Tumore von Kopf und Hals gehen weiterhin mit einer schlechten Prognose einher. Im Rahmen einer operativen Therapie tritt Wundsekret (WS) aus, welches der Wundheilung dient. Dieses kann in Kontakt mit Tumorzellen bzw. Resttumor in der Wunde kommen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Frage nach dem Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, den Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in Tumorzellen von Kopf und Hals gestellt. Hierfür wurde das WS von Tag1 und das WS von Tag 2 im Dotblot auf seine Zytokinzusammensetzung analysiert. Zwei Tumorzelllinien von Kopf und Hals, FaDu und HlaC78, wurden mit WSTag1 und WSTag2 behandelt und untersucht, welche Effekte das WS auf die Zellen hat. Verwendet wurden ein Proliferationsassay, eine Zellzyklusuntersuchung und Apoptosetestung mittels FACS, eine PCR, ein Spheroidmodell und die Lichtmikroskopie. Im WS wurden erhöhte Konzentrationen verschiedener Zytokine, insbesondere von IL-6, nachgewiesen. Gezeigt werden konnte eine gesteigerte Proliferationsrate der Tumorzellen unter WS-Behandlung, jedoch keine veränderte Verteilung der Zellzyklusphasen. In HlaC78-Zellen konnte eine vermehrte Vitalität nach Cisplatinbehandlung nachgewiesen werden. In beiden Tumorzelllinien fand sich eine vermehrte Exprimierung von Snail 1, Snail 2 und Vimentin. E-Cadherin wurde vermindert exprimiert. Twist und N-Cadherin wiesen keine Veränderungen auf. Es zeigte sich eine vermehrte Migration der Tumorzellen in die Umgebung. Die Zellen wiesen nach Behandlung mit WS vermehrt mesenchymale Zeichen auf. Es konnte kein Unterschied der Auswirkungen einer Behandlung mit WSTag1 im Vergleich zu einer Behandlung mit WSTag2 festgestellt werden. Insgesamt scheint WS in Tumorzellen von Kopf und Hals einen EMT-artigen Prozess in Gang zu setzen, also eine partial EMT (pEMT). Als mögliche Auslöser dieser Veränderungen kommen die im WS nachgewiesenen Zytokine und v. a. IL-6 in Frage. / Tumors of the head and neck continue to be associated with a poor prognosis. In the course of surgical therapy, wound fluid (WF) may come into contact with tumor cells or residual tumor in the wound. In this study, the influence of wound fluid on cell proliferation, development of chemoresistance, the cell cycle and the induction of an epithelial-mesenchymal transition (EMT) in tumor cells of the head and neck was investigated. Therefore, WF from day 1 and WF from day 2 were analyzed for their cytokine composition by Dotblot. The effects of WF from day 1 and WF from day 2 on two tumor cell lines of the head and neck, FaDu and HlaC78, were investigated using a proliferation assay, a cell cycle assay and an apoptosis assay via FACS, PCR, a spheroid model and light microscopy. Increased concentrations of various cytokines, especially IL-6, were detected in the WF. An increased proliferation rate of tumor cells under WF treatment could be shown. There was no alteration in the distribution of cell cycle phases, however. In HlaC78 cells an increased vitality after cisplatin treatment could be proven. Increased expression of Snail 1, Snail 2, and Vimentin was found in both tumor cell lines. The expression of E-cadherin was decreased. Twist and N-cadherin showed no changes. Increased migration of tumor cells to the surrounding area could be seen. Cells showed more mesenchymal signs after treatment with WF. No difference in the effects of treatment with WF from day 1 compared to treatment with WF from day 2 was observed. Overall, WF appears to initiate an EMT-like process in tumor cells of the head and neck, this is called partial EMT (pEMT). Possible inducers of these changes are the cytokines and in particular IL-6 that have been found in WF.

Impaired wound healing and the resulting chronic wounds may cause significant morbidity and mortality. In these pathogenic wound environments, the ratio of inflammatory and anti-inflammatory cytokines is highly biased to the pro-inflammatory side. While the inflammatory process is an essential step in healthy wound healing, chronic wounds remain in a constant self-sustaining state of inflammation. Thus, decreased cell proliferation, reduced matrix deposition and delayed wound closure are the results. Although various cytokine-based therapies have shown promising results on skin regeneration in preliminary studies, their overall clinical use has been considerably limited by the short half-life time of the signaling molecules due to rapid dilution and degradation in the protease-rich chronic wound environment. In this work, we explored the ability of starPoly(ethylene glycol)-GAG hydrogels to modulate the hallmarks of chronic wound development, such as the prolonged inflammation, increased cell influx and delayed proliferative phase. Therefore, different strategies were developed to shape the cytokine levels in the wound towards a more pro-regenerative direction, finally promoting the natural repair process in chronic skin wounds. By biomimetically utilizing the interactions between cytokines and the tissue ECM in a GAG-based biohybrid hydrogel, we could engineer the concentrations of various signaling factors involved in the regulation of the repair process. More in detail, we utilized customized functionalized starPEG-GAG hydrogels to (1) reduce the extensive levels of inflammatory chemokines by scavenging them via GAG component of the hydrogel and thus diminish immune cell influx in a mouse wound model; (2) locally deliver the immunomodulatory IL-4 and IL-10 to shift the signaling balance into the pro-regenerative direction and thus resolve inflammation and (3) administer pre-conjugated TGF-β to enhance myofibroblast differentiation and extracellular matrix deposition. We believe that the presented hydrogel platform may become a promising tool in the management of cytokines in regenerative applications, which can be translated towards the clinical use for the treatment of chronic wounds and other diseases characterized by uncontrolled inflammation.:1 introduction 1.1 Motivation 1.2 Current state of biomaterial-based concepts in dermal wound healing 1.3 Objective 2 fundamentals 2.1 The physiological process of wound healing 2.1.1 The