The highly pathogenic Avian Influenza subtype H5N1 can lead to 100 % mortality in chickens. The main issue in prevention of H5N1 is the development of efficient poultry vaccines. Influenza haemagglutinin (HA) derived recombinant polypeptides would not elicit an immune response against internal viral proteins. Thus HA polypeptide use facilitates differentiation between infected and vaccinated animals (DIVA). Serological tests using recombinant immune-dominant proteins devoid of non-specific moieties present in whole cell preparations might have higher sensitivity and specificity. In the present study, four non-overlapping sequences of different functional domains of influenza A virus subtype H5 virus (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) designated P1, P2, P5 and rHA1 were cloned and expressed in Pichia pastoris for vaccination and diagnosis purposes. The four polypeptides were expressed successfully in P. pastoris using peptone methanol (1 % (w/v) yeast extract, 2 % (w/v) peptone, 2 % (v/v) methanol). P1, P2 and rHA1 polypeptides were purified using nickel affinity chromatography, whereas, P5 was purified using lectin affinity chromatography. Correct expression was analysed by SDS-PAGE and western blot, glycosylation analysis and MALDI-TOF.The immune responses of P1, P2 and rHA1 polypeptides were assessed in BALB/C mice. To enhance antibody response, recombinant polypeptides were mixed with the Gerbu adjuvant and injected subcutaneously. Vaccination of mice induced high subtype specific antibody titres in mice as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen) and Immunofluorescence assay (IFA) performed on Vero cells infected with H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004). The immunogenicity of P1, P2, P5 and rHA1 polypeptides was determined in commercial layer chickens. Results showed that P1, P2 and rHA1 polypeptides induced high subtype specific antibody titres in chickens as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen), IFA (performed on Vero cells infected with H5N1 A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) and microneutralization test (µNT). However, P5 polypeptide was not immunogenic in chickens. Neutralizing antibodies could be detected in chicken sera immunized with P1, P2 and rHA1 polypeptides as analyzed with microneutralization test. IgY was analysed in egg yolk of chickens immunized with recombinant polypeptides. The IgY of chicken immunized with P1 and rHA1, transferred to the egg yolk was proportional to maternal serum IgY. However, IgY could not be detected in egg yolk of chickens immunized with P2 and P5 recombinant polypeptides. The more immunogenic polypeptides P1 and rHA1 were used in an recombinant Elisa (rElisa) for detection of influenza A subtype H5 in chickens and duck sera.The optimal antigen for the concentrations of rHA1, P1 was 50 ng / well, 50 ng / well. Analysis of 25 positive sera and 25 negative sera to H5 antibodies revealed that, the sensitivity of Western blot, whole H5N1 Elisa, agar gel immunodiffusion test (AGID), P1-Elisa and rHA1-Elisa was 100 %, 100 %, 52 %, 80 % and 100 %, respectively, while the specificity was 100 %, 100 %, 100 %, 72 %, and 100 %, respectively. Moreover, duck sera, with haemagglutination inhibiting titer ranged from 4 - 8 log2, were tested positive by rHA1 Elisa compared with negative duck sera. Further analysis of 179 serum samples with rHA1-Elisa in comparison with haemagglutination inhibition (HI) and commercial Elisa proved to be highly sensitive and specific. The agreement ratio between rElisa and HI was 84.9 % and between commercial Elisa (Flock check) and HI was 76.5 %. In conclusion, P. pastoris may allow development of an effective recombinant influenza vaccine based on truncated sequences of HA