Les hyperplasies micronodulaires pigmentées de la surrénale (PPNAD) sont les tumeurs endocrines les plus fréquentes d’un syndrome multinéoplasique d’origine génétique, le Complexe de Carney. Ces hyperplasies bilatérales sont associées à des mutations inactivatrices de PRKAR1A, le gène codant la sous-unité régulatrice R1 de la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA). Ces tumeurs bénignes conduisent à une activation constitutive de la PKA responsable d’un hypercortisolisme indépendant de l’ACTH (syndrome de Cushing), associant diverses comorbidités telles que l’obésité centrale, le diabète, l’ostéoporose, des troubles de l’humeur ou encore des complications cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes de cette tumorigenèse restent mal compris. Afin d’évaluer les conséquences de l’activation de la signalisation PKA sur l’induction tumorale et l’activité endocrine, l’équipe a précédemment généré un modèle de souris transgéniques reproduisant l’inactivation de Prkar1a dans la corticosurrénale. Ces souris développent une hyperplasie bilatérale composée de cellules présentant des caractéristiques fœtales naturellement absente d’une surrénale adulte. L’objectif général de ce travail de thèse était d’identifier l’origine des cellules constituant cette hyperplasie retrouvée dans le cortex interne des souris mutantes. Nous avons utilisé pour cela une approche génétique de lignage cellulaire afin de tracer chez la souris, l’origine de ces tumeurs après invalidation de Prkar1a dans les précurseurs du cortex définitif ou dans ceux du cortex fœtal. Les résultats montrent que l’activation de la signalisation PKA dans le cortex surrénalien adulte est suffisante pour promouvoir le développement d’hyperplasies surrénaliennes associées à la mise en place d’un syndrome de Cushing. L’invalidation de Prkar1a dans les précurseurs du cortex fœtal ne conduit à aucune anomalie endocrine ni tumorale. En revanche, l’activation de la signalisation PKA dans le cortex adulte favorise le renouvellement cellulaire centripète, l’identité fasciculée et sa conversion en identité réticulée dans la partie interne. L’activation de la signalisation PKA, conjointement à la croissance corticale, apparait donc comme un moteur possible de l’adrénarche, normalement restreinte aux grands primates.L’analyse transcriptomique des surrénales et les expériences de lignages cellulaires montrent que la prédisposition des femelles au syndrome de Cushing et au développement d’hyperplasies « pseudo-réticulée » pourraient reposer sur un dimorphisme sexuel des capacités de recrutement des cellules progénitrices et sur le métabolisme du cholestérol.En parallèle de ces travaux, l’exploration des mécanismes conduisant à la présence inappropriée de cellules « pseudo-réticulée » nous a amené à tester l’implication de la SUMOylation dans les défauts de zonation observés. Nos résultats montrent que l’activation de la signalisation PKA in vitro et in vivo exerce une hypoSUMOylation globale, d’origine transcriptionnelle. En accord avec cet effet, les nodules présents chez les patients atteints de PPNAD sont hypoSUMOylés. Enfin nous montrons chez les deux espèces, un gradient de SUMOylation régionalisé dans le cortex qui suggère l’implication de cette modification dans la zonation de la glande surrénale. / Primary Pigmented Nodular Adrenal Disease (PPNAD) is the most frequent endocrine manifestation of a rare, dominantly inherited multiple endocrine neoplasia syndrome, the Carney Complex. These bilateral hyperplasia are associated with inactivating mutations of PRKAR1A, the gene encoding the R1 regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase (PKA). These benign tumors lead to constitutive activation of PKA, responsible for an ACTH-independent hypertcortisolism (Cushing's syndrome), associating various comorbidities such as central obesity, diabetes, osteoporosis, mood disorders or cardiovascular complications. However, the mechanisms of tumorigenesis remain poorly understood. In order to evaluate the consequences of activation of PKA signaling on tumor induction and endocrine activity, the team previously generated a model of transgenic mice reproducing the inactivation of Prkar1a in the adrenal cortex. These mice develop bilateral hyperplasia composed of cells with fetal characteristics naturally absent from an adult adrenal gland.The general objective of this thesis was to identify the origin of the cells