Chlamydien durch die Modulation spezifischer Wirtszellproteine verschiedene Wege der Apoptose verhindern können. Mcl-1 und cIAP-2 erwiesen sich als bedeutende Faktoren, die durch die Infektion hochreguliert und absolut notwendig für die Inhibierung der Apoptose durch Chlamydien waren. Hochregulation der Mcl-1 Expression führte zu einem Block im apoptotischen Weg oberhalb der Mitochondrien. cIAP-2 zusammen mit anderen Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAP) verhinderten die Aktivierung von Caspase-3, denfinalen Schritt in der apoptotischen Kaskade. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Aktivierung des MAPKinase-Signalweges durch die Infektion wichtig war für die Hochregulierung von Mcl-1 und cIAP-2. Ein Hochdurchsatz-Screen wurde durchgeführt, um andere Wirtszellfaktoren, die für die Apoptoseinhibierung durch die Chlamydien verantwortlich sind, zu identifizieren. Neben Mcl-1 waren die identifizierten Faktoren hauptsächlich Mitglieder des MAPKinase-Signalweges. Dabei wurde deren Rolle für die Apoptoseresistenz bestätigt. Eine weiterführende Analyse der im Screen ermittelten Faktoren identifizierte eine Funktion von HIF-1a bei der Modulation der Expression anti-apoptotischer Faktoren während der Infektion. Es wurde beobachtet, dass HIF-1a stabilisiert und zum Nukleus transloziert wird. Es ist bekannt, dass HIF-1a HIF-1a im Nukleus binden kann, um den funktionalen Transkriptionsfaktor HIF zu bilden. Dieser reguliert die Expression verschiedener Überlebensfaktoren, unter anderem Mcl-1. HIF-1a Knockdown inhibierte die Chlamydien-induzierte Hochregulation von Mcl-1 mRNA-Expression. / chlamydial infection blocked the apoptotic pathway at multiple levels by modulation of specific host cell proteins. Mcl-1 and cIAP-2 were two most prominent factors that were up-regulated during the infection, and absolutely required for apoptosis inhibition. Increased expression of Mcl-1 led to a block in the apoptotic pathway upstream of the mitochondria. cIAP-2, together with other inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), blocked the activation of caspase-3 at the final step of the apoptosis cascade. Further, it was observed that the activation of the MAPK pathways during infection was needed for the up-regulation of Mcl-1 and cIAP-2. A high throughput RNAi screen was performed to identify other host factors required for the apoptosis resistance during the infection. Besides Mcl-1, the targets from the screen prominently included members of the MAPK pathways, confirming their role in the apoptosis resistance. Pathway analysis of the targets identified the role of HIF-1a in modulating the expression of the anti-apoptotic factors during infection. It was observed that during infection, HIF-1a gets stabilized and translocates to the nucleus. It is known that HIF-1a can bind to HIF-1a in the nucleus to form the functional transcription factor HIF, which can regulate the expression of survival factors like Mcl-1. This was seen to be the case, because knock down of HIF-1a abrogated the infection induced up-regulation of Mcl-1 at the mRNA levels.

Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazellulär lebendes Bakterium. Es wird mit einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht. Das Überleben von Chlamydia trachomatis hängt in nahezu allen Aspekten von der Wirtszelle ab, angefangen bei der Anheftung an die Wirtszelle, über die Invasion, bis zur intrazellulären Replikation. Für ein vollständiges Bild der Pathogenese sind sowohl das Verstehen der dazu beitragenden bakteriellen wie auch Wirtszellfaktoren essenziell. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich dabei auf die an der Infektion beteiligten Wirtsfaktoren. Mit Hilfe eines RNA-Interferenz-vermittelten Funktionsverlustscreens wurden 59 Wirtszellgene identifiziert, die einen Einfluss auf die Infektion und Vermehrung von Chlamydia trachomatis hatten. Unter Zuhilfenahme von bioinformatischen Signaltransduktionsweganalyse-Programmen konnten einige der Hits bekannten zellulären Signalnetzwerken, unter anderem dem Ras/Raf/Mek/Erk-Signalweg, zugeordnet werden. Insbesondere der Funktionsverlust zweier validierter Targets, Ras und Raf1, erhöhte das Chlamydien-Wachstum und deren Vermehrung. Bisher wurde angenommen, dass die bei der Chlamydien-Infektion beobachtete Aktivierung der Kinase Erk, die mit der Aktivierung der Phospholipase cPLA2, der Induktion des Interleukins 8 sowie der Stabilisierung des antiapoptotischen Faktors Mcl-1 in Verbindung steht, über den Ras/Raf/Mek-Signalweg vermittelt wird. Ich konnte jedoch zeigen, dass die Chlamydien-induzierte Erk-Aktivierung unabhängig von Ras und Raf1 stattfindet. Vielmehr wird während der Chlamydien-Infektion, Raf1, abhängig von der Kinase Akt, durch Phosphorylierung an Serin259 inaktiviert. Zudem wird das inaktivierte Raf1 zur bakteriellen Inklusion rekrutiert. Dies lässt vermuten, dass das Überleben derChlamydien und deren Wachstum nicht nur von der Erk-Aktivierung und dessen Substrate, sondern auch von der Inaktivierung von Raf1 und dessen Rekrutierung zur Inklusion abhängt. / Chlamydia trachomatis is a Gram-negative obligate intracellular bacterial pathogen with a major impact on human health. As an obligate intracellular pathogen, Chlamydia rely on host cell for all aspects of their survival. Here we present RNAi screen that identified 59 host cell genes influencing C. trachomatis infection and infectivity. Network analysis of hits revealed several prominent signaling networks, including Ras-Raf-MEK-ERK pathway. Knockdown of Ras and Raf1 components of the aforesaid pathway led to increased Chlamydial growth and survival. In Chlamydia infections, ERK activation is believed to be activated through upstream kinases Ras-Raf-MEK and involved in activation of cPLA2, induction of IL8 and stabilization of the anti-apoptotic Mcl-1. However, I could show that ERK activation after Chlamydia infection is independent of Ras and Raf1. Moreover, I also showed that Raf1 is inactivated by phosphorylation at Ser259 in an Akt dependent manner. Consequently, the Ser259 phosphorylated Raf1 was recruited to the Chlamydia inclusion in an Akt and 14-3-3β dependent manner. This strongly suggests that Chlamydia survival and replication in the host cell depends not only on the activation of ERK and its downstream targets such as cPLA2, but also on the inactivation of Raf1 by phosphorylation and recruitment to the inclusion.