role of macrophages in wound healing 2.1.2 The role of fibroblasts in wound healing 2.1.3 The role of cytokines and their interaction with the ECM 2.2 The pathophysiology of chronic wounds 2.3 Strategies for treatment of chronic wounds 2.4 Biomaterials in medicine 2.4.1 Polymers in medicine 2.4.2 Mechanical properties 2.4.3 Cellular adhesion 2.4.4 Interaction with cytokines 2.4.5 Scaffold degradability 2.4.6 StarPEG-GAG hydrogels as potential material in wound healing 3 materials & methods 3.1 Preparation of hydrogels 3.1.1 Functionalization of glass surfaces 3.1.2 Hydrogel formation with EDC - NHS chemistry 3.1.3 Hydrogel formation with thiol - maleimide chemistry 3.1.4 Rheometric measurement of hydrogel discs 3.1.5 Characterization of cytokine uptake and release 3.2 Culture of human & murine cells 3.2.1 Isolation and differentiation of murine dermal fibroblasts 3.2.2 Isolation & differentiation of murine macrophages 3.2.3 Culture of human & murine cell lines 3.3 In vitro methods 3.3.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 3.3.2 Bead-based multiplex immunoassay 3.3.3 Live/Dead Staining 3.3.4 Crystal violet staining 3.3.5 Cell proliferation assay 3.3.6 RNA extraction & analysis 3.3.7 cDNA synthesis 3.3.8 Quantitative real time rt-PCR 3.4 Statistical analysis 3.5 Software use 4 scavenging inflammatory chemokines to control immune cell influx in the wound 4.1 Results 4.1.1 Engineering heparin-based hydrogels to scavenge chemokines 4.1.2 Heparin-based hydrogels reduce migration of immune cells 4.1.3 Heparin-based hydrogels decrease wound immune cell influx and inflammatory signaling 4.2 Discussion 5 promotion of regenerative macrophage polarizationin inflammatory environments 5.1 Results 5.1.1 Reversible complexation of IL-4 & IL-10 to starPEG-heparin gels 5.1.2 Stabilizing effects of starPEG-heparin gels on IL-4 5.1.3 IL-4 & IL-10-laden starPEG-heparin hydrogels modulate macrophage polarization 5.1.4 IL-4-laden starPEG-heparin induce collagen deposition in dermal fibroblasts 5.2 Discussion 6 modulation of human dermal fibroblast proliferation and differentiation 6.1 Results 6.1.1 Reversible complexation of TGF-b to starPEG heparin gels 6.1.2 Cell attachment, spreading and proliferation 6.1.3 Matrix deposition by fibroblasts grown on starPEG-heparin hydrogels 6.1.4 Degradation of starPEG-heparin hydrogels 6.1.5 TGF-b-laden starPEG-heparin that efficiently induces myofibroblast differentiation 6.2 Discussion 7 general discussion 7.1 Summary and conclusion 7.2 Future perspective Appendix 8 supplementary materials & methods 9 declaration of authorship 10 publications and conference contributions bibliography list of figures list of tables nomenclature selbstständigkeitserklärung

Thesis (doctoral)--Universität, Würzburg, 2001.

Wound healing and scar quality after trauma are subject to impairment through excessive wound healing, chronic wound or even surgical site infections. Optimizing the process of scar formation and skin healing is crucial in virtually all fields of medicine. In this regard, we tested the possible usage and advantages of titanium coated suture material. We performed a prospective observational cohort study including 30 patients who underwent soft tissue reconstruction. One half of the donor flap site was sutured with titanium coated suture material, while the other half was closed with non-coated sutures. Scar quality of the donor flap site was assessed by photographs and POSAS scores. No difference between the titanium coated and non-titanium-coated suture material was seen in the POSAS assessment in regard to scar quality and wound healing. Comorbidities like diabetes, chronic renal failure and smoking as well as the BMI of each patient affected the wound healing process to an equal degree on both sides of the suture.The titanium-coated suture material can be considered to be equally as effective and safe in all qualities as the non-titanium-coated suture material.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine erste Bewertung eines neu entwickelten Cryogels auf Basis von acrylierter Hyaluronsäure für den Einsatz als künstliche Extrazellulärmatrix (ECM) zur Unterstützung des Wundheilungsprozesses. Zu diesem Zweck wurden die Cryogele bis zu einer Dauer von 4 Wochen mit Fibroblasten, die neben Keratinozyten, Endothel- und Immunzellen eine besondere Rolle für den Wundverschluss spielen, kultiviert. Dadurch konnten grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Proliferation, Migration und Matrixsynthese gewonnen werden Ein maßgeblicher Bestandteil war dabei auch die Untersuchung der Genexpression von Kollagen-1 (coll-1), Hyaluronsynthase-2 (HAS-2) und Matrixmetalloproteinase-1(MMP-1) nach Stimulation mit den wundheilungsassoziierten Zytokinen Transforming Growth Factor β (TGF-β ) und Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF-BB). Die Produkte der drei Gene spielen für den Wundheilungsprozess eine entscheidende Rolle, da sie wesentlich am Auf- und Umbau der ECM beteiligt sind. Zudem wurden in der Versuchsplanung die Auswirkungen auf Morphologie und Funktion der Fibroblasten bei 3-dimensionaler Kultur im Vergleich zur 2-dimensionalen Monolayerkultur berücksichtigt. Um eine bestmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, wurde aus diesem Grund ein 3-dimensionales Kollagengel als Kontrollmodell genutzt. Die Ergebnisse spiegeln ein physiologisches Verhalten von Fibroblasten bei Kultur in den Cryogelen wider. Die Zellen adhärieren an der Gelstruktur, proliferieren und verteilen sich im Cryogel, indem sie in die Tiefe wandern. In den mikroskopischen und makroskopischen Färbungen zeigt sich eine kontrollierte Neusynthese von ECM. Die Applikation von TGF-β und PDGF-BB führt zu einer adäquaten Reaktion der Fibroblasten und einer Regulation des Matrixstoffwechsels. Die Ergebnisse sind mit denen aus einem 3-dimensionalen Kollagengelmodell vergleichbar und stimmen im Wesentlichen mit der Literatur zur Wirkung der beiden Zytokine auf Monolayerkulturen von Fibroblasten überein. Messungen zeigen eine leichte Zunahme der Porengröße der Cryogele im zeitlichen Verlauf, was möglicherweise auf einen Abbau durch die Fibroblasten