Chlamydien haben ein breites Wirtsspektrum und können vielfältige Krankheitssymptome hervorrufen. Obwohl übereinstimmend angenommen wird, dass Chlamydien Fruchtbarkeitsstörungen bei der Sau verursachen, sind zahlreiche Fragen ungeklärt. So ist bisher unbekannt, ob Chlamydien die Eileiter des Schweines besiedeln und krankhafte Veränderungen hervorrufen können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Eileiter reproduktionsgestörter Sauen auf Chlamydien zu untersuchen und deren mögliche Bedeutung als Infertilitätsursache zu eruieren. Zeitgleich wurden auch Uteri beprobt und diversen differenzialdiagnostisch relevanten Analysen unterzogen. Letztlich sollte durch die Bestimmung von Zearalenon in der Galle das differenzialdiagnostische Spektrum vervollständigt werden. Insgesamt wurden die Genitalorgane von 42 reproduktionsgestörten Sauen (Jungsauen: n=14; Altsauen: n=28; wiederholte Umrausche) aus drei Betrieben auf Chlamydien untersucht. Bei 20 Sauen (Gruppe 1) wurden ein Eileiter und der Uterus, bei weiteren 22 Sauen (Gruppe 2) Ampulle, Isthmus und uterotubale Verbindung beider Eileiter und der Uterus untersucht. Genitalien acht tragender Sauen dienten als Kontrollen. Zum Nachweis von Chlamydien kamen ein kommerzieller IFT (Chlamydia Direct IF Identification) und eine nested PCR (Nachweis des MOMP) mit anschließender Sequenzierung positiver PCR-Produkte zur Anwendung. Eileiter bzw. Eileitersegmente und Uteri wurden histologisch, Uteri fortpflanzungsgestörter Sauen zudem bakteriologisch untersucht. Bei 27 Sauen erfolgte eine Bestimmung von Gesamt-Zearalenon mittels HPLC in der Gallenflüssigkeit. Die IFT- und PCR-Ergebnisse differierten erheblich. Mit dem IFT wurden wesentlich mehr positive Ergebnisse als mit der PCR generiert. Bei 30 (60 %) der insgesamt 50 untersuchten Sauen wurden Chlamydien mittels PCR nachgewiesen. In Gruppe I waren 6 (30 %) der Uteri und 7 (35 %) der Eileiter Chlamydia-positiv, während in der Gruppe II 8 (36,4 %) der Uteri und 12 (54,5 %) der Eileiter als positiv befundet wurden. Tragende Tiere wiesen jeweils 3 (37,5 %) Chlamydia-positive Uteri und Eileiter auf. Nur in einem Fall (12,8 %) konnten Chlamydien ausschließlich im Eileiter detektiert werden. Chlamydien wurden uni- oder bilateral in einem oder mehreren Eileitersegmenten ohne oder mit zeitgleicher Besiedlung des Uterus nachgewiesen. Insgesamt wurden 41 spezifische PCR-Amplifikate aus Eileitersegmenten und Uteri von 26 reproduktionsgestörten Tieren der Gruppen I und II und 4 trächtigen Sauen sequenziert. Am häufigsten wurden Chlamydophila psittaci (n = 24) und Chlamydia suis (n = 10) detektiert. Seltener waren Chlamydophila abortus (n = 4) und Chlamydia trachomatis (n = 3) festzustellen. Insgesamt wiesen 34 (89,5 %) von 38 histologisch untersuchten Uteri entzündliche Veränderungen auf, die zu 94,1 % (n=32) chronisch waren. Entzündliche Infiltrationen mit Immunzellen wurden sowohl in Ampullen (47,9 %) als auch Isthmen (22,9 %) der Eileiter beobachtet. Die Uteri enthielten überwiegend zeitgleich mehrerer Bakterien, die als fakultativ bis obligat pathogen zu beurteilen waren. E. coli dominierte (78,0%). 21 (77,8 %) Sauen wiesen ≥ 50 ng/ml Gesamtzearalenon auf und wurden als positiv bewertet. Es bestanden keine Zusammenhänge zwischen den Chlamydienbefunden und Ergebnissen der übrigen Untersuchungen. Es ist zu schlussfolgern, dass Chlamydien unterschiedlichster Spezies Uterus und Eileiter kolonialisieren. Sie sind in der Schweinepopulation vermutlich weit verbreitet. Da auch tragende Sauen Chlamydien im Genitale enthielten, muss eine Infektion nicht zwangsläufig eine In- bzw. Subfertilität verursachen, noch für zu identifizierende Faktoren vermutlich prädisponierend wirken. Chronische Entzündungen der Uteri sind ähnlich häufig wie entzündlich veränderte Eileiter zu beobachten. Eine direkte Assoziation zwischen genitaler Entzündung und Infektion mit Chlamydien war nicht nachweisbar. Entzündungen von Eileiter und Uterus sind als Sterilitätsursache vermutlich bedeutend. Ob Chlamydien strukturelle und/oder funktionelle Eileiter- und Uterusveränderungen verursachen können, bleibt ebenso wie die Risiken für den Menschen abzuklären, die durch potenziell zoonotische Chlamydien wie Chlamydophila abortus entstehen können.

Chlamydien haben ein breites Wirtsspektrum und können vielfältige Krankheitssymptome hervorrufen. Obwohl übereinstimmend angenommen wird, dass Chlamydien Fruchtbarkeitsstörungen bei der Sau verursachen, sind zahlreiche Fragen ungeklärt. So ist bisher unbekannt, ob Chlamydien die Eileiter des Schweines besiedeln und krankhafte Veränderungen hervorrufen können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Eileiter reproduktionsgestörter Sauen auf Chlamydien zu untersuchen und deren mögliche Bedeutung als Infertilitätsursache zu eruieren. Zeitgleich wurden auch Uteri beprobt und diversen differenzialdiagnostisch relevanten Analysen unterzogen. Letztlich sollte durch die Bestimmung von Zearalenon in der Galle das differenzialdiagnostische Spektrum vervollständigt werden. Insgesamt wurden die Genitalorgane von 42 reproduktionsgestörten Sauen (Jungsauen: n=14; Altsauen: n=28; wiederholte Umrausche) aus drei Betrieben auf Chlamydien untersucht. Bei 20 Sauen (Gruppe 1) wurden ein Eileiter und der Uterus, bei weiteren 22 Sauen (Gruppe 2) Ampulle, Isthmus und uterotubale Verbindung beider Eileiter und der Uterus untersucht. Genitalien acht tragender Sauen dienten als Kontrollen. Zum Nachweis von Chlamydien kamen ein kommerzieller IFT (Chlamydia Direct IF Identification) und eine nested PCR (Nachweis des MOMP) mit anschließender Sequenzierung positiver PCR-Produkte zur Anwendung. Eileiter bzw. Eileitersegmente und Uteri wurden histologisch, Uteri fortpflanzungsgestörter Sauen zudem bakteriologisch untersucht. Bei 27 Sauen erfolgte eine Bestimmung von Gesamt-Zearalenon mittels HPLC in der Gallenflüssigkeit. Die IFT- und PCR-Ergebnisse differierten erheblich. Mit dem IFT wurden wesentlich mehr positive Ergebnisse als mit der PCR generiert. Bei 30 (60 %) der insgesamt 50 untersuchten Sauen wurden Chlamydien mittels PCR nachgewiesen. In Gruppe I waren 6 (30 %) der Uteri und 7 (35 %) der Eileiter Chlamydia-positiv, während in der Gruppe II 8 (36,4 %) der Uteri und 12 (54,5 %) der Eileiter als positiv befundet wurden. Tragende Tiere wiesen jeweils 3 (37,5 %) Chlamydia-positive Uteri und Eileiter auf. Nur in einem Fall (12,8 %) konnten Chlamydien ausschließlich im Eileiter detektiert werden. Chlamydien wurden uni- oder bilateral in einem oder mehreren Eileitersegmenten ohne oder mit zeitgleicher Besiedlung des Uterus nachgewiesen. Insgesamt wurden 41 spezifische PCR-Amplifikate aus Eileitersegmenten und Uteri von 26 reproduktionsgestörten Tieren der Gruppen I und II und 4 trächtigen Sauen sequenziert. Am häufigsten wurden Chlamydophila psittaci (n = 24) und Chlamydia suis (n = 10) detektiert. Seltener waren Chlamydophila abortus (n = 4) und Chlamydia trachomatis (n = 3) festzustellen. Insgesamt wiesen 34 (89,5 %) von 38 histologisch untersuchten Uteri entzündliche Veränderungen auf, die zu 94,1 % (n=32) chronisch waren. Entzündliche Infiltrationen mit Immunzellen wurden sowohl in Ampullen (47,9 %) als auch Isthmen (22,9 %) der Eileiter beobachtet. Die Uteri enthielten überwiegend zeitgleich mehrerer Bakterien, die als fakultativ bis obligat pathogen zu beurteilen waren. E. coli dominierte (78,0%). 