constituting this hyperplasia found in the internal cortex of the mutant mice. We used a genetic approach of cell lineage to trace the origin of these tumors after deletion of Prkar1a in the precursors of the adult or fetal cortex.The results show that activation of PKA signaling in the adult cortex is sufficient to promote the development of adrenal hyperplasia associated with Cushing's syndrome. The ablation of Prkar1a in the precursors of the fetal cortex does not lead to any endocrine or tumor abnormalities. On the contrary, activation of PKA signaling in the adult cortex promotes centripetal cell renewal, fasciculata identity and its conversion into reticularis identity in the internal part of the gland. The activation of PKA signaling, together with cortical growth, therefore appears to be a possible motor of adrenarche, normally restricted to human and some primates.Transcriptomic analysis of the adrenals and cell lineage experiments show that female predisposition to Cushing's syndrome and development of "pseudo-reticularis" hyperplasia may be based on sexual dimorphism of progenitor cell recruitment capacities and on metabolism of cholesterol.In parallel, the exploration of the mechanisms leading to the inappropriate presence of "pseudo-reticularis" cells led us to test the involvement of SUMOylation in the observed zonation defects. Our results show that the activation of PKA signaling in vitro and in vivo exerts a global hypoSUMOylation, of transcriptional origin. In agreement with this effect, the nodules present in patients with PPNAD are hypoSUMOylated. Finally, we show in both species a regionalized SUMOylation gradient in the cortex that suggests the implication of this modification in the zonation of the adrenal gland.

Les carcinomes cortico-surrénaliens (CCS) sont des tumeurs malignes rares de mauvais pronostic et pour lesquelles les options thérapeutiques efficaces sont inexistantes. Il est donc indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des CCS, afin d’améliorer leur prise en charge. Les deux altérations les plus fréquentes dans les CCS sont une surexpression du facteur de croissance IGF2 et l'activation constitutive de la voie Wnt/β-caténine. Le laboratoire a mis en évidence le rôle oncogénique de la β-caténine à l'aide d'un modèle murin (souris ΔCat) présentant une activation constitutive de la β-caténine dans la cortico-surrénale. Toutefois, la faible pénétrance du phénotype malin suggère la nécessité d'autres altérations pour la progression tumorale. L’objectif initial de ma thèse était de tester le pouvoir oncogénique de IGF2, seul ou en association avec l’activation constitutive de la β-caténine. Les modèles de surexpression de Igf2 dans la cortico-surrénale nous ont permis de montrer que Igf2 n'initie pas le développement de tumeurs cortico-surrénaliennes. Dans un contexte d'activation de la β-caténine, la surexpression de Igf2 favorise le développement tumoral à des stades tardifs. Toutefois la formation de tumeurs malignes reste un évènement rare. Ces résultats suggèrent donc que la surexpression de Igf2 et l'activation de la β-caténine ne sont pas suffisantes dans notre modèle pour induire le développement de CCS. Une analyse rétrospective des données de transcriptome nous a permis de mettre en évidence une surexpression de l’oncogène putatif et histone méthyl-transférase EZH2, qui est associée à un mauvais pronostic. Mes travaux in vitro suggèrent que EZH2 est surexprimé en réponse à une surexpression des facteurs E2F et qu’il pourrait être impliqué dans le contrôle de la prolifération, de l'apoptose et de certaines caractéristiques tumorales des cellules cortico-surrénaliennes humaines H295R. Des inhibiteurs pharmacologiques étant disponibles, EZH2 pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante pour le traitement des CCS. En parallèle de ces travaux, nous avons cherché à identifier les mécanismes impliqués dans la zonation du cortex surrénalien. Au cours du renouvellement tissulaire, les cellules acquièrent d’abord une identité glomérulée puis fasciculée. L'identité de la zone glomérulée repose en partie sur l'activité de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation induit l'expression de gènes essentiels à l'identité de cette zone et inhibe l'identité fasciculée. La différenciation fasciculée des cellules doit donc reposer en partie, sur l'inhibition de cette voie de signalisation. Nous avons donc émis l'hypothèse que