that might provide broader protection against H5 influenza viruses. The possibilities to use rHA1, P1 and P5 recombinant polypeptides as a vaccine against H5 influenza should be further studied. Also our study demonstrates the potential utility of recombinant Elisa as a tool for improvement of serological diagnosis of influenza A subtype H5 in chickens and ducks. / Die hochpathogene aviäre Influenza des Subtyps H5N1 erreicht beim Ausbruch von Infektionen in Nutzgeflügelbeständen Mortalitätsraten von bis zu 100 %. Effektive und kostengünstige Impfstoffe werden benötigt, die möglichst auch eine Differenzierung zwischen geimpften Tieren und mit Wild-Virus infizierten Tieren zulassen. In diesem Zusammenhang könnten Peptid-Vakzine eine mögliche Alternative zu den herkömmlichen Impfstoffen darstellen, bei denen unter Verwendung des Vollvirus Antikörper gegen mehrere Virusproteine induziert werden. Außerdem, könnten rekombinante Antigene in serologischen Tests zur Diagnose von H5 Virus in Nutzgeflügel eingesetzt werden. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit, wurden vier verkürzte Sequenzen des Hämagglutinins (P1, P2, P5 und rHA1) von Subtyp H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) rekombinant in Pichia Pastoris exprimiert. Dazu erfolgten zunächst eine Klonierung in der Expressionsvektor pAOX und die Transformation von Pichia Pastoris. Die Expression wurde durch Methanol induziert. Der Nachweis der rekombinanten Fusionspeptiden mit C-terminalen Histidin-Tag erfolgte durch SDS-PAGE, Western Blot, Glycolysierungsanalyse, und MALDI-TOF. Der Histidin-Tag ermöglichte die Reinigung von P1, P2 und rHA1 mit Metall-Affinitätschromatographie. Polypeptid P5 hingegen wurde mittels Lectin-Affinitäts- chromatographie gereinigt. Balb/c Mäuse wurden mit Polypeptid P1, P2 bzw. rHA1, versetzt mit Gerbu Adjuvans, immunisiert. Zur Untersuchung der Immunantwort wurden die murinen Seren mittels Elisa (unter Verwendung rekombinanter Antigene oder Voll-H5N1 Antigen) sowie IFA (durchgeführt in Vero- Zellen infiziert mit A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) analysiert. Dabei wurde die präferentielle Induktion von H5-spezifischen Antikörpern detektiert. Die Immunogenität der P1, P2, P5 und rHA1-Polypeptide wurde in kommerziellen Legehennen bestimmt. Seren wurden mit ELISA, IFA, und Mikroneutralizationstest (μNT) analysiert. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die Polypeptide P1, P2 und rHA1 hohe Subtyp-spezifische Antikörpertiter in Hühnern induzierten. Im µNT konnte nur ein niedriger neutralisierender Antikörpertiter nachgewiesen werden. Das P5- Polypeptid ist bei Hühnern nicht immunogen. Im Eigelb von Hühnern, die mit den rekombinanten Polypeptiden P1 und rHA1 immunisiert wurden, konnten H5-spezifische IgY Antikörper detektiert werden. Hühner, die mit P2 und P5 immunisiert wurden, zeigten keine IgY im Eigelb. Die rekombinanten Antigene P1 und rHA1 wurden im ELISA auf ihre potenzielle Eignung für die Serodiagnostik untersucht. Die optimale Antigenkonzentration war 50 ng / well. Die serologische Analyse von 25 positiven und 25 negativen Seren auf Antikörper gegen H5 zeigte, dass Sensitivität und Spezifität von Western Blot, Voll-H5N1 ELISA und rHA1-ELISA bei jeweils 100 % lagen. Bei Agargel- Immunodiffusiontest (AGID) lagen Sensitivität und Spezifität bei 52 % und 100 %, während im P1-Elisa lediglich eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 72 % erreicht wurden. Somit eignet sich rHA1 für die Anwendung in der Serodiagnostik. Bei der serologischen Untersuchung von 175 Hühnerseren wurde eine Überbestimmung zwischen rHA1-ELISA und Hämagglutinationshemmungstest (HAI) 84.9 % festgestellt, während diese zwischen dem kommerziellen ELISA (Flock Check) und HAI 76.5 % betrug. Die Ergebnisse zeigten, dass das Expressionssystem P. pastoris als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von H5 Influenza geeignet ist. Challenge-Versuche sind nötig, um die Eignung von rekombinanten Antigenen als möglichen Impfstoff gegen H5 Influenza zu untersuchen.