hindeutet. Die Stabilität der Gele wird dadurch jedoch nicht merklich beeinflusst. Durch ihre Zusammensetzung und grundlegende Struktur sowie den damit verbundenen Eigenschaften ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten sowohl im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagung / Die erhobenen Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass die Zusammensetzung, Struk-tur und damit verbundenen grundlegenden Eigenschaften die Cryogele zu einem geeig-neten Substrat für die 3-dimensionale in vitro Kultur von Fibroblastenmachen. Aus der Literatur ist bekannt, dass eine Besiedelung ähnlich gearteter Hydrogele auch mit anderen Zelltypen möglich ist. Daraus ergeben sich Optionen sowohl für die Anwendung im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung. Die statistischen Daten verdeutlichen den Innovati-onsbedarf für die Therapie chronischer Wunden und für Alternativen zu Voll-und Spalt-hauttransplantaten bei der Behandlung großflächiger Brandverletzungen. Um für die Be-handlung beider Wundentitäten in Betracht zu kommen, müssen Materialien zur Wund-versorgung den Anforderungen der aktuellen Therapieleitlinien gerecht werden. Aufgrund des natürlichen Vorkommens von Hyaluronsäure im dermalen Gewebe und der Möglichkeit dem körpereigenen Um-und Abbau unterworfen werden zu können, haben die Cryogele entscheidende Vorteile gegenüber bereits zugelassener Materialien, die syn-thetischen oder tierischen Ursprungs sind und nicht selten Allergien oder Fremdkörper-reaktionen hervorrufen. Weitere Eigenschaften der Cryogele lassen vermuten, dass sie mit Hilfe einiger Modifikationen den Kriterien der Leitlinien entsprechen könnten. Die 2-dimensionale Monolayerzellkultur stößt als Forschungsmedium immer dann an ihre Grenzen, wenn die erhobenen Ergebnisse nicht auf die Verhältnisse in vivo übertrag-bar sind. 3-dimensionale Zell-Zell-und Zell-Matrixkontakte sind die Grundlage für eine korrekte Zellfunktion, weswegen die Forderung nach einer Matrix für den Einsatz in der Zellforschung, die die physiologischen Verhältnisse so gut wie möglich abbilden kann, immer präsenter wird. Die Besiedlung der Cryogele aus Hyaluronsäure und anschlie-ßende Untersuchung mit unterschiedlichen Methoden erwies sichim Wesentlichen als unkompliziert. Darüber hinaus zeigten die ausgesäten Fibroblasten eine adäquates Wachstums-und Matrixsyntheseverhalten, weswegen eine Nutzung zu Forschungszwe-cken denkbar erscheint. Die gewonnen Erkenntnisse sowie die in der Diskussion behandelte Literatur und aufgezeigten Möglichkeiten zur Weiterentwicklung der Cryo-gele bilden die Basis für die Planung weiterer und richtungsspezifischerer Untersuchungen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagung

Nach einer Gewebeschädigung stellt die Entzündungsreaktion den ersten essentiellen Schritt für die Wundheilung dar, deren anschließendes Auflösen den Übergang zur Phase der Gewebeneubildung einleitet. Voraussetzung für diesen Ablauf ist die Herunterregulierung der Aktivität proinflammatorischer M1-Makrophagen (M1-Ma) sowie die Induktion antiinflammatorischer M2-Makrophagen (M2-Ma). Zwischen diesen beiden Phänotypen steht ein breites Spektrum unterschiedlich aktivierter Ma, die in der Wundheilung aktiv sind. Die Auslöser für diesen wichtigen Übergang sind dabei weitgehend unbekannt. Es ist in in vitro Versuchen beschrieben, dass entzündlich aktivierte humane dermale Fibroblasten (dFb) die inflammatorische Aktivität von M1-Ma reduzieren und zusätzlich die Polarisierung von inflammatorisch aktivierten Monozyten zu M2-Ma fördern. Diese Effekte vermitteln sie über die Freisetzung immunmodulierender Mediatoren, insbesondere von TSG-6 und PGE2, einem Produkt der Cyclooxygenase 2 (COX 2). Bisher wurden diese Faktoren noch nicht im zeitlichen Verlauf der Entzündungsreaktion während der Wundheilung in einem in vivo Tiermodell untersucht. In dieser Arbeit konnte festgestellt werden, dass in dem angewendeten murinen in vivo Wundheilungsmodell die initiale Entzündungsreaktion nach 24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht. Synchron dazu konnte erstmals gezeigt werden, dass das Auftreten von TSG-6 und COX-2 ebenfalls die höchste Expression am 1. Tag nach der Wundsetzung aufzeigt. In der Analyse der aufgetrennten Zellschichten der Haut wurde nachgewiesen, dass COX-2 in der epidermalen und dermalen Schicht exprimiert wird. Die Synthese von TSG-6 hingegen ist auf die Zellen in der dermalen Schicht beschränkt. Die Isolierung und Untersuchung von dFb aus dem restlichen Zellverband des Wundgewebes bestätigte dFb als Quelle für die TSG-6 Synthese. In einem weiteren Versuchsansatz mit entzündlich aktivierten humanen Keratinozyten wurde gezeigt, dass sie kein TSG-6 bilden können. Somit stellen die gewonnenen Erkenntnisse die Grundlagen zukünftiger Untersuchungen zum funktionalen Ablauf der Wundheilung dar, in welchem die dermalen Fibroblasten als zentrale Schlüsselrolle im Entzündungsgeschehen betrachtet werden müssen. Daraus können sich neue therapeutische Ansätze zur Modulation einer gestörten Wundheilung ergeben.:1 Einleitung 1.1 Aufbau und Funktion der Haut 1.2 Wundheilung 1.2.1 Phasen der Wundheilung 1.2.1 Bedeutung der Makrophagen in der Wundheilung 1.3 Beeinflussung der Entzündungsauflösung 1.4 Einfluss von dFb auf die Ma-Differenzierung 1.5 Aufgabenstellung 2 Materialien und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Maus 2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 2.1.3 Software 2.1.4 Chemikalien und molekularbiologische Reagenzien 2.1.5 Antikörper und Primer 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultur 2.2.2 In vivo Wundheilungsmodell 2.2.3 Aufbereitung der Gewebeproben 2.2.3.1 Gesamtwundgewebe 2.2.3.2 Auftrennung der dermalen und epidermalen Schicht 2.2.3.3 Isolierung von dermalen Fibroblasten aus Wund- und Hautbiopsien 2.2.4 Histologische Analyse 2.2.5 Zellzahlbestimmung 2.2.6 Durchflusszytometrie 2.2.7 Genexpressionsanalysen 2.2.7.1 RNA- Isolierung/Konzentrations- und Reinheitsbestimmung 2.2.7.2 Herstellung von cDNA 2.2.7.3 Quantitative Echtzeit-PCR 2.2.8 Proteinbiochemische Analysen 2.2.8.1 Proteingewinnung aus Zellkulturen 2.2.8.2 Proteinisolation aus den