21 (77,8 %) Sauen wiesen ≥ 50 ng/ml Gesamtzearalenon auf und wurden als positiv bewertet. Es bestanden keine Zusammenhänge zwischen den Chlamydienbefunden und Ergebnissen der übrigen Untersuchungen. Es ist zu schlussfolgern, dass Chlamydien unterschiedlichster Spezies Uterus und Eileiter kolonialisieren. Sie sind in der Schweinepopulation vermutlich weit verbreitet. Da auch tragende Sauen Chlamydien im Genitale enthielten, muss eine Infektion nicht zwangsläufig eine In- bzw. Subfertilität verursachen, noch für zu identifizierende Faktoren vermutlich prädisponierend wirken. Chronische Entzündungen der Uteri sind ähnlich häufig wie entzündlich veränderte Eileiter zu beobachten. Eine direkte Assoziation zwischen genitaler Entzündung und Infektion mit Chlamydien war nicht nachweisbar. Entzündungen von Eileiter und Uterus sind als Sterilitätsursache vermutlich bedeutend. Ob Chlamydien strukturelle und/oder funktionelle Eileiter- und Uterusveränderungen verursachen können, bleibt ebenso wie die Risiken für den Menschen abzuklären, die durch potenziell zoonotische Chlamydien wie Chlamydophila abortus entstehen können.

Chlamydien durch die Modulation spezifischer Wirtszellproteine verschiedene Wege der Apoptose verhindern können. Mcl-1 und cIAP-2 erwiesen sich als bedeutende Faktoren, die durch die Infektion hochreguliert und absolut notwendig für die Inhibierung der Apoptose durch Chlamydien waren. Hochregulation der Mcl-1 Expression führte zu einem Block im apoptotischen Weg oberhalb der Mitochondrien. cIAP-2 zusammen mit anderen Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAP) verhinderten die Aktivierung von Caspase-3, denfinalen Schritt in der apoptotischen Kaskade. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Aktivierung des MAPKinase-Signalweges durch die Infektion wichtig war für die Hochregulierung von Mcl-1 und cIAP-2. Ein Hochdurchsatz-Screen wurde durchgeführt, um andere Wirtszellfaktoren, die für die Apoptoseinhibierung durch die Chlamydien verantwortlich sind, zu identifizieren. Neben Mcl-1 waren die identifizierten Faktoren hauptsächlich Mitglieder des MAPKinase-Signalweges. Dabei wurde deren Rolle für die Apoptoseresistenz bestätigt. Eine weiterführende Analyse der im Screen ermittelten Faktoren identifizierte eine Funktion von HIF-1a bei der Modulation der Expression anti-apoptotischer Faktoren während der Infektion. Es wurde beobachtet, dass HIF-1a stabilisiert und zum Nukleus transloziert wird. Es ist bekannt, dass HIF-1a HIF-1a im Nukleus binden kann, um den funktionalen Transkriptionsfaktor HIF zu bilden. Dieser reguliert die Expression verschiedener Überlebensfaktoren, unter anderem Mcl-1. HIF-1a Knockdown inhibierte die Chlamydien-induzierte Hochregulation von Mcl-1 mRNA-Expression. / chlamydial infection blocked the apoptotic pathway at multiple levels by modulation of specific host cell proteins. Mcl-1 and cIAP-2 were two most prominent factors that were up-regulated during the infection, and absolutely required for apoptosis inhibition. Increased expression of Mcl-1 led to a block in the apoptotic pathway upstream of the mitochondria. cIAP-2, together with other inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), blocked the activation of caspase-3 at the final step of the apoptosis cascade. Further, it was observed that the activation of the MAPK pathways during infection was needed for the up-regulation of Mcl-1 and cIAP-2. A high throughput RNAi screen was performed to identify other host factors required for the apoptosis resistance during the infection. Besides Mcl-1, the targets from the screen prominently included members of the MAPK pathways, confirming their role in the apoptosis resistance. Pathway analysis of the targets identified the role of HIF-1a in modulating the expression of the anti-apoptotic factors during infection. It was observed that during infection, HIF-1a gets stabilized and translocates to the nucleus. It is known that HIF-1a can bind to HIF-1a in the nucleus to form the functional transcription factor HIF, which can regulate the expression of survival factors like Mcl-1. This was seen to be the case, because knock down of HIF-1a abrogated the infection induced up-regulation of Mcl-1 at the mRNA levels.

Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Humanpathogen, welches sich, nach der Einnistung in seiner Wirtszelle, innerhalb einer membranumhüllten Vakuole, der sogenannten Inklusion, befindet. Die Inklusionsmembran stellt dabei die primäre Kontaktfläche für Pathogen–Wirtszell-Interaktionen dar und definiert dadurch die Nische, in welcher sich die Bakterien vermehren können. Zum ersten Mal beschreiben wir in dieser Arbeit die Isolation und biochemische Charakterisierung der Inklusion von C. trachomatis, mittels herkömmlicher Organellaufreiniungsverfahren und massenspektrometrischer Proteomanalyse an einem zentralen Zeitpunkt der Infektion. Die relative Quantifizierung von Proteinen mittels stabiler isotopenmarkierter Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und die zusätzliche markierungsfreie Quantifizierung erlaubten uns die Darstellung dieses subzellulären Proteoms mit hohem Konfidenzniveau. Mithilfe dieser Methoden haben wir über dreihundert Wirtszellproteine identifiziert und quantifiziert, welche noch nicht als inklusionslokalisiert bekannt waren. Die globale Analyse dieser Daten bestätigte die Rekrutierung vieler Proteine, welche in verschiedenen Membrantransportwegen involviert sind. Zudem fanden sich viele Proteine des retrograden Transportweges, welcher bislang nicht im Zusammenhang mit Chlamydien-Infektionen untersucht wurde. Die detaillierte Analyse dieser Proteine zeigte, dass Sorting Nexine sehr spezifisch zur Inklusion rekrutiert werden. Zudem haben wir mithilfe des unlängst beschriebenen Inhibitors Retro-2 gezeigt, dass retrograder Transport essenziell für die effiziente intrazelluläre Replikation von C. trachomatis ist. Zusammengefasst haben wir eine große Anzahl zuvor unbekannter inklusionsassoziierter Proteine identifiziert und quantifiziert, und auf Basis unserer Daten schlagen wir den retrograden Transportweg als neues Potenzielles Angriffsziel von Therapeutika zur Behandlung von C. trachomatis Infektionen vor. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen which, after invasion of its host cell, resides within a membrane bounded vacuole called the inclusion. The inclusion membrane represents the main host-pathogen interface of Chlamydiae and thereby defines the environment in which the bacteria thrive. Here we describe for the first time the isolation and biochemical characterization of the mid-infection inclusion of C. trachomatis using mass spectrometry based proteomics in combination with traditional organelle purification techniques. Relative quantification by Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) and additional label free quantification allowed the generation of a high confidence subcellular proteome. Using this approach, we were able to identify and quantify over three hundred host cell proteins that were not reported previously to be inclusion localized. By analyzing the obtained data on a global scale, we were able to confirm previous reports on the recruitment of proteins implied in several membrane trafficking pathways. Detailed analysis of proteins identified to be involved in retrograde trafficking, a pathway that has not been described previously in the context of chlamydial infections, showed that sorting nexins are specifically recruited to the inclusion. We furthermore identified retrograde trafficking to be essential for the efficient intracellular replication of C. trachomatis using the recently described inhibitor Retro-2, which drastically reduced bacterial progeny formation upon treatment. Taken together, we identified and quantified a large number of previously unknown inclusion associated proteins, and we propose retrograde trafficking as a novel potential drug target for the treatment of infections with C. trachomatis.