Einleitung: Aviäre Influenzaviren (AIV) gehören zu den Influenza A-Viren (IAV) und sind sehr wandelbar. Die Bandbreite der Erkrankungsverläufe reicht, abhängig von Faktoren wie Virussubtyp und -stamm oder der Wirtstierart, von einer asymptomatischen Erregerausscheidung, z. B. bei Wasservögeln, über ausgeprägte respiratorische Erkrankungen bei vielen Säugern einschließlich des Menschen bis hin zu systemischen Infektionen mit Nekrosen und Entzündungen in vielen Organen und hoher Letalität, häufig bei Hühnern und Puten und in Verbindung mit hochpathogenen AIV (HPAIV). Weltweit und auch in Deutschland dauert aktuell ein AIV-Ausbruch an, sodass eine Gefährdung für die Tiergesundheit und aufgrund des zoonotischen Potenzials auch für den Menschen besteht. Im Gegensatz zu galliformen Spezies steht bei anderen Vogelarten und insbesondere Säugern die Virulenz nicht in besonders enger Verbindung mit dem Vorhandensein einer polybasischen Spaltstelle des Hämagglutinins (HA), wobei die pathogenetische Grundlage dieser Virulenzunterschiede bisher wenig erforscht ist. Die vorliegende Arbeit ist Teil einer größeren tierexperimentellen Versuchsreihe zur näheren Charakterisierung von virulenzdeterminierenden Regionen des AIV-Genoms, insbesondere von Variationen in der Spaltstelle des HA und des Nichtstrukturproteins 1 (NS1), hinsichtlich ihres Einflusses auf Pathogenität, Virulenz und Gewebetropismus. Ziele der Untersuchungen: Die übergreifende Hypothese der Studien war, dass neben der Variation der Spaltstelle des HA weitere, im Genom der IAV kodierte Virulenzdeterminanten existieren, deren Auswirkungen tierartspezifisch unterschiedlich ausgeprägt sind. Ziel der ersten Studie war die Etablierung eines semiquantitativen Scoringsystems für die wichtigsten histopathologischen Veränderungen sowie die Verteilung des Virusantigens in verschiedenen Organen. Ziel der zweiten Studie war die Automatisierung der Messung des Virusantigens, um die Untersuchung einer höheren Probenzahl zu ermöglichen sowie einen schnellen Überblick über die jeweiligen Zielorgane zu erhalten. Ein weiteres Ziel aller vier vorgestellten Studien war die Anwendung der Methoden zur Untersuchung des Einflusses genetischer Variationen, insbesondere der Spaltstelle des HA sowie des NS1, auf den Gewebetropismus und den Grad der Läsionen in experimentellen Infektionen bei Hühnern, Puten und Enten. Tiere, Material und Methoden: In allen Studien wurden Gewebeproben verwendet, die aus verschiedenen, am Friedrich-Loeffler-Institut (Greifswald-Insel Riems) durchgeführten Infektionsexperimenten stammen. Gruppen von Hühnern, Puten und Enten wurden zur Untersuchung unterschiedlicher Fragestellungen mit einer Vielzahl an teilweise genetisch modifizierten AIV oculonasal oder intravenös infiziert: Insbesondere wurden H4-Viren mit Reassortment mit H5N1-Viren, H5N1-, H5N8- und H7N7-Wildtypviren, H9N2-Viren mit modifizierter HA-Spaltstelle sowie H7N1-Viren mit variabler Länge der C-terminalen Effektordomäne des NS1 näher betrachtet. Von einem Teil der infizierten Tiere wurde jeweils ein breites Organspektrum histopathologisch und immunhistochemisch untersucht. Zur Etablierung der semiquantitativen und quantitativen Untersuchungsmethoden sowie zur Analyse der Ergebnisse wurden die verfügbaren Gruppen aufgrund ihrer oft geringen Größe (2 bis 10 histopathologisch und immunhistochemisch untersuchte Tiere pro Gruppe) unter Berücksichtigung der jeweiligen Fragestellung teils zusammenfassend analysiert, wobei zum Teil auch Daten aus vorangegangenen