Wund- und Hautbiopsien 2.2.8.3 Immunoassays 2.2.8.4 Analytische Auswertung der Proteinmessungen aus den Wund- und Hautbiopsien 2.2.9 Statistische Auswertung 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung der Entzündungsphase 3.1.1 Wundverschluss 3.1.2 Zeitliche Expression proinflammatorischer Mediatoren 3.1.3 Zeitliche Expression antiinflammatorischer Mediatoren 3.2 Zeitliche Expression von TSG-6 und COX-2 und deren Produkte in der Gesamtwunde 3.3 Bestimmung des Ursprungs von TSG-6 und COX-2 in der Wundheilung 3.3.1 Auftrennung des Wundgewebes in Epidermis und Dermis 3.3.1.1 Charakterisierung der Schichten 3.3.1.2 Nachweis von TSG-6 und COX-2 3.3.2 Isolierung von dFb aus dem Wundrand 3.3.2.1 Charakterisierung der separierten Zellfraktionen 3.3.2.2 Nachweis von TSG-6 und COX-2 3.4 Humanes Modell: in vitro Kultur hudFb und huKC 3.4.1 Nachweis von TSG-6 und COX-2 und deren Produkte 4 Diskussion 5 Zusammenfassung der Arbeit 6 Literaturverzeichnis A Appendix A1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit A2 Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung des Titels Dr. med. A3 Publikationen A4 Danksagung

Die Wundheilung stellt einen physiologischen Vorgang zur Regeneration zerstörten Gewebes dar. Der reibungslose Ablauf der Heilung wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Zellen und extrazellulären Komponenten gewährleistet. Durch vielfältige Faktoren kann dieser fein abgestimmte Prozess zum Erliegen kommen, so dass eine chronische Wundheilungsstörung resultiert. Trotz zahlreicher Behandlungsmöglichkeiten chronischer Wunden bleibt jedoch die erfolgreiche Heilung oftmals aus. Die Anwendung von biodegradierbaren Materialen (Biomaterialien) in der Wundheilung wurde in den vergangenen Jahren intensiv erforscht und teilweise erfolgreich am Patienten eingesetzt. An dem Ziel, ein Biomaterial herzustellen, welches alle funktionellen und strukturellen Fähigkeiten gesunder menschlicher Haut mit sich bringt, wird jedoch nach wie vor gearbeitet. In verschiedenen Studien konnte die gute Verträglichkeit und Biodegradierbarkeit des Biopolymers PLGA, bestehend aus Lactat und Glycolsäure, bereits gezeigt werden. In der vorliegenden Dissertation wurden dreidimensionale (3D)-Gerüste (Scaffolds) aus PLGA hinsichtlich ihrer Wechselwirkungen mit humanen dermalen Fibroblasten (Fb) untersucht. Dermale Fb leisten einen entscheidenden Beitrag zur erfolgreichen Wundheilung, da sie unter der Einwirkung diverser Wachstumsfaktoren zur Migration ins Wundgebiet sowie zur Neusynthese und Reorganisation extrazellulärer Matrix (ECM) befähigt sind. In den Untersuchungen wurden grundlegende Kenntnisse zum Verhalten der Zellen bezüglich Proliferation sowie Synthese nativer ECM in den PLGA-Scaffolds gewonnen und das Migrationsverhalten der Fb in das Biomaterial untersucht. Dabei zeigte sich, dass dermale Fb in den PLGA-Scaffolds nicht nur proliferieren sondern auch einen ausgeprägten Matrixstoffwechsel aufweisen. Sie sind in der Lage, Kollagen und Hyaluronsäure, wichtige Bestandteile der ECM, abzulagern. Zudem konnte mit Hilfe der Arbeit der Einfluss von Wachstumsfaktoren sowohl auf relevante ECM-Komponenten im 3D-Kultursystem als auch auf das Migrationsverhalten der Fb in das Biomaterial verdeutlicht werden. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass 3D-PLGA-Scaffolds geeignete Substrate zur Kultivierung dermaler Fb darstellen. Die zukünftig geplante Weiterentwicklung und Funktionalisierung dieses Biopolymers für den Einsatz in der Wundheilung scheint somit viel versprechend.

Der TRPV3 (transient receptor potential vanilloid 3)-Kanal ist ein nicht-selektiver, Kalzium-permeabler Kationenkanal, der hauptsächlich in epidermalen Keratinozyten exprimiert wird (Peier et al., 2002). Eine genaue Regulierung der Kalzium-Dynamik in der Epidermis der Haut spielt bei der Bildung der Hautbarriere eine entscheidende Rolle, wodurch viele Aspekte der Epidermisfunktion, einschließlich der Proliferation, Differenzierung und Migration der Keratinozyten, kontrolliert werden (Bikle & Mauro, 2014; S. E. Lee & Lee, 2018). Bei näherer Betrachtung des Einflusses des TRPV3-Kanals auf die Hauthomöostase deuten aktuelle Studien darauf hin, dass der TRPV3-vermittelte Einstrom von Kalziumionen in Keratinozyten die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren induziert (Cheng et al., 2010; Xu et al., 2006). Daher kann jedes Ungleichgewicht in der TRPV3-Aktivität drastische Auswirkungen auf die gesunde Funktion der Haut haben, wobei eine Kanalüberaktivität mit Hyperkeratose und Entzündungen der Haut in Verbindung gebracht werden kann. Diese Störungen der Haut sind unter anderem für Hauterkrankungen wie der atopischen Dermatitis und dem schwerwiegenden Olmsted-Syndrom, das durch gain-of-function-Mutationen des TRPV3-Kanals verursacht wird, charakteristisch (Lin et al., 2012; Yamamoto-Kasai et al., 2013). Darüber hinaus kann eine Kanalunterfunktion mit einer beeinträchtigten Hautregeneration und Wundheilung korreliert werden (Aijima et al., 2015; Miyamoto et al., 2011). Diesbezüglich wurde gezeigt, dass der TRPV3-Kanal mit dem Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-Rezeptor) einen Signalkomplex bildet, um die Bildung der Hautbarriere zu regulieren, wobei die Aktivität von TRPV3 wahrscheinlich durch die Aktivierung des EGF-Rezeptors verstärkt wird (Cheng et al., 2010). Der TRPV3-Kanal wird ebenso durch verschiedene natürliche Verbindungen, wie Carvacrol und Thymol, oder durch synthetische Substanzen, wie 2-Aminoethoxy-diphenylborat (2-APB) aktiviert, wobei 2-APB häufig zur Untersuchung der Funktion von TRPV3 in vitro angewendet wird, da es sich hierbei um einen kostengünstigen und relativ potenten TRPV3-Aktivator handelt. 