Wie auch andere bakterielle Pathogene überträgt C. trachomatis Effektorproteine in die Wirtszelle, um deren Funktionen zu manipulieren. Das während der Invasion sekretierte Effektorprotein Tarp besitzt N-terminale SH2-Bindungsstellen und eine C-terminale SH3-Bindungsstelle für die Interaktion mit Wirtszellproteinen. Zur Bestimmung dieser Interaktionen wurden Protein-Microarrays mit nahezu alle humanen SH2- und SH3-Domänen verwendet. Zahlreiche neue Interaktionen wurden detektiert, wobei das Adaptorprotein SHC1 eine der stärksten SH2-abhängigen Interaktionen mit Tarp zeigte. Mittels Transkriptionsanalyse SHC1-abhängiger Genregulation während der Infektion konnten Gene identifiziert werden, welche an der Apoptose- und Zellwachstumskontrolle beteiligt sind. Infizierte Wirtszellen mit SHC1-Knockdown wiesen eine erhöhte Apoptoserate nach Stimulation mit TNF-alpha auf. Diese Ergebnisse offenbaren eine wichtige Rolle von SHC1 im Kontext des frühen, Chlamydien-induzierten Wirtszellüberlebens und deuten darauf hin, dass Tarp als vielseitige Signaltransduktionsplattform dient. Um Wirtszelllipide aufzunehmen, nutzt C. trachomatis Transportrouten der Wirtszelle und modifiziert Lipide bei der Aufnahme. Zur Bestimmung der Lipidzusammensetzung der Wirtszelle wurde diese mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Dabei hatte die Infektion den stärksten Einfluss auf Phosphatidylinoslitol (PI)- und Cardiolipin (CL)-Spezies. Des Weiteren konnten im Infektionsverlauf PI- und CL-Spezies mit einem Massenunterschied von 14 Da detektiert werden, was auf verzweigtkettige Fettsäurereste chlamydialen Ursprungs und eine Beteiligung der cytosolischen Phospholipase A2 (cPLA2) hindeutet. Entsprechend zeigten infizierte Zellen mit einem Knockdown von cPLA2 oder der Cardiolipinsynthase 1 eine signifikant reduzierte Bildung infektiöser Bakterien. Dies unterstreicht die Bedeutung von CL und einer funktionellen Nährstoffversorgung für die erfolgreiche Vermehrung von C. trachomatis. / Like many bacterial pathogens, C. trachomatis translocates effector proteins into the host cell to manipulate host cell functions. The early phase effector protein Tarp harbors N-terminal SH2 binding sites and a C-terminal SH3 binding site for the interaction with host cell proteins. To assess these interactions, protein microarrays comprising virtually all human SH2 and SH3 domains were used. Numerous novel interactions were discovered, while the adaptor protein SHC1 was among Tarp’s strongest SH2-dependent interaction partners. Transcriptome analysis of SHC1-dependent gene regulation during infection indicated that SHC1 regulates apoptosis- and growth-related genes. SHC1 knockdown sensitized infected host cells to TNF-alpha-induced apoptosis. These findings reveal a critical role for SHC1 in early Chlamydia-induced cell survival and suggest that Tarp functions as an important multivalent signaling hub. To acquire host-derived lipids, C. trachomatis hijacks cellular trafficking pathways and modifies lipids during the acquisition. To assess infection-dependent changes of the host cell lipid composition, cells were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Phosphatidylinositol (PI) and cardiolipin (CL) levels were most prominently influenced by C. trachomatis infection. Furthermore, PI and CL species with a 14 Da mass difference were detected during the course of infection, indicating the presence of Chlamydia-derived branched chain fatty acids and a role of cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) in this process. Accordingly, infection of cPLA2 or cardiolipin synthase 1 knockdown cells resulted in a significantly reduced formation of infectious particles. These data demonstrate the importance of cardiolipin and a functional nutrient supply for the successful propagation of C. trachomatis.