Le premier objectif a été de sélectionner des promoteurs de gènes cellulaires actifs spécifiquement dans les HCC à l'aide d'une recherche bibliographique puis en utilisant la base de donnée UniGene. Leur activité a été vérifiée par RT-qPCR et CHIP dans des lignées modèles HCC et dans des hépatocytes. Ces promoteurs ont été clonés en amont de la luciférase dans la région intergénique 20 du génome HSV-1 afin d'étudier leur force d'activité, 2 types de cinétiques et leur activité différentielle en fonction du type cellulaire et dans le contexte d'une infection virale. Le deuxième objectif a été de construire des virus oncolytiques ciblés pour l'expression de la protéine Us3, une protéine virale impliquée dans le contrôle de la réponse apoptotique induite par HSV-1. L'expression de la protéine Us3 est placée sous contrôle d'un promoteur cellulaire spécifique d'HCC. L'hypothèse est qu'en l'absence d'activité du promoteur cellulaire dans les cellules non HCC, la protéine Us3 ne sera pas synthétisée et, par conséquent, l'apoptose qui ne sera pas réprimée, inhibera le cycle de réplication et par conséquent, la production virale dans les cellules saines. Dans les cellules HCC, le promoteur actif permettra la réplication virale aboutissant à la destruction de lamasse tumorale. Un virus HSV-1 Us3- a été construit en utilisant la technique de recombinaison en plasmide BAC (Bacterial artificial chromosome), puis 2 virus oncolytiques en réintroduisant le gène Us3 sous contrôle du promoteur ANGPTL3 ou du promoteur HRE (hypoxia responsive element). Leur comportement oncolytique a été étudié en réalisant des courbes de croissance sur lignées cellulaires d'HCC et cellules hepatocyte-like.

Le premier objectif a été de sélectionner des promoteurs de gènes cellulaires actifs spécifiquement dans les HCC à l’aide d’une recherche bibliographique puis en utilisant la base de donnée UniGene. Leur activité a été vérifiée par RT-qPCR et CHIP dans des lignées modèles HCC et dans des hépatocytes. Ces promoteurs ont été clonés en amont de la luciférase dans la région intergénique 20 du génome HSV-1 afin d’étudier leur force d’activité, 2 types de cinétiques et leur activité différentielle en fonction du type cellulaire et dans le contexte d’une infection virale. Le deuxième objectif a été de construire des virus oncolytiques ciblés pour l’expression de la protéine Us3, une protéine virale impliquée dans le contrôle de la réponse apoptotique induite par HSV-1. L’expression de la protéine Us3 est placée sous contrôle d’un promoteur cellulaire spécifique d’HCC. L’hypothèse est qu’en l’absence d’activité du promoteur cellulaire dans les cellules non HCC, la protéine Us3 ne sera pas synthétisée et, par conséquent, l’apoptose qui ne sera pas réprimée, inhibera le cycle de réplication et par conséquent, la production virale dans les cellules saines. Dans les cellules HCC, le promoteur actif permettra la réplication virale aboutissant à la destruction de lamasse tumorale. Un virus HSV-1 Us3- a été construit en utilisant la technique de recombinaison en plasmide BAC (Bacterial artificial chromosome), puis 2 virus oncolytiques en réintroduisant le gène Us3 sous contrôle du promoteur ANGPTL3 ou du promoteur HRE (hypoxia responsive element). Leur comportement oncolytique a été étudié en réalisant des courbes de croissance sur lignées cellulaires d’HCC et cellules hepatocyte-like. / Our long-term purpose is to develop transcriptionally targeted oncolytic vectors, derived from herpes simplex virus type 1 (HSV-1), designed to eradicate hepatocellular carcinomas (HCC). We have identified several HCC-specific promoters, as well as other cancer-specific promoters, that maintain their specificity when expressed from the virus genome. More precisely, we have demonstrated that these promoters are able to drive reporter gene (luciferase) expression from the virus genome in HCC-derived cells, both in cultured cells and in nude mice, but not in fresh human hepatocytes or in the WRL38 hepatocyte-like cells. HSV-1 infection induces, but then inhibits, a cellular antiviral apoptotic response, and the early virus protein US3 is a key actor in inhibiting apoptosis. We have hypothesized that inhibition of US3 expression in hepatocytes should led to early apoptotic death of these cells, therefore precluding virus multiplication and spread. In contrast, expression of US3 in cancer cells is expected to block apoptosis, leading to the achievement of the virus life cycle, cell lysis, and virus spread within the tumours. We report in this communication the construction and properties of two different potentially oncolytic HSV-1 vectors. One of them expresses US3 protein under the control of the HCC-specific promoter ANGPTL3, while the second promoter contains 9 repeats of the hypoxia responsive elements of vascular-endothelial growth factor (VEGF) (9xHRE promoter). Growth curves of these viruses were performed on different HCC cell lines to show their oncolytic properties.

Dans l’approche expérimentale de l’immunothérapie des tumeurs solides, les modèles murins sont utilisés pour des raisons de rapidité et de reproductibilité. Le plus souvent, les modèles tumoraux murins sont ectopiques ce qui constitue un modèle artificiel qui ne reflète qu’une partie de la réalité biologique de tumeurs provenant de diverses origines.Mon projet de thèse a consisté à mettre au point de nouveaux modèles pré-cliniques murins permettant de mieux mimer les situations pathologiques des tumeurs solides chez l’homme. Pour cela, je me suis notamment intéressée à un modèle orthotopique de cancer du rein (implantation de cellules RenCa ou RenCa-MUC1 dans la capsule rénale) et à un modèle spontané de cancer du sein (souris MMTV-PyMT). Ces modèles ont ensuite permis l’évaluation de trois différentes approches d’immunothérapie à savoir la thérapie virale oncolytique, la vectorisation d’antigènes tumoraux au moyen d’un vecteur viral ainsi que la thérapie via un anticorps monoclonal. / In experimental approaches to immunotherapy of cancer, mouse tumor models are used for reasons of speed and reproducibility. Ectopic mouse tumor models are the most often used, but they constitute artificial models that reflect only a part of the biological reality of tumors from various origins.The aim of my thesis project was to develop new mouse preclinical tumor models to better mimic the pathological situations of solid tumors in humans. First, I developed an orthotopic model of kidney cancer (subcapsular kidney implantation of a renal carcinoma cell line which either expressed or did not express the human xeno-antigen, MUC1). In addition to this, I also studied a spontaneous model of breast cancer (MMTV-PyMT).These models enabled us to evaluate the efficacy of three different immunotherapy approaches namely oncolytic virus strategy, tumor antigen vectorization by using a viral vector, and monoclonal antibody.