Experimenten reevaluiert und miteinbezogen wurden. Ergebnisse der semiquantitativen Analysen aus verschiedenen Experimenten wurden mittels Kruskal-Wallis- und Mann-Whitney-U-Tests und die quantitativen Daten mittels Mann-Whitney-U- und Friedman-Tests miteinander verglichen sowie Spearman- und Pearson-Korrelationsanalysen durchgeführt. Ergebnisse: Es wurde ein semiquantitatives Scoringsystem zur Erfassung nekrotisierender Läsionen sowie der Virusverteilung in Parenchym- und Endothelzellen etabliert. Bei Anwendung dieses Systems zeigten sich teils signifikante, oft durch genetische Variationen in Virulenzfaktoren bedingte Unterschiede. So waren mit H7N7 HPAIV assoziierte, nekrotisierende Läsionen bei Puten größtenteils stärker ausgeprägt als bei Hühnern. Bei Hühnern zeigte sich zusätzlich ein Endotheltropismus. Dagegen fanden sich bei mit demselben Virus infizierten Enten keine nekrotisierenden Läsionen und kein Virusantigen. H9N2-Viren mit Variationen in der Spaltstelle des HA unterschieden sich insbesondere in der Schwere der klinischen Erkrankung bei Puten sowie im Verhalten in zellkulturbasierten Analysen. Bei einer Infektion von Puten mit H7N1-Viren, die eine variable Länge des NS1 aufwiesen, fand sich für die untersuchten Varianten eine systemische Streuung des Virusantigens mit Nekrosen bzw. nekrotisierender Entzündung und einer Depletion der lymphatischen Organe in ähnlicher Ausprägung. Auch bei weiteren Untersuchungen, z. B. bezüglich des Schweregrads der klinischen Erkrankung sowie der Virusreplikation, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Zudem wurde eine automatisierte Organauswahl sowie eine anschließende schwellenwertbasierte Messung des Virusantigens für sechs verschiedene Organe entwickelt. Auch hier fanden sich teils signifikante Unterschiede hinsichtlich des Gewebetropismus im Zusammenhang mit dem Infektionsweg. Die Ergebnisse der semiquantitativen und der quantitativen Untersuchungsmethoden zeigten eine signifikante positive Korrelation sowohl untereinander als auch jeweils mit Daten aus einer quantitativen reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Schlussfolgerungen: Die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden wurden validiert und zeigten eine Korrelation mit bisher verwendeten Untersuchungsmethoden sowie eine breite Anwendbarkeit, wenngleich eine Erprobung und Etablierung an einer größeren Probenzahl und Gruppengröße der Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein sollte. In den vorgestellten Studien konnte gezeigt werden, dass die polybasische Spaltstelle des HA die wichtigste Determinante für die Virulenz und den Endotheltropismus von H7N7 HPAIV bei Hühnern darstellt, jedoch nicht alle vorhandenen Virulenzunterschiede bei Puten und Enten erklären kann. Zudem weist die untersuchte genetische Variation der Spaltstelle des HA von H9N2 einen quantitativen Effekt auf die Virulenz in Puten auf. Die C-terminale Effektordomäne des NS1 scheint bei Puten hingegen keine wesentliche Rolle für die Virulenz und den Gewebetropismus zu spielen. Auch andere Faktoren wie der Infektionsweg können einen Einfluss auf die Virusverteilung nehmen. Wenngleich in diagnostischen Einzelfällen aufgrund der inhärenten Variabilität der Immunhistochemie eine qualitative Untersuchung das Mittel der Wahl bleibt, weisen die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden aufgrund ihrer studienübergreifenden Anwendbarkeit sowie ihrer biometrischen Auswertbarkeit entscheidende Vorteile für den Einsatz im experimentellen Bereich auf.