2-APB wirkt jedoch auch auf eine Vielzahl anderer TRP-Kanäle, sodass es schwierig ist, die Effekte, die durch 2-APB in nativen Geweben ausgelöst werden, auf eine Aktivierung des TRPV3-Kanals zurückzuführen (Hinman, Chuang, Bautista, & Julius, 2006; Hu et al., 2004; M. Li, Jiang, & Yue, 2006; Togashi, Inada, & Tominaga, 2008; Vogt-Eisele et al., 2007; Chokshi, Fruasaha, & Kozak, 2012; Lievremont, Bird, & Putney, 2005). Bei der früheren Durchführung eines Wirkstoffscreenings einer ChemBioNet Substanzbibliothek wurde der TRPV3-selektive Inhibitor 26E01 identifiziert (Bischof et al., 2020). Um weitere potente und spezifische TRPV3-Modulatoren zu identifizieren, wurde eine hausinterne Substanzbibliothek bestehend aus 50 chemischen Verbindungen, die im Labor von Thomas Magauer synthetisiert wurden, und die SelleckChem-Substanzbibliothek L1700 bestehend aus 4718 Verbindungen gescreent. In dieser Arbeit ist die Identifizierung, Validierung und erste Anwendung des neuen, potenten, TRPV3-selektiven Aktivators KS0365 beschrieben. Durch die Anwendung dieses neuartigen TRPV3-Aktivators konnte im Rahmen dieser Studie gezeigt werden, dass TRPV3-Aktivatoren den Reepithalisierungsprozess nach einer Verletzung der Haut fördern könnten. Diese Schlussfolgerung ist auf die in dieser Studie festgestellte Beobachtung zurückzuführen, dass infolge der Aktivierung des TRPV3-Kanals mit KS0365 in den Leading-Edges von Keratinozyten und in migrierenden Keratinozyten, die im Rahmen von Migrationsassays am Rande der erzeugten Lücke lokalisiert waren, die stärksten Anstiege der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ausgelöst wurden und KS0365 wahrscheinlich aufgrund dieser Effekte eine Beschleunigung der Keratinozytenmigration bewirkte.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 1 2. Einleitung 5 2.1 Die Funktion von Kalzium in der Haut 5 2.2 Ionenkanäle in Keratinozyten 8 2.3 Der TRPV3-Kanal 10 3. Zielstellung und Methodenwahl 17 4. Materialien und Methoden 21 4.1 Kultivierung immortalisierter Zelllinien 21 4.2 Isolierung primärer Keratinozyten 22 4.3 Erzeugung einer stabilen m308kTRPV3-YFP-Zelllinie 23 4.4 Interne Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie 24 4.5 Small-interfering RNA (siRNA)-vermittelter Knockdown 24 4.7 Wirkstoffscreening 26 4.8 Hit-Validierung durch Erstellung von Konzentrations-Wirkungsbeziehungen 27 4.9 Selektivitätstestung 27 5.0 Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 27 5.1 Ratiometrisches Kalzium-Imaging 28 5.2 Elektrophysiologische Untersuchungen 29 5.3 Bestimmung der metabolischen Zellaktivität 29 5.4 Zellmigrations-Assays 30 5.5 Kalzium- Imaging mittels interner Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie 30 5.6 Daten-Analyse 31 6. Ergebnisse 33 6.1 Wirkstoffscreening und Bestimmung von Konzentrations-Wirkungsbezie- hungen 33 6.2 Selektivitätstestung des neuen TRPV3-Aktivators KS0365 38 6.3 Validierung des siRNA-vermittelten TPRV3-Knockdowns 42 6.4 Kalzium-Imaging in primären Keratinozyten 44 6.5 Elektrophysiologische Untersuchungen 45 6.6. Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 49 6.7 Evaluierung der Langzeit-Tolerabilität von TRPV3-Modulatoren 50 6.8 Zellmigrations-Assays 53 6.9 Kalzium-Imaging in migrierenden Keratinozyten 58 7.0 Analyse von Kalzium-Signalen in der Leading-Edge von Keratinozyten mittels TIRF-Mikroskopie 60 8. Diskussion und Ausblick 63 9. Zusammenfassung der Arbeit 75 10. Referenzen 79 11. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95 12. Lebenslauf 96 13. Publikationen 96 14. Wissenschaftliche Poster und Vorträge 96 15. Danksagung 97

Diabetes mellitus ist ein entscheidender Risikofaktor in der Entstehung chronischer Wunden. Hyperglykämien, oxidativer Stress und Mikro- sowie Makroangiopathien führen zu einer pathologisch veränderten Wundheilung. Erhöhte Konzentrationen pro- inflammatorischer Zytokine, neutrophiler Granulozyten, Matrix-Metalloproteasen (MMPs) und geringere Expression von Wachstumsfaktoren resultieren in einem persistierenden Inflammationszustand mit Beeinträchtigung aller Phasen der Wundheilung. Eine offene Wunde begünstigt die bakterielle Besiedlung mit Entwicklung eines polymikrobiellen Biofilms und möglicher Entstehung einer chronischen Wunde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, herauszufinden, ob die Lokaltherapie mit Polyvinylpyrrolidon-Iod (PVP-I) und liposomalem Polyvinylpyrrolidon-Iod-Hydrogel (PVP-ILH) zu einer Biofilmreduktion in diabetischen Wunden führt. Außerdem soll untersucht werden, welchen Einfluss beide Antiseptika auf die diabetische Wundheilung, insbesondere Gewichtsveränderung, Wundgröße, Neoangiogenese (CD31), Gewebeinflammation (CD45), Wundkontraktion (Smooth Muscle Actin α (α-SMA) und Remodeling (MMP-9) sowie durch Bestimmung von Interleukin-1α (IL-1α) im murinen Serum auf die systemische Inflammation haben. Dazu wurden Untersuchungen an einem Staphylococcus aureus – Biofilm im in – vivo – Rückenhautkammermodell der diabetischen Maus (BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb (Db/Db)) nach lokaler Wundtherapie mit PVP-I oder PVP-ILH durchgeführt. PVP-I und PVP-ILH bewirkten keine signifikante Reduktion von Biofilmen. Jedoch war eine reduzierte bakterielle Aktivität in oberflächlicher und tiefere Muskelschicht nach PVP- ILH-Therapie zu beobachten, während nach PVP-I-Therapie weiterhin Biofilme in allen Schichten nachweisbar waren. PVP-ILH und PVP-I zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Wundgrößenreduktion. Jedoch wurden signifikant geringere Gewichtsverluste nach PVP- ILH-Therapie und eine nicht signifikante Reduktion von Gewichtsverlusten nach PVP-I- Therapie beobachtet. PVP-ILH und PVP-I zeigten keinen signifikanten Einfluss auf Gewebeinflammation oder Wundkontraktion. PVP-ILH demonstrierte die höchste, jedoch nicht signifikante Neoangiogenese (CD31). Weder PVP-I noch PVP-ILH hatten einen Effekt auf das Remodeling (α-SMA) oder die lokale Inflammation (CD45). PVP-I bewirkte jedoch eine signifikante Reduktion der systemischen Inflammation (IL-1α). Die Daten lassen vermuten, dass PVP-I und PVP-ILH zu einer Bakterienreduktion in chronischen Wunden beitragen, obwohl sie in unserer Studie zu keiner signifikanten Biofilmeradikation führten. Die signifikant geringeren Gewichtsverluste in der mit PVP-ILH behandelten Gruppe sowie die signifikant geringere systemische Inflammation in der mit PVP-I behandelten Gruppe verdeutlichen positive Effekte beider Antiseptika in der Lokaltherapie Biofilm-besiedelter chronischer Wunden.