Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit, einer wenig beachteten, weil meist selbstlimitierend verlaufenden Zoonose. Allerdings kann B. henselae bei Risikogruppen (Kindern, immunsupprimierten Personen) Septikämien, Peliosis hepatis, Bazilläre Angiomatose und andere systemische Erkrankungen verursachen. Mit der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Prävalenz von B. henselae in unserer Hauskatzenpopulation abzuschätzen. Dazu wurden 930 EDTA-Katzenblutproben aus dem gesamten Bundesgebiet kulturell untersucht. Die Anzüchtung erfolgte auf doppelt dick gegossenem Hammelblutagar (7,5%) unter mikroaerophilen Bedingungen (5%CO2) über 4 Wochen. Es konnten 15 Stämme isoliert werden (1,61%). Ein Zusammenhang zwischen Alter der Katzen und kulturellem Ergebnis konnte nachgewiesen werden. 302 Katzenseren wurden auf Antikörper untersucht. Die Seroprävalenz betrug 37%. Dieses Ergebnis korreliert mit kulturellem Befund, Haltungsform, Flohbefall und geographischer Herkunft der Katzen. Mit den Isolaten wurden weitere Untersuchungen (PCR, PFGE, SDS-PAGE) zur Charakterisierung durchgeführt. Die Virulenz des Erregers wurde anhand verschiedener Untersuchungen des Referenzstammes untersucht. B. henselae kann nicht ohne schützendes Medium auf dem Fell des Wirtstieres überleben, benötigt bluthaltige Medien zur Isolierung und läßt sich auch nach längerer Aufbewahrung im Kühlschrank oder nach Einfrieren anzüchten. Aufgrund der geringen Anzahl kulturell positiver Befunde ist es schwierig, eine sichere Aussage zum Vorkommen von B. henselae zu treffen. Allerdings läßt die Seroprävalenz von 37% den Schluss zu, dass der Erreger zu einem nicht geringen Anteil unter den Katzen verbreitet ist. Eine Gefährdung gesunder, erwachsener Menschen besteht dabei nicht, aber für Kinder und immunschwache Personen bergen insbesondere verwilderte oder junge Katzen ein gewisses Risiko. Die Infektkette kann allerdings durch konsequente Flohbekämpfung unterbrochen werden.

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit, einer wenig beachteten, weil meist selbstlimitierend verlaufenden Zoonose. Allerdings kann B. henselae bei Risikogruppen (Kindern, immunsupprimierten Personen) Septikämien, Peliosis hepatis, Bazilläre Angiomatose und andere systemische Erkrankungen verursachen. Mit der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Prävalenz von B. henselae in unserer Hauskatzenpopulation abzuschätzen. Dazu wurden 930 EDTA-Katzenblutproben aus dem gesamten Bundesgebiet kulturell untersucht. Die Anzüchtung erfolgte auf doppelt dick gegossenem Hammelblutagar (7,5%) unter mikroaerophilen Bedingungen (5%CO2) über 4 Wochen. Es konnten 15 Stämme isoliert werden (1,61%). Ein Zusammenhang zwischen Alter der Katzen und kulturellem Ergebnis konnte nachgewiesen werden. 302 Katzenseren wurden auf Antikörper untersucht. Die Seroprävalenz betrug 37%. Dieses Ergebnis korreliert mit kulturellem Befund, Haltungsform, Flohbefall und geographischer Herkunft der Katzen. Mit den Isolaten wurden weitere Untersuchungen (PCR, PFGE, SDS-PAGE) zur Charakterisierung durchgeführt. Die Virulenz des Erregers wurde anhand verschiedener Untersuchungen des Referenzstammes untersucht. B. henselae kann nicht ohne schützendes Medium auf dem Fell des Wirtstieres überleben, benötigt bluthaltige Medien zur Isolierung und läßt sich auch nach längerer Aufbewahrung im Kühlschrank oder nach Einfrieren anzüchten. Aufgrund der geringen Anzahl kulturell positiver Befunde ist es schwierig, eine sichere Aussage zum Vorkommen von B. henselae zu treffen. Allerdings läßt die Seroprävalenz von 37% den Schluss zu, dass der Erreger zu einem nicht geringen Anteil unter den Katzen verbreitet ist. Eine Gefährdung gesunder, erwachsener Menschen besteht dabei nicht, aber für Kinder und immunschwache Personen bergen insbesondere verwilderte oder junge Katzen ein gewisses Risiko. Die Infektkette kann allerdings durch konsequente Flohbekämpfung unterbrochen werden.

Direkter Tierkontakt gehört zu den wirkungsvollsten Elementen des Besuchererlebnisses in Zoologischen Gärten. In Streichelzoos hat der Zoobesucher unkontrollierten und unmittelbaren Kontakt mit kleinen Wiederkäuern und insbesondere mit Ziegen. Diese Anlagen können ein Zoonoserisiko darstellen, da Ziegen asymptomatische Träger von verschiedenen zoonotischen Krankheitserregern sein können und in der Vergangenheit bereits Übertragungen auf den Menschen nach Kontakt mit Streicheltieren nachgewiesen wurden. Es sollte das Vorkommen ausgewählter zoonotischer Pathogene (Shigatoxin-produzierende Escherichia coli (STEC), Coxiella burnetii, Campylobacter spp., Arcobacter spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Enterobacteriaceae mit beta-Laktamasen mit breitem Wirkungsspektrum (ESBL), Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Dermatophyten) bei klinisch gesunden Ziegen in Streichelzoos Zoologischer Gärten in Deutschland untersucht werden. Aus 21 Herden in 14 tiergärtnