Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2ssss6.

Zugl.: München, Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2009.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Techn. University, Diss., 2005--München.

Chlamydien haben ein breites Wirtsspektrum und können vielfältige Krankheitssymptome hervorrufen. Obwohl übereinstimmend angenommen wird, dass Chlamydien Fruchtbarkeitsstörungen bei der Sau verursachen, sind zahlreiche Fragen ungeklärt. So ist bisher unbekannt, ob Chlamydien die Eileiter des Schweines besiedeln und krankhafte Veränderungen hervorrufen können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Eileiter reproduktionsgestörter Sauen auf Chlamydien zu untersuchen und deren mögliche Bedeutung als Infertilitätsursache zu eruieren. Zeitgleich wurden auch Uteri beprobt und diversen differenzialdiagnostisch relevanten Analysen unterzogen. Letztlich sollte durch die Bestimmung von Zearalenon in der Galle das differenzialdiagnostische Spektrum vervollständigt werden. Insgesamt wurden die Genitalorgane von 42 reproduktionsgestörten Sauen (Jungsauen: n=14; Altsauen: n=28; wiederholte Umrausche) aus drei Betrieben auf Chlamydien untersucht. Bei 20 Sauen (Gruppe 1) wurden ein Eileiter und der Uterus, bei weiteren 22 Sauen (Gruppe 2) Ampulle, Isthmus und uterotubale Verbindung beider Eileiter und der Uterus untersucht. Genitalien acht tragender Sauen dienten als Kontrollen. Zum Nachweis von Chlamydien kamen ein kommerzieller IFT (Chlamydia Direct IF Identification) und eine nested PCR (Nachweis des MOMP) mit anschließender Sequenzierung positiver PCR-Produkte zur Anwendung. Eileiter bzw. Eileitersegmente und Uteri wurden histologisch, Uteri fortpflanzungsgestörter Sauen zudem bakteriologisch untersucht. Bei 27 Sauen erfolgte eine Bestimmung von Gesamt-Zearalenon mittels HPLC in der Gallenflüssigkeit. Die IFT- und PCR-Ergebnisse differierten erheblich. Mit dem IFT wurden wesentlich mehr positive Ergebnisse als mit der PCR generiert. Bei 30 (60 %) der insgesamt 50 untersuchten Sauen wurden Chlamydien mittels PCR nachgewiesen. In Gruppe I waren 6 (30 %) der Uteri und 7 (35 %) der Eileiter Chlamydia-positiv, während in der Gruppe II 8 (36,4 %) der Uteri und 12 (54,5 %) der Eileiter als positiv befundet wurden. Tragende Tiere wiesen jeweils 3 (37,5 %) Chlamydia-positive Uteri und Eileiter auf. Nur in einem Fall (12,8 %) konnten Chlamydien ausschließlich im Eileiter detektiert werden. Chlamydien wurden uni- oder bilateral in einem oder mehreren Eileitersegmenten ohne oder mit zeitgleicher Besiedlung des Uterus nachgewiesen. Insgesamt wurden 41 spezifische PCR-Amplifikate aus Eileitersegmenten und Uteri von 26 reproduktionsgestörten Tieren der Gruppen I und II und 4 trächtigen Sauen sequenziert. Am häufigsten wurden Chlamydophila psittaci (n = 24) und Chlamydia suis (n = 10) detektiert. Seltener waren Chlamydophila abortus (n = 4) und Chlamydia trachomatis (n = 3) festzustellen. Insgesamt wiesen 34 (89,5 %) von 38 histologisch untersuchten Uteri entzündliche Veränderungen auf, die zu 94,1 % (n=32) chronisch waren. Entzündliche Infiltrationen mit Immunzellen wurden sowohl in Ampullen (47,9 %) als auch Isthmen (22,9 %) der Eileiter beobachtet. Die Uteri enthielten überwiegend zeitgleich mehrerer Bakterien, die als fakultativ bis obligat pathogen zu beurteilen waren. E. coli dominierte (78,0%). 21 (77,8 %) Sauen wiesen ≥ 50 ng/ml Gesamtzearalenon auf und wurden als positiv bewertet. Es bestanden keine Zusammenhänge zwischen den Chlamydienbefunden und Ergebnissen der übrigen Untersuchungen. Es ist zu schlussfolgern, dass Chlamydien unterschiedlichster Spezies Uterus und Eileiter kolonialisieren. Sie sind in der Schweinepopulation vermutlich weit verbreitet. Da auch tragende Sauen Chlamydien im Genitale enthielten, muss eine Infektion nicht zwangsläufig eine In- bzw. Subfertilität verursachen, noch für zu identifizierende Faktoren vermutlich prädisponierend wirken. Chronische Entzündungen der Uteri sind ähnlich häufig wie entzündlich veränderte Eileiter zu beobachten. Eine direkte Assoziation zwischen genitaler Entzündung und Infektion mit Chlamydien war nicht nachweisbar. Entzündungen von Eileiter und Uterus sind als Sterilitätsursache vermutlich bedeutend. Ob Chlamydien strukturelle und/oder funktionelle Eileiter- und Uterusveränderungen verursachen können, bleibt ebenso wie die Risiken für den Menschen abzuklären, die durch potenziell zoonotische Chlamydien wie Chlamydophila abortus entstehen können.

Zugl.: Berlin, Freie University, Diss., 2009.

Chlamydien haben ein breites Wirtsspektrum und können vielfältige Krankheitssymptome hervorrufen. Obwohl übereinstimmend angenommen wird, dass Chlamydien Fruchtbarkeitsstörungen bei der Sau verursachen, sind zahlreiche Fragen ungeklärt. So ist bisher unbekannt, ob Chlamydien die Eileiter des Schweines besiedeln und krankhafte Veränderungen hervorrufen können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Eileiter reproduktionsgestörter Sauen auf Chlamydien zu untersuchen und deren mögliche Bedeutung als Infertilitätsursache zu eruieren. Zeitgleich wurden auch Uteri beprobt und diversen differenzialdiagnostisch relevanten Analysen unterzogen. Letztlich sollte durch die Bestimmung von Zearalenon in der Galle das differenzialdiagnostische Spektrum vervollständigt werden. Insgesamt wurden die Genitalorgane von 42 reproduktionsgestörten Sauen (Jungsauen: n=14; Altsauen: n=28; wiederholte Umrausche) aus drei Betrieben auf Chlamydien untersucht. Bei 20 Sauen (Gruppe 1) wurden ein Eileiter und der Uterus, bei weiteren 22 Sauen (Gruppe 2) Ampulle, Isthmus und uterotubale Verbindung beider Eileiter und der Uterus untersucht. Genitalien acht tragender Sauen dienten als Kontrollen. Zum Nachweis von Chlamydien kamen ein kommerzieller IFT (Chlamydia Direct IF Identification) und eine nested PCR (Nachweis des MOMP) mit anschließender Sequenzierung positiver PCR-Produkte zur Anwendung. Eileiter bzw. Eileitersegmente und Uteri wurden histologisch, Uteri fortpflanzungsgestörter Sauen zudem bakteriologisch untersucht. Bei 27 Sauen erfolgte eine Bestimmung von Gesamt-Zearalenon mittels HPLC in der Gallenflüssigkeit. Die IFT- und PCR-Ergebnisse differierten erheblich. Mit dem IFT wurden wesentlich mehr positive Ergebnisse als mit der PCR generiert. Bei 30 (60 %) der insgesamt 50 untersuchten Sauen wurden Chlamydien mittels PCR nachgewiesen. In Gruppe I waren 6 (30 %) der Uteri und 7 (35 %) der Eileiter Chlamydia-positiv, während in der Gruppe II 8 (36,4 %) der Uteri und 12 (54,5 %) der Eileiter als positiv befundet wurden. Tragende Tiere wiesen jeweils 3 (37,5 %) Chlamydia-positive Uteri und Eileiter auf. Nur in einem Fall (12,8 %) konnten Chlamydien ausschließlich im Eileiter detektiert werden. Chlamydien wurden uni- oder bilateral in einem oder mehreren Eileitersegmenten ohne oder mit zeitgleicher Besiedlung des Uterus nachgewiesen. Insgesamt wurden 41 spezifische PCR-Amplifikate aus Eileitersegmenten und Uteri von 26 reproduktionsgestörten Tieren der Gruppen I und II und 4 trächtigen Sauen sequenziert. Am häufigsten wurden Chlamydophila psittaci (n = 24) und Chlamydia suis (n = 10) detektiert. Seltener waren Chlamydophila abortus (n = 4) und Chlamydia trachomatis (n = 3) festzustellen. Insgesamt wiesen 34 (89,5 %) von 38 histologisch untersuchten Uteri entzündliche Veränderungen auf, die zu 94,1 % (n=32) chronisch waren. Entzündliche Infiltrationen mit Immunzellen wurden sowohl in Ampullen (47,9 %) als auch Isthmen (22,9 %) der Eileiter beobachtet. Die Uteri enthielten überwiegend zeitgleich mehrerer Bakterien, die als fakultativ bis obligat pathogen zu beurteilen waren. E. coli dominierte (78,0%). 21 (77,8 %) Sauen wiesen ≥ 50 ng/ml Gesamtzearalenon auf und wurden als positiv bewertet. Es bestanden keine Zusammenhänge zwischen den Chlamydienbefunden und Ergebnissen der übrigen Untersuchungen. Es ist zu schlussfolgern, dass Chlamydien unterschiedlichster Spezies Uterus und Eileiter kolonialisieren. Sie sind in der Schweinepopulation vermutlich weit verbreitet. Da auch tragende Sauen Chlamydien im Genitale enthielten, muss eine Infektion nicht zwangsläufig eine In- bzw. Subfertilität verursachen, noch für zu identifizierende Faktoren vermutlich prädisponierend wirken. Chronische Entzündungen der Uteri sind ähnlich häufig wie entzündlich veränderte Eileiter zu beobachten. Eine direkte Assoziation zwischen genitaler Entzündung und Infektion mit Chlamydien war nicht nachweisbar. Entzündungen von Eileiter und Uterus sind als Sterilitätsursache vermutlich bedeutend. Ob Chlamydien strukturelle und/oder funktionelle Eileiter- und Uterusveränderungen verursachen können, bleibt ebenso wie die Risiken für den Menschen abzuklären, die durch potenziell zoonotische Chlamydien wie Chlamydophila abortus entstehen können.

Zellkultursysteme mit Krebszelllinien werden seit Langem zur Untersuchung der Interakti-on zwischen Pathogenen und ihren Wirtszellen eingesetzt. Diese Systeme eignen sich aufgrund der reduzierten Komplexität für die Analyse einzelner Faktoren, spiegeln jedoch nicht den Zustand primärer Zellen oder die komplexe Gewebestruktur wieder. Um die Beschränkungen zu umgehen, wurden in dieser Arbeit neue Modelle etabliert auf der Grundlage von reversibel immortalisierten humanen Primärzellen und ex vivo Kultur von intaktem humanem Eileitergewebe. Infektionen mit dem humanpathogenen Bakterium Chlamydia trachomatis, welches chronische Schmerzen oder Unfruchtbarkeit auslösen kann, wurden in diesen Modellen untersucht. Reversible Immortalisierung wurde mit pri-mären human Eileiterzellen (FT Zellen) und humanen Nabelschnurzellen (HUVEC) durchgeführt. Das System basiert auf lentiviralem Gentransfer und dem Cre-lox-System. HUVEC Zellen wurden mit Kombinationen der Onkoproteine hTERT, SV40T und Bmi1 immortalisiert. Immortalisierung von FT Zellen wurde mit SV40T und Bmi1 erreicht. Eine Analyse der FT Zelllinien zeigte Veränderungen des Karyotyps durch die Immortalisie-rung. Bemerkenswerterweise konnten die Stammzellmarker CD44 und Oct4 in FT Zellen nachgewiesen werden. Ex vivo Gewebekultur humaner Eileiter wurde als stabiles Infekti-onsmodel für Chlamydia trachomatis etabliert. Mittels hochauflösender Konfokal-mikroskopie wurde gezeigt, dass die Infektion mit C. trachomatis tiefgreifende Verände-rungen im Epithel der Mukosa auslöst und zum Verlust der Zelladhäsion und Zellpolarität führt. Ein erhöhter Anteil apoptotischer Zellen wurde nach Infektion mit Serovar D beo-bachtet, einem klinischen Isolat des Genitaltraktes. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu Infektionen mit dem Laborstamm Serovar L2. Phänotypische Veränderungen in nicht infizierten Zellen weisen auf die Existenz parakriner Signalwege während der akuten In-fektion und Veränderung der epithelialen Homeostase hin. / Cell culture systems with cancer-derived cell lines have long been used to study the interaction between pathogens and their host cells. Due to reduced complexity these systems are convenient for the analysis of single factors; however, they do not represent the condition of primary cells or the complex tissue structure. To circumvent these limitations new models were established in this study on the basis of reversibly immortalized human primary cells and ex vivo culture of intact human fallopian tube tissue. Infections with the human pathogenic bacterium Chlamydia trachomatis, which can lead to chronic pain or infertility, were analyzed in these models. Reversible immortalization was applied to primary human fallopian tube (FT) cells and human umbilical vein cells (HUVEC). This system is based on lentiviral gene transfer and the Cre-lox-system. HUVEC cells were immortalized with a combination of two of the oncoproteins hTERT, SV40T and Bmi1. Immortalization of FT cells was achieved with SV40T and Bmi1. Analysis of FT cell lines revealed changes of the karyotype induced by immortalization. Remarkably, the stem cell markers CD44 and Oct4 were detected in FT cells. Ex vivo tissue culture of human fallopian tubes was established as stable and reliable infection model for Chlamydia trachomatis. Via high resolution confocal analysis the infection with C. trachomatis was discovered to trigger profound changes in the epithelial mucosa, causing loss of cell adhesion and polarity. Interestingly, an increase in the rate of apoptotic cells was observed after infection with serovar D, a clinical genital tract isolate. This finding is in contrast to infections with serovar L2, a laboratory strain. Phenotypic changes in non-infected cells suggest the existence of paracrine signalling during acute infection and change in epithelial homeostasis.