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Einführung 2.1 Die Haut des Menschen 2.1.1 Aufbau der Haut 2.1.1.1 Epidermis 2.1.1.2 Dermis 2.1.1.3 Subkutis 2.2 Die Haut der Maus 2.2.1 Aufbau und Vergleich der Haut von Mensch und Maus 2.3 Grundlagen der humanen Wundheilung 2.3.1 Physiologische Wundheilung 2.3.1.1 Inflammationsphase 2.3.1.2 Proliferationsphase 2.3.1.3 Remodeling 2.3.2 Diabetische Wundheilung 2.3.2.1 Chronische Wunden 2.4 Biofilme 2.4.1 Entstehung eines Biofilms 2.4.2 Herausforderungen durch Biofilm-Besiedlung 2.5 Behandlung Biofilm-besiedelter, chronischer Wunden 2.5.1 Topische Antiseptika zur Behandlung Biofilm-besiedelter chronischer Wunden 2.5.1.1 Polyvinylpyrrolidon-Iod(PVP-Iod) 2.5.1.2 LiposomalesPolyvinylpyrrolidon-Iod-Hydrogel(PVP-ILH) 2.6 Überblick translationaler Mausmodelle der Wundheilung 2.6.1 Das Rückenhautkammermodell (RHK) 2.6.2 Leipziger Rückenhautkammer und Modifikation für diabetische Mäuse 2.6.3 Vorversuche mit dem Leipziger Rückenhautkammermodell 3 Aufgabenstellung 4 Materialien und Methoden 4.1 Materialien 4.1.1 Chemikalien 4.1.2 Medikamente 4.1.3 Antikörper für die Immunhistochemie 4.1.4 Verwendetes ELISA-Kit zur Serum-ELISA 4.1.5 Geräte und sonstige Materialien 4.1.6 Programme 4.1.7 Versuchstiere 4.2 Methoden 4.2.1 Studienaufbau 4.2.2 Implantation der Rückenhautkammer (RHK) 4.2.3 Intravital-Mikroskopie 4.2.4 Histologie 4.2.4.1 EinbettungundSchnittederGewebeproben 4.2.4.2 Hämatoxylin-Eisen-Färbung(HE-Färbung) 4.2.5 Immunhistochemie 4.2.6 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 4.2.7 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.8 Wundgrößenmessung 4.2.9 Auswertung der Immunhistochemie 4.2.10 Randomisierung der Versuchsgruppen mittels Random Group Generator 4.3 Statistische Auswertung 5 Ergebnisse 5.1 In – vivo - Ergebnisse 5.1.1 Gewichtsverlauf 5.1.2 Blutzuckerkontrollen 5.1.3 Wundgrößenmessungen 5.2 In – vitro - Ergebnisse 5.2.1 Histologie mit HE-Färbung 5.2.2 Immunhistochemie 5.2.3 FISH - Analyse 5.2.4 Serum-ELISA 6 Diskussion 6.1 Blutzuckerspiegel der Versuchstiere 6.2 Gewichtsverlust während des Versuchszeitraums 6.3 Einfluss von PVP-I und PVP-ILH auf die Wundgrößenreduktion 6.4 Einfluss von PVP-I und PVP- ILH auf die Gewebeinflammation (CD45) 6.5 Effekt von PVP-I und PVP- ILH auf die Neoangiogenese (CD31) 6.6 Einfluss von PVP-I und PVP-ILH auf den EZM- und Kollagenabbau (MMP-9) 6.7 Effekt von PVP-I- und PVP-ILH auf die Fibrogenese (α-SMA) 6.8 Einfluss der topischen PVP-I- und PVP-ILH-Behandlung auf die IL - 1α – Konzentration im murinen Serum 6.9 Effekt von PVP-I und PVP-ILH auf die Biofilmeradikation 6.10 Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die diabetische Wundheilung 7 Zusammenfassung 8 Literatur 9 Anlagen 9.1 Abbildungsverzeichnis 9.2 Tabellenverzeichnis 9.3 Lebenslauf 9.4 Publikationen 9.5 Danksagung 10 Eigenständigkeitserklärung

Die aufgrund des demografischen Wandels steigende Zahl an Patienten mit Knochendefekten, chronischen Wunden und einhergehender Multimorbidität stellt ein großes klinisches und sozioökonomisches Problem dar. Derzeitige etablierte Verfahren zur Behandlung von Knochen- und Hautdefekten weisen zahlreiche Nachteile auf, weshalb die Erforschung innovativer Methoden notwendig ist. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Wundheilungskapazität ist die Funktionalisierung von Biomaterialien mit Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), die eine Rolle bei der Geweberegeneration spielen. Glykosaminoglykane (GAGs) sind wichtige ECM-Komponenten, von denen bekannt ist, dass sie mit Mediatorproteinen interagieren, wodurch sie deren biologische Aktivität und damit zelluläre Prozesse beeinflussen. Native GAGs, wie Heparansulfat, sind jedoch aufgrund ihrer eingeschränkten Verfügbarkeit, Charge-zu-Charge-Variabilität und ihrer quellenabhängigen biologischen Aktivität nur begrenzt für biomedizinische Anwendungen geeignet. Daher sind chemisch modifizierte Hyaluronsäure (HA)- und Chondroitinsulfat (CS)-Derivate mit definierten Eigenschaften bezüglich des Kohlenhydratrückgrats, sowie des Sulfatierungsgrades und -musters besonders geeignet, um ihre Struktur-Eigenschaftsbeziehung in der Interaktion mit heilungsrelevanten Mediatorproteinen und Zellen zu untersuchen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, mit denen GAGs zelluläre Prozesse direkt oder indirekt durch Bindung von Wachstumsfaktoren beeinflussen. Hierbei sollte vor allem gezeigt werden, wie Kohlenhydratrückgrat, Sulfatierungsgrad und -muster der GAG-Derivate die Interaktion und damit die biologische Aktivität des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF)-β1, sowie der angiogenen Mediatoren vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)165 und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) beeinflussen. In vorangegangen Studien wurde gezeigt, dass sulfatierte HA- (sHA) und CS-Derivate stark mit Wachstumsfaktoren, wie den knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP)-2/-4 und TGF-β1 wechselwirken. Letzterer wies eine beeinträchtigte Bioaktivität in Gegenwart von hochsulfatierter HA (sHA3) auf. Der zugrundeliegende Mechanismus wurde bisher nicht vollständig aufgeklärt und daher in dieser Arbeit untersucht. Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Untersuchungen mit allen Komponenten des TGF-β1:Rezeptor-Komplexes in Anwesenheit von GAGs zeigten, dass die Vorinkubation von TGF-β1 mit sHA-Derivaten die Bindung von TGF-β1, insbesondere an TGF-β Rezeptor (TβR)-I, aber auch an TβR-II, blockierte. In sequentiellen SPR-Experimenten, welche die in vivo-TGF-β1:Rezeptor-Komplexbildung genauer nachahmen, war jedoch die Rekrutierung von TβR-I zum TβR-II/TGF-β1-Komplex signifikant stärker, wenn der Komplex sHA3 enthielt. GAGs üben somit einen dualen Blockierungsmechanismus auf die TGF-β1:Rezeptor-Komplexbildung aus, wobei die Effekte stark von der Reihenfolge der Bindungsereignisse abhängen. Die hier erstmals untersuchte Bioaktivität von TGF-β1 in Verbindung mit sHA auf Rezeptorebene zeigte eine Abnahme der Phosphorylierung für TβR-I und das TβR-I-regulierte Effektorprotein Smad2 in Gegenwart von sHA3, was auf die Bildung eines inaktiven Signalkomplexes hindeutet. Ebenfalls analysiert wurde die Struktur-Eigenschaftsbeziehung von HA- und CS-Derivaten in ihrer Wechselwirkung mit den