京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24475号 / 医博第4917号 / 新制||医||1062(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 竹内 理, 教授 上野 英樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Weltweit kommt es jährlich zu 90 Mio. Neuinfektionen mit dem sexuell übertragbaren Erreger Chlamydia trachomatis. Allerdings sind die Faktoren, die eine erfolgreiche bakterielle Vermehrung ermöglichen, weitgehend unbekannt. Während ihrer obligat intrazellulären Entwicklung sind Chlamydien auf die Errichtung und Erhaltung ihrer Nische, der Inklusion, angewiesen. Durch Interaktionen mit vesikulären Transportwegen der Wirtszelle, welche z.B. Sphingolipide transportieren, sichern die Bakterien ihr Überleben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Chlamydien während einer Infektion die Auflösung der Struktur des Golgi-Apparates induzieren. Mit Hilfe der RNA-Interferenz-Technik (RNAi) wurden die Auswirkungen des Verlustes von Golgi-Strukturproteinen auf die bakterielle Vermehrung untersucht. Der funktionelle Ausfall von Golginen, wie z.B. Golgin-84 führte zu einer Fragmentierung des Golgi-Apparates. Diese begünstigte die chlamydiale Produktion neuer infektiöser Partikel, was eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen nahelegt. Im vesikulären Transport von Nährstoffen übernehmen Rab-Proteine eine Schlüsselrolle. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Verlust von Rab6 und Rab11 durch RNAi zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl infektiöser Nachkommen führte. In diesen Zellen wurde der Golgi-Apparat nicht fragmentiert und der Transport von Sphingolipiden zu den Bakterien war stark vermindert. Untersuchungen nach simultaner Herunterregulation von Golgin-84 und Rab6 oder Rab11 demonstrierten abschließend, dass eine Kontrolle der Golgin-84-induzierten Golgi-Fragmentierung über Rab-Proteine möglich sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit offenbaren einen neuen Zusammenhang zwischen der Struktur des Golgi-Apparates und dessen Kontrolle über Rab-Proteine und ermöglichen einen tieferen Einblick in die Funktion des Golgi-Apparates während einer Chlamydien-Infektion. / Worldwide, approximately 90 mio. people are infected with the obligate intracellular bacterium Chlamydia trachomatis. However the factors involved in its successful infection and replication remain unknown. Chlamydia survive and replicate within a membrane bound niche inside host cells, termed the inclusion. To ensure survival, the chlamydial inclusion intercepts vesicular trafficking pathways of the host cell to acquire essential nutrients, such as sphingolipids. However, the exact mechanisms by which Chlamydia acquire these lipids have not been elucidated. The present work established that infection of host mammalian cells with C. trachomatis induced fragmentation of the Golgi-apparatus, but details of the mechanism to the bacterium’s pathogenesis are still required. Using RNA-Interference the role of specific Golgi-apparatus structural proteins in bacterial infectivity was investigated. Knockdown of Golgins in host cells resulted in a fragmented Golgi-apparatus and an associated increase in chlamydial replication, suggesting an enhanced acquisition of nutrients. Since Rab-proteins are known to co-ordinate the intracellular vesicular transport of nutrients, their importance in chlamydial infectivity was also investigated. Interestingly, knock down of Rab6 and Rab11 led to a significant reduction in infectious progeny. Surprisingly, upon knock down of Rab6 or Rab11 the Golgi-apparatus remained intact and sphingolipid transport into the inclusion was severely perturbed. Finally, analysis of cells simultaneously depleted of golgin-84 and Rab6 or Rab11 suggested a possible role of Rab-proteins in the control of golgin-84-induced Golgi fragmentation. These data demonstrate a yet unknown relationship between the structure of the Golgi-apparatus and its regulation and control by Rab-proteins. Furthermore, this work contributes to the existing knowledge regarding the function of the Golgi-apparatus during chlamydial infections.

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die sich in einem membranumschlossenen Kompartiment namens Inklusion vermehren. Nach Infektion fragmentiert der Golgi-Apparat der Wirtszelle in kleine Membranstapel. Dies verbessert die Aufnahme von Sphingolipiden und ist deshalb für die chlamydiale Vermehrung essentiell. Die infektionsinduzierte Golgi-Fragmentierung geschieht nach Spaltung des Golgi-Matrix-Proteins Golgin-84. In dieser Arbeit konnte, durch den Vergleich mit bekannten Substraten und Inhibitorstudien, die chlamydiale Protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) als das Enzym identifiziert werden, das diese Spaltung induziert, abhängig von der Anwesenheit zweier Rab-Proteine, Rab6 und Rab11, die den zellulären Vesikeltransport kontrollieren und zur Inklusion rekrutiert werden. Die Fragmentierung des Golgi-Apparates verhinderte dessen Relokalisierung während der Zellpolarisierung nach Einbringen eines migratorischen Stimulus. Sowohl infizierte als auch Golgin-84-depletierte Zellen migrierten langsamer und randomisiert in einem Motilitätsassay. Die Relokalisierung des Golgi-Apparates konnte durch seine Stabilisierung mittels WEHD oder Rab-Depletion wieder gewonnen werden, was die Zellmotilität teilweise wieder herstellte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Infektion außer der Golgi-Reorientierung die Signaltransduktion durch GTPasen beeinflusst. Die Aktivität von Cdc42 in infizierten Zellen war erhöht und die Interaktionen mit vielen ihrer Effektoren laut quantitativer Massenspektrometrie stark verändert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass CPAF die für Chlamydien lebenswichtige Golgin-84 Prozessierung und Fragmentierung des Golgi-Apparates auslöst. Dies verringert die Mobilität der Wirtszelle, vor allem da der Golgi-Apparat während der Polarisierung nicht mehr ausgerichtet werden kann, des Weiteren durch Modulierung der Protein-Protein-Interaktionen von Cdc42. / Chlamydia are obligate intracellular human pathogens that proliferate inside a membrane-bound compartment called the inclusion. In infected cells, the Golgi apparatus is fragmented into small ministacks that are aligned around the inclusion. This facilitates uptake of host cell sphingolipids and is essential for chlamydial development. Infection-induced Golgi fragmentation happens after processing of the Golgi matrix protein golgin-84. This work could, via comparison with well-known substrates and inhibitor studies, identify the chlamydial protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) as the enzyme accountable for this cleavage. Golgi Fragmentation depended on two Rab proteins, Rab6 and Rab11, which control vesicle transport and are recruited to the Chlamydia inclusion. As a consequence of Golgi fragmentation, cells lost the capacity to reorient the Golgi apparatus during polarization after a migratory stimulus. Both infected and golgin-84 depleted cells with a permanently fragmented Golgi apparatus displayed decelerated and furthermore randomized migration in a motility assay. Relocalization of the Golgi apparatus could be restored via stabilizing WEHD treatment or Rab depletion which partly rescued cell motility. Moreover, it could be shown that migration signaling via small GTPases was influenced by Chlamydia infection. Infected cells exhibited activation of the small polarity GTPase Cdc42. Numerous interactions with downstream effectors were strongly altered in infected cells according to quantitative mass spectrometry. Particularly, the binding of Cdc42 to migration-associated effectors was decreased. The results of this work show that CPAF, by processing of golgin-84, induces Golgi fragmentation which is vitally important for Chlamydia. This disturbs host cell motility because the Golgi apparatus cannot be reoriented during polarization and, additionally, via the modulation of protein-protein-interactions of Cdc42.