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die sich in einem membranumschlossenen Kompartiment namens Inklusion vermehren. Nach Infektion fragmentiert der Golgi-Apparat der Wirtszelle in kleine Membranstapel. Dies verbessert die Aufnahme von Sphingolipiden und ist deshalb für die chlamydiale Vermehrung essentiell. Die infektionsinduzierte Golgi-Fragmentierung geschieht nach Spaltung des Golgi-Matrix-Proteins Golgin-84. In dieser Arbeit konnte, durch den Vergleich mit bekannten Substraten und Inhibitorstudien, die chlamydiale Protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) als das Enzym identifiziert werden, das diese Spaltung induziert, abhängig von der Anwesenheit zweier Rab-Proteine, Rab6 und Rab11, die den zellulären Vesikeltransport kontrollieren und zur Inklusion rekrutiert werden. Die Fragmentierung des Golgi-Apparates verhinderte dessen Relokalisierung während der Zellpolarisierung nach Einbringen eines migratorischen Stimulus. Sowohl infizierte als auch Golgin-84-depletierte Zellen migrierten langsamer und randomisiert in einem Motilitätsassay. Die Relokalisierung des Golgi-Apparates konnte durch seine Stabilisierung mittels WEHD oder Rab-Depletion wieder gewonnen werden, was die Zellmotilität teilweise wieder herstellte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Infektion außer der Golgi-Reorientierung die Signaltransduktion durch GTPasen beeinflusst. Die Aktivität von Cdc42 in infizierten Zellen war erhöht und die Interaktionen mit vielen ihrer Effektoren laut quantitativer Massenspektrometrie stark verändert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass CPAF die für Chlamydien lebenswichtige Golgin-84 Prozessierung und Fragmentierung des Golgi-Apparates auslöst. Dies verringert die Mobilität der Wirtszelle, vor allem da der Golgi-Apparat während der Polarisierung nicht mehr ausgerichtet werden kann, des Weiteren durch Modulierung der Protein-Protein-Interaktionen von Cdc42. / Chlamydia are obligate intracellular human pathogens that proliferate inside a membrane-bound compartment called the inclusion. In infected cells, the Golgi apparatus is fragmented into small ministacks that are aligned around the inclusion. This facilitates uptake of host cell sphingolipids and is essential for chlamydial development. Infection-induced Golgi fragmentation happens after processing of the Golgi matrix protein golgin-84. This work could, via comparison with well-known substrates and inhibitor studies, identify the chlamydial protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) as the enzyme accountable for this cleavage. Golgi Fragmentation depended on two Rab proteins, Rab6 and Rab11, which control vesicle transport and are recruited to the Chlamydia inclusion. As a consequence of Golgi fragmentation, cells lost the capacity to reorient the Golgi apparatus during polarization after a migratory stimulus. Both infected and golgin-84 depleted cells with a permanently fragmented Golgi apparatus displayed decelerated and furthermore randomized migration in a motility assay. Relocalization of the Golgi apparatus could be restored via stabilizing WEHD treatment or Rab depletion which partly rescued cell motility. Moreover, it could be shown that migration signaling via small GTPases was influenced by Chlamydia infection. Infected cells exhibited activation of the small polarity GTPase Cdc42. Numerous interactions with downstream effectors were strongly altered in infected cells according to quantitative mass spectrometry. Particularly, the binding of Cdc42 to migration-associated effectors was decreased. The results of this work show that CPAF, by processing of golgin-84, induces Golgi fragmentation which is vitally important for Chlamydia. This disturbs host cell motility because the Golgi apparatus cannot be reoriented during polarization and, additionally, via the modulation of protein-protein-interactions of Cdc42.

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