wichtigsten angiogenen Wachstumsfaktoren: VEGF165 und bFGF. Ziel war es strukturelle Eigenschaften zu identifizieren, die zu einer Interaktion beitragen und die biologischen Konsequenzen von Wachstumsfaktor/GAG-Interaktion zu ermitteln. Beide Wachstumsfaktoren zeigten eine sulfatierungsabhängige Wechselwirkung mit GAG-Derivaten in der SPR-Bindungsanalyse. Anders als bFGF zeigte VEGF165 außerdem eine klare Präferenz für sHA im Vergleich zu CS-Derivaten, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung mit diesem Wachstumsfaktor nicht nur vom Sulfatierungsgrad, sondern auch vom Kohlenhydrat-Rückgrat des GAGs beeinflusst wird. sHA-Tetramere waren ausreichend, um mit VEGF165 und bFGF in SPR-Messungen zu interagieren und zeigten, dass die Position der Sulfatierung eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit beiden angiogenen Wachstumsfaktoren zu spielen scheint, da die Bindungsstärke des sHA-Tetrasaccharids ohne C6-Sulfatierung des N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Vergleich zu einem ausschließlich an der C6-Position sulfatiertem Derivat geringer war. Interessanterweise war die Bindung von tetramerer persulfatierter HA (psHA) im Vergleich zu einem psHA-Hexamer stärker, was darauf hinweist, dass das Tetrasaccharid in der Lage ist, mit zusätzlichen GAG-Bindungsstellen von VEGF165 und bFGF zu interagieren. Die Bindung von VEGF165 und bFGF an ihre jeweiligen Rezeptoren VEGF Rezeptor (VEGFR)-2 und FGF Rezeptor (FGFR) 1 war vermindert, wenn die Wachstumsfaktoren in SPR-Studien mit sulfatierten GAGs vorinkubiert wurden. Auch hier wurde für VEGF165 ein Einfluss des Kohlenhydratrückgrats nachgewiesen, da die Bindung des Wachstumsfaktors an VEGFR-2 durch sHA-Derivate stärker gehemmt wurde als durch CS-Derivate mit vergleichbarem Sulfatierungsgrad. Auch auf die bFGF/FGFR1IIIc-Interaktion hatte die Sulfatierung der C6-Position des GlcNAc von sHA1 einen stärkeren Einfluss als die C4-Sulfatierung des GlcNAc von CS. Im Gegensatz dazu war die Blockierungskapazität von sCS3 und sHA3 jedoch ähnlich. Dies deutet auf einen geringen Einfluss des Kohlenhydratrückgrats, jedoch auf einen großen Einfluss des gesamten Sulfatierungsgrades der GAG-Derivate auf die bFGF-Wechselwirkung mit FGFR1IIIc hin. Tetramere GAGs waren ebenfalls ausreichend, um die VEGF165- und bFGF-Rezeptorbindung zu stören. Mit zunehmendem Sulfatierungsgrad und Länge des Derivats wurde der Blockierungseffekt verstärkt. Die Interaktion von VEGF165 mit sHA3 und die anschließende Blockierung der VEGFR-2-Bindung führte zu einer verminderten Phosphorylierung von VEGFR-2. In einem 3D in vitro-Angiogenese-Assay zeigte sich darüber hinaus eine verminderte VEGF165- bzw. bFGF-vermittelte Sprossung von Endothelzell-Sphäroiden durch hochsulfatierte GAGs. Die Angiogenese wurde jedoch nicht vollständig inhibiert. Interessanterweise induzierten GAG-Derivate unabhängig von den untersuchten angiogenen Wachstumsfaktoren die Sprossung von Endothelzell-Sphäroiden. Es konnte gezeigt werden, dass VEGFR-2 nicht an der proangiogenen Wirkung von sulfatierten GAGs beteiligt ist, während die Blockierung von FGFR1 die proangiogene Wirkung von sCS3 und sHA3 hemmt. GAG-Derivate könnten FGFR1 direkt aktivieren, da in SPR-Experimenten gezeigt wurde, dass sie an den Rezeptor binden. Andererseits könnte der beobachtete Effekt auch auf eine erleichterte Rezeptordimerisierung mit einer anschließenden verstärkten Ligandenbindung oder die Wechselwirkung mit intrazellulären Targets nach GAG-Internalisierung zurückzuführen sein. Dies muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Die Ergebnisse weisen auf die Wichtigkeit der Reihenfolge der Bindungsereignisse hin, da die Bindung von GAG-Derivaten an Wachstumsfaktoren, Rezeptoren oder beide Komponenten zu unterschiedlichen zellulären Konsequenzen hinsichtlich der Signalgebung führt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass GAG-Derivate unterschiedliche molekulare Mechanismen nutzen, um zelluläre Prozesse direkt oder indirekt über die Bindung von Wachstumsfaktoren zu modulieren und tragen zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirkungsweise bei. Dies könnte wiederum eine Abstimmung der Biomaterial-zusammensetzung auf patientenspezifische Bedürfnisse ermöglichen. GAG-haltige Bio-materialien sind vielversprechend für eine Verminderung TGF-β1-gesteuerter lokaler Hautfibrose, da sie die Bioaktivität von TGF-β1 reduzieren. In Bezug auf die inhibitorischen Effekte auf die VEGF165- und bFGF-Signaltransduktion könnten GAGs mit übermäßiger Angiogenese, die bei rheumatoider Arthritis und diabetischer Retinopathie auftritt, interferieren. Ob diese in vitro-Ergebnisse zur Steuerung der biologischen Aktivität von TGF-β1, VEGF165 und bFGF oder zur direkten Stimulation der Angiogenese unabhängig von Wachstumsfaktoren genutzt werden können, muss in vivo validiert werden. / Age-related pathologies, like chronic wounds and impaired fracture healing are a consequence of a longer life expectancy in our aging population and are associated with considerable clinical and socioeconomic burdens. To improve the wound healing capacity of patients, the development of new adaptive biomaterials to selectively control and promote bone and skin regeneration is essential. A promising approach for the design of such biomaterials incorporates elements of the extracellular matrix (ECM) that play a role in tissue regeneration. Glycosaminoglycans (GAGs) are major ECM components known to interact with important mediator proteins, thereby influencing their biological activity and subsequently cellular processes. However, native GAGs like heparan sulfate have a limited utility for biomedical applications due to their restricted availability, batch-to-batch variability and source-dependent biological activity. For this reason, chemically modified hyaluronan (HA) and chondroitin sulfate (CS) derivatives with defined properties regarding the carbohydrate backbone, the degree of sulfation and the sulfation pattern are preferable for studying their structure-function relationship in the interaction with mediator proteins and cells relevant to healing processes. The aim of the present study was to