphasique. Mon équipe a découvert une réponse cellulaire à l’instabilité centromérique, induite par la protéine ICP0, et nommée iCDR (pour interphase Centromere Damage Response.). L’objectif général de ma thèse est de déterminer les modifications structurales que subissent les centromères endommagés par ICP0 à l’origine de l’iCDR et probablement de la réactivation. J’ai pu démontrer qu’ICP0 affectait toute la structure protéique étroitement associée aux centromères durant l’interphase. Suite à ces résultats, j’ai pu démontrer, par des analyses de digestion de chromatine à la nucléase microccocale (MNAse), que l’occupation nucléosomique de la chromatine centromérique suite à l’activité d’ICP0 était affectée de façon significative. Une étude in vivo effectuée à partir de tissus nerveux provenant de souris infectées de manière latente, a permis de démontrer une co-localisation entre les génomes HSV-1 latents et les centromères. Cette co-localisation est associée à une répression transcriptionnelle du virus. Les résultats de ma thèse montrent donc que les effets d’ICP0 sur la déstabilisation des centromères sont en relation avec un rôle de ces centromères durant la latence. Ceci suggère fortement une implication de la déstabilisation des centromères dans le processus de réactivation contrôlé par ICP0. / The Herpes Simplex type 1 (HSV-1) virus possesses a bimodal mode of infection. It can either replicates in an active way during the lytic cycle, or it can infect neurons and stay in latency. HSV-1 reactivates from latently infected neurons for re-establishing a lytic infection. A major viral protein implicated in reactivation is ICP0. It is a nuclear E3 ubiquitin-ligase, which has the particularity to induce the proteasome-mediated degradation of several constitutive centromeric proteins. This activity severely destabilizes the interphase centromere. My team has discovered a novel cellular response triggered by the estabilization of centromeres by ICP0, called iCDR (interphase Centromere Damage Response). The general aim of my thesis is to determine the centromere structural modifications induced by ICP0 that can trigger the iCDR and probably the reactivation. I was able to demonstrate that ICP0 affected the entire proteinacious structure of interphase centromeres. Following this, I showed by micrococcal nuclease (MNase) digestion approach that the nucleosomal organization of centromeric chromatin was significantly affected by ICP0. An in vivo study in nervous tissues coming from latently infected mice enabled to show a co-localization between latent HSV-1 genomes and centromeres. This co-localisation is linked to a transcriptional repression of the virus. The results of my thesis show that the destabilization of centromere by ICP0 correlates with a role of the centromeres during latency. This strongly suggests an implication of centromere destabilization in the ICP0-controlled reactivation process.

Age stratified seroepidemiological studies play a crucial role in the design and assessment of vaccination strategies. An existing multiplex bead immunoassay for measles, mumps, rubella and varicella zoster virus antibodies together with a newly developed multiplex bead immunoassay for herpes simplex virus type 1 and type 2 antibodies were used to investigate the age-related seroepidemiology of these viruses in England during 2012.To develop the HSV-1 and HSV-2 antibody assay, attempts were made to produce full length of HSV-1 and HSV-2 glycoprotein G using a baculovirus vector expression system. While HSV-1 gG protein was produced, the proteins were extensively aggregated. Native glycoprotein G molecules undergo partial removal of HSV-1 signal sequence and HSV-1 short membrane anchor sequence during post translational modification. It is possible that such post translational modification is not performed when protein is processed in insect cell culture. Attempts to produce an HSV-2 glycoprotein G were not successful. It is possible that the high GC-content of HSV-2 glycoprotein G led to poor fidelity of copying the PCR amplification sequence. Commercially available truncated HSV-1 gG and HSV-2 gG were therefore used to develop a duplex microbead immunoassay for the simultaneous detection of specific HSV antibodies in human sera. The resultant assays performed with low sensitivity and specificity (HSV-1 of 89% and 66%, respectively and for HSV-2 of 79% and 85%, respectively) compared to the reference HerpeSelect ELISA.The MMRV multiplex bead immunoassay proved rapid, and required minimal sample volume to semi-quantify MMRV specific antibodies. The seroepidemiology of MMR results was compared with previous seroepidemiological studies performed in 1996 in England. The comparison showed an increase in the proportion of individuals who were positive for mumps and measles antibodies in the 2012 survey. The proportion of individuals positive for rubella was essentially unchanged. The increase in the proportion of individuals positive for mumps and measles antibodies in 2012 show the effectiveness of the change in MMR vaccination policy for England from 1996 onward. For VZV, the proportion of individuals who were positive for varicella antibodies between the 1996 and 2012 serological surveys were essentially unchanged. The comparison showed that most young children are susceptible to VZV. At this level of immunity, it can be expected that varicella will continue to produce epidemics of infection in the population, unless varicella vaccination is implemented as a part of routine childhood vaccination.

of thesis Diagnostics of neuroinfection caused by human herpesviruses using nucleic acid amplification methods author: MUDr. Klára Labská supervisor: doc. MUDr. Vilma Marešová, CSc. In recent years, the diagnosis of neuroinfections has undergone a shift towards molecular biology methods. Our research focused on the predictive value of the capture of herpesvirus (HV) DNA in cerebrospinal fluid. In the first study, we examined the presence of DNA neurotropic herpes viruses (HSV1, HSV2, VZV and HHV6) in cerebrospinal fluid in immunocompetent patients with laboratory-confirmed tick-borne meningoencephalitis and enterovirus meningitis and meningoencephalitis. The control group consisted of patients with proven absence of an inflammation in the cerebrospinal fluid. Patients were followed for 6 months. The course of the disease and its consequences, including laboratory tests, were compared between groups of patients with and without the presence of HV DNA. In the second study, we tried to demonstrate the presence of HSV1 DNA in cerebrospinal fluid during its symptomatic reactivation in patients with purulent meningitis. In our group of immunocompetent patients with non-purulent inflammation in the cerebrospinal fluid, the proportion of HV DNA positive patients reached 7.5% (13 out of 173), we also...