In der Forschung dient die Hauskatze als Modellspezies für die Entwicklung und Verbesserung assistierter Reproduktionstechniken (ART) für wildlebende Katzenarten, von denen die meisten der 36 Arten auf der Roten Liste für bedrohte Tierarten als gefährdet eingestuft sind. Eine erfolgreich angewandte Methode der ART bei Hauskatzen ist die In-vitro-Produktion von Embryonen. Allerdings gestaltet sich die Übertragbarkeit der Protokolle auf andere Feliden aufgrund speziesspezifischer reproduktionsbiologischer Besonderheiten oft sehr schwierig. Das Ziel dieser Doktorarbeit war daher die Charakterisierung des felinen Oviductins, ein Glykoprotein, welches ausschließlich im Eileiter exprimiert wird und das in mehreren Studien bei anderen Tierarten einen positiven Effekt auf die Interaktion der Gameten, Befruchtung, Teilungsraten und Embryonalentwicklung gezeigt hat. Die feline Oviductinsequenz konnte in der vorliegenden Arbeit vollständig identifiziert werden. Sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeigte sich eine zyklusabhängige Expression von Oviductin im Eileiter mit höchsten mRNA-Kopienzahlen bzw. höchster Proteinsynthese während des Östrus. Für funktionelle Studien wurde eine Methode zur Herstellung eines rekombinant exprimierten Oviductins in E.coli etabliert. Die Anwesenheit des rekombinanten Proteins führte zu einer signifikant höheren Spermienbindung an die Zona pellucida feliner Eizellen. Die Zugabe des rekombinanten Proteins während der In-vitro Fertilisation (IVF) hatte keinen Einfluss auf die Teilungs- oder Entwicklungsraten der Embryonen, allerdings zeigten Blastocysten, die sich aus einer IVF mit Oviductin entwickelten, eine signifikant höhere Expression des gap junction protein alpha 1 Gens, was für eine verbesserte Embryonenqualität spricht. / The domestic cat serves as a model to develop and improve assisted reproductive techniques for wild felid species from which most of them are listed on the IUCN Red List of threatened species. In-vitro embryo production is successfully applied for the domestic cat but adaption to other felids, caused by their diversity in reproductive physiology, is often difficult. The biggest challenge is to create an in-vitro environment as near as possible to in-vivo conditions within the oviduct where final maturation of gametes, fertilization and early embryo development occur. Therefore, the aim of this doctoral thesis was to characterize feline oviductin, a glycoprotein which is exclusively expressed in the oviduct. Several functional studies with other species could show an influence of oviductin on gamete interaction, fertilization, cleavage rates and embryo development. In the present work gene sequence of the feline oviductin could be identified. Highest mRNA copy numbers and protein synthesis were detected during oestrus, indicating a cycle-dependent expression of oviductin in the cat. For functional studies, a method for production of recombinant oviductin in E.coli was established. Sperm-zona binding was significantly higher when recombinant oviductin was present. Addition of oviductin during in-vitro fertilization (IVF) had no effect on cleavage, morula rates or blastocyst development. In contrast, in blastocysts developed from IVF with oviductin, we found a significantly higher mRNA expression of gap junction alpha protein 1, suggesting a higher quality of in-vitro produced embryos.