investigate how GAGs influence cellular processes - directly or indirectly by binding growth factors – and particularly how the sugar backbone as well as the sulfation degree and pattern of GAG derivatives influence the interaction and thus the biological activity of transforming growth factor (TGF)-β1, and the angiogenic mediators vascular endothelial growth factor (VEGF)165 and basic fibroblast growth factor (bFGF). Sulfated HA (sHA) and CS derivatives were reported to strongly interact with growth factors like bone morphogenetic proteins (BMP)-2/-4 and transforming growth factor (TGF)-β1. The bioactivity of the latter was impaired in the presence of highly sulfated HA (sHA3), the underlying mechanism of which is so far not fully elucidated. In the present thesis the interaction of all components of the TGF-β1:receptor complex with sHA was examined by surface plasmon resonance (SPR), showing that pre-incubation of TGF-β1 with sHA derivatives blocked the binding of TGF-β1 in particular to TGF-β receptor (TβR)-I, but also to TβR-II. In sequential SPR experiments that mimicked the in vivo TGF-β1:receptor complex formation more closely, however, recruitment of TβR-I to the TβR-II/TGF-β1 complex was significantly stronger if the complex contained sHA3. GAGs thus exert a dual blocking effect on TGF-β1:receptor complex formation, with the effects strongly depending on the order of binding events. The bioactivity of TGF-β1 in conjunction with sHA at the receptor level, which was investigated here for the first time, showed a decrease of phosphorylation for TβR-I and the TβR-I-regulated effector protein Smad2 in the presence of sHA3, indicating of the formation of an inactive signaling complex. Also analyzed was the structure-function relationship of HA and CS derivatives in their interaction with the most important angiogenic growth factors, namely vascular endothelial growth factor (VEGF)165 and basic fibroblast growth factor (bFGF). The aim was both to identify structural properties that contribute to an interaction and to determine the biological consequences of growth factor/GAG interaction. Both growth factors showed a sulfation-dependent interaction with GAG derivatives in SPR binding analysis. Unlike bFGF, VEGF165 also showed a clear preference for sHA compared to CS derivatives, indicating that the interaction with this growth factor is not only impacted by the degree of sulfation but also by the carbohydrate backbone of the GAG. sHA tetramers were sufficient to interact with VEGF165 and bFGF in SPR measurements. The position of sulfation appears to play an important role in the interaction with both angiogenic growth factors, as the binding strength of the sHA tetrasaccharide with no C6-sulfation of the N-acetylglucosamine (GlcNAc) was lower compared to a derivative exclusively sulfated at the C6 position. Interestingly, binding of tetrameric persulfated HA (psHA) was stronger compared to hexameric psHA, indicating that the tetrasaccharide is able to bind to additional regions of VEGF165 and bFGF. Binding of VEGF165 and bFGF to their respective receptors VEGF receptor (VEGFR)-2 and FGF receptor (FGFR) 1 decreased if the growth factors were pre-incubated with sulfated GAGs in SPR studies. For VEGF165, an influence of the carbohydrate backbone was visible again, since the inhibition of growth factor binding to VEGFR-2 by sHA derivatives was stronger than for CS derivatives with comparable degree of sulfation. For bFGF/FGFR1IIIc interaction, sulfation of the C6 position in GlcNAc of low-sulfated sHA had a stronger impact compared to the C4 sulfation in GlcNAc of CS, while blocking capacity of sCS3 and sHA3 was similar. This suggests a minor influence of the carbohydrate backbone on bFGF interaction with FGFR1IIIc in the presence of GAG derivatives, but a major influence of the overall degree of sulfation. Tetrameric GAGs were already sufficient to interfere with VEGF165 and bFGF receptor binding, but the blocking effect was enhanced with increasing sulfation and chain length of the derivative. The interaction of VEGF165 with sHA3 and the subsequent blocking of VEGFR-2 binding led to an impaired phosphorylation of VEGFR-2. Furthermore, the induction of endothelial cell spheroid sprouting mediated via VEGF165 or bFGF was diminished by high sulfated GAGs as displayed in a 3D in vitro angiogenesis assay. However, angiogenesis was not completely abolished. Interestingly, GAG derivatives induced the sprouting of endothelial cell spheroids independent of the studied angiogenic growth factors. It could be shown that VEGFR-2 is not involved in the pro-angiogenic action of sulfated GAGs, while FGFR1 appears to play a role as blocking it inhibited the pro-angiogenic effect of sCS3 and sHA3. GAG derivatives might directly activate FGFR1 as they bound to the receptor in SPR experiments, but the observed effect might also be due to facilitated receptor dimerization with a subsequent enhanced ligand binding, or to an interaction with intracellular targets after GAG internalization; this needs to be clarified in further experiments. Findings point to the importance of the order of binding events, as binding of GAG derivatives to growth factors, receptors or both leads to different cellular outcomes regarding signaling. Results of the present thesis show that GAG derivatives employ different molecular mechanisms to modulate cellular processes – both directly or indirectly via growth factor binding - and contribute to a deeper understanding of their mode of action, which might allow to tune the biomaterial composition to patient-specific needs. GAG-containing biomaterials are promising candidates to interfere with TGF-β1-driven local skin fibrosis, as they reduce the bioactivity of TGF-β1. Concerning the inhibitory effects on VEGF165 and bFGF signaling, an application of GAGs to interfere with the excessive angiogenesis, occurring in rheumatoid arthritis and diabetic retinopathy could be of interest. Whether these in vitro findings can be used to control the biological activity of TGF-β1, VEGF165 and bFGF or to directly stimulate angiogenesis independent of growth factors needs to be validated in vivo.