la signalisation PKA, activée dans la zone fasciculée par la liaison de l'ACTH à son récepteur MC2R, s'oppose à l'activité de la β-caténine pour permettre la différenciation fasciculée. A l'aide d'approches pharmacologiques et génétiques, nous avons pu mettre en évidence que l'activation de la PKA inhibe la voie Wnt/β-caténine dans le cortex surrénalien et que ceci est à l'origine d'une perte de la zone glomérulée au profit d'une expansion de la fasciculée. L'effet de la PKA sur la voie Wnt résulte au moins en partie de l'inhibition de l'expression de Wnt4 en réponse à l'activation de la PKA. En effet une diminution d'expression de Wnt4 est observée en réponse à l'activation de la PKA dans la cortico-surrénale et l'invalidation de Wnt4 spécifiquement dans le cortex induit un phénotype proche de celui observé lors de l'activation de la PKA. Au delà des mécanismes moléculaires de la zonation, nous avons également montré que l’effet inhibiteur de la PKA sur la signalisation Wnt était capable de s’opposer aux effets oncogéniques de la β- caténine dans la cortico-surrénale. Ces observations pourraient s’avérer pertinentes, la voie de signalisation ACTH/PKA étant inhibée dans les CCS. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare tumour associated with poor prognosis and for which, efficient therapeutic approaches are not available. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in CCS development in order to improve their clinical management. The two most frequent alterations in ACC are overexpression of IGF2 and constitutive activation of β-catenin. Our lab has previously demonstrated the oncogenic activity of β-catenin in the adrenal cortex by developing a mouse model of constitutive β-catenin activation (ΔCat mice). However, the low malignant progression in ΔCat mice suggests that other alterations are necessary for acquisition of malignancy. The initial aim of my thesis was to test the oncogenic potential of IGF2 alone or associated with constitutive β-catenin activation. We showed that overexpression of Igf2 in the adrenal cortex does not trigger adrenal cortex tumourigenesis. In a context of constitutive β-catenin activation, overexpression of Igf2 promotes tumour development at later stages. However the formation of malignant tumours remains a rare event. These data suggest that the overexpression of Igf2 and constitutive activation of β-catenin are not sufficient to trigger malignant tumour progression. Retrospective analysis of available ACC transcriptome data highlighted overexpression of the putative oncogene and histone methyltransferase EZH2 in ACC, which was associated with poor prognosis. My in vitro studies suggest that EZH2 is overexpressed in response to overexpression of E2F transcription factors and that it could be involved in control of proliferation, apoptosis and oncogenic capacities of adrenocortical carcinoma cells H295R. Interestingly, the availability of pharmacologic inhibitors suggests that EZH2 could be a novel therapeutic target for the treatment of ACC. In parallel, we sought to identify the mechanisms involved in zonation of the adrenal cortex. During adrenal cortex renewal, cells first differentiate as glomerulosa before switching to fasciculata as they move within the cortex. Establishment of glomerulosa identity relies on the Wnt/β-catenin pathway, which induces expression of genes involved in glomerulosa differentiation and inhibits fasciculata identity. These data suggest that β-catenin has to be inhibited in order to allow the lineage conversion from glomerulosa to fasciculata. We thus postulated that PKA signalling pathway, which is triggered by ACTH binding to its receptor MC2R in zona fasciculata, played a role in repressing Wnt/β-catenin signalling to allow fasciculata differentiation. Using pharmacologic and genetic models, we have shown that PKA inhibits β-catenin signalling, which leads to loss of zona glomerulosa and expansion of zona fasciculata. The inhibitor effect of PKA on β-catenin pathway could be the result of decreased expression of Wnt4. Indee, a decrease of Wnt4 expression is observed in response to PKA activation and inactivation of Wnt4 in the adrenal cortex phenocopies PKA activation. We have also shown that PKA inhibits oncogenic effects of β-catenin in the adrenal cortex. The observation of decreased ACTH/PKA signalling in ACC suggests that this inhibition could be relevant to human adrenal tumour development.