The highly pathogenic Avian Influenza subtype H5N1 can lead to 100 % mortality in chickens. The main issue in prevention of H5N1 is the development of efficient poultry vaccines. Influenza haemagglutinin (HA) derived recombinant polypeptides would not elicit an immune response against internal viral proteins. Thus HA polypeptide use facilitates differentiation between infected and vaccinated animals (DIVA). Serological tests using recombinant immune-dominant proteins devoid of non-specific moieties present in whole cell preparations might have higher sensitivity and specificity. In the present study, four non-overlapping sequences of different functional domains of influenza A virus subtype H5 virus (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) designated P1, P2, P5 and rHA1 were cloned and expressed in Pichia pastoris for vaccination and diagnosis purposes. The four polypeptides were expressed successfully in P. pastoris using peptone methanol (1 % (w/v) yeast extract, 2 % (w/v) peptone, 2 % (v/v) methanol). P1, P2 and rHA1 polypeptides were purified using nickel affinity chromatography, whereas, P5 was purified using lectin affinity chromatography. Correct expression was analysed by SDS-PAGE and western blot, glycosylation analysis and MALDI-TOF.The immune responses of P1, P2 and rHA1 polypeptides were assessed in BALB/C mice. To enhance antibody response, recombinant polypeptides were mixed with the Gerbu adjuvant and injected subcutaneously. Vaccination of mice induced high subtype specific antibody titres in mice as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen) and Immunofluorescence assay (IFA) performed on Vero cells infected with H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004). The immunogenicity of P1, P2, P5 and rHA1 polypeptides was determined in commercial layer chickens. Results showed that P1, P2 and rHA1 polypeptides induced high subtype specific antibody titres in chickens as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen), IFA (performed on Vero cells infected with H5N1 A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) and microneutralization test (µNT). However, P5 polypeptide was not immunogenic in chickens. Neutralizing antibodies could be detected in chicken sera immunized with P1, P2 and rHA1 polypeptides as analyzed with microneutralization test. IgY was analysed in egg yolk of chickens immunized with recombinant polypeptides. The IgY of chicken immunized with P1 and rHA1, transferred to the egg yolk was proportional to maternal serum IgY. However, IgY could not be detected in egg yolk of chickens immunized with P2 and P5 recombinant polypeptides. The more immunogenic polypeptides P1 and rHA1 were used in an recombinant Elisa (rElisa) for detection of influenza A subtype H5 in chickens and duck sera.The optimal antigen for the concentrations of rHA1, P1 was 50 ng / well, 50 ng / well. Analysis of 25 positive sera and 25 negative sera to H5 antibodies revealed that, the sensitivity of Western blot, whole H5N1 Elisa, agar gel immunodiffusion test (AGID), P1-Elisa and rHA1-Elisa was 100 %, 100 %, 52 %, 80 % and 100 %, respectively, while the specificity was 100 %, 100 %, 100 %, 72 %, and 100 %, respectively. Moreover, duck sera, with haemagglutination inhibiting titer ranged from 4 - 8 log2, were tested positive by rHA1 Elisa compared with negative duck sera. Further analysis of 179 serum samples with rHA1-Elisa in comparison with haemagglutination inhibition (HI) and commercial Elisa proved to be highly sensitive and specific. The agreement ratio between rElisa and HI was 84.9 % and between commercial Elisa (Flock check) and HI was 76.5 %. In conclusion, P. pastoris may allow development of an effective recombinant influenza vaccine based on truncated sequences of HA that might provide broader protection against H5 influenza viruses. The possibilities to use rHA1, P1 and P5 recombinant polypeptides as a vaccine against H5 influenza should be further studied. Also our study demonstrates the potential utility of recombinant Elisa as a tool for improvement of serological diagnosis of influenza A subtype H5 in chickens and ducks. / Die hochpathogene aviäre Influenza des Subtyps H5N1 erreicht beim Ausbruch von Infektionen in Nutzgeflügelbeständen Mortalitätsraten von bis zu 100 %. Effektive und kostengünstige Impfstoffe werden benötigt, die möglichst auch eine Differenzierung zwischen geimpften Tieren und mit Wild-Virus infizierten Tieren zulassen. In diesem Zusammenhang könnten Peptid-Vakzine eine mögliche Alternative zu den herkömmlichen Impfstoffen darstellen, bei denen unter Verwendung des Vollvirus Antikörper gegen mehrere Virusproteine induziert werden. Außerdem, könnten rekombinante Antigene in serologischen Tests zur Diagnose von H5 Virus in Nutzgeflügel eingesetzt werden. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit, wurden vier verkürzte Sequenzen des Hämagglutinins (P1, P2, P5 und rHA1) von Subtyp H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) rekombinant in Pichia Pastoris exprimiert. Dazu erfolgten zunächst eine Klonierung in der Expressionsvektor pAOX und die Transformation von Pichia Pastoris. Die Expression wurde durch Methanol induziert. Der Nachweis der rekombinanten Fusionspeptiden mit C-terminalen Histidin-Tag erfolgte durch SDS-PAGE, Western Blot, Glycolysierungsanalyse, und MALDI-TOF. Der Histidin-Tag ermöglichte die Reinigung von P1, P2 und rHA1 mit Metall-Affinitätschromatographie. Polypeptid P5 hingegen wurde mittels Lectin-Affinitäts- chromatographie gereinigt. Balb/c Mäuse wurden mit Polypeptid P1, P2 bzw. rHA1, versetzt mit Gerbu Adjuvans, immunisiert. Zur Untersuchung der Immunantwort wurden die murinen Seren mittels Elisa (unter Verwendung rekombinanter Antigene oder Voll-H5N1 Antigen) sowie IFA (durchgeführt in Vero- Zellen infiziert mit A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) analysiert. Dabei wurde die präferentielle Induktion von H5-spezifischen Antikörpern detektiert. Die Immunogenität der P1, P2, P5 und rHA1-Polypeptide wurde in kommerziellen Legehennen bestimmt. Seren wurden mit ELISA, IFA, und Mikroneutralizationstest (μNT) analysiert. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die Polypeptide P1, P2 und rHA1 hohe Subtyp-spezifische Antikörpertiter in Hühnern induzierten. Im µNT konnte nur ein niedriger neutralisierender Antikörpertiter nachgewiesen werden. Das P5- Polypeptid ist bei Hühnern nicht immunogen. Im Eigelb von Hühnern, die mit den rekombinanten Polypeptiden P1 und rHA1 immunisiert wurden, konnten H5-spezifische IgY Antikörper detektiert werden. Hühner, die mit P2 und P5 immunisiert wurden, zeigten keine IgY im Eigelb. Die rekombinanten Antigene P1 und rHA1 wurden im ELISA auf ihre potenzielle Eignung für die Serodiagnostik untersucht. Die optimale Antigenkonzentration war 50 ng / well. Die serologische Analyse von 25 positiven und 25 negativen Seren auf Antikörper gegen H5 zeigte, dass Sensitivität und Spezifität von Western Blot, Voll-H5N1 ELISA und rHA1-ELISA bei jeweils 100 % lagen. Bei Agargel- Immunodiffusiontest (AGID) lagen Sensitivität und Spezifität bei 52 % und 100 %, während im P1-Elisa lediglich eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 72 % erreicht wurden. Somit eignet sich rHA1 für die Anwendung in der Serodiagnostik. Bei der serologischen Untersuchung von 175 Hühnerseren wurde eine Überbestimmung zwischen rHA1-ELISA und Hämagglutinationshemmungstest (HAI) 84.9 % festgestellt, während diese zwischen dem kommerziellen ELISA (Flock Check) und HAI 76.5 % betrug. Die Ergebnisse zeigten, dass das Expressionssystem P. pastoris als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von H5 Influenza geeignet ist. Challenge-Versuche sind nötig, um die Eignung von rekombinanten Antigenen als möglichen Impfstoff gegen H5 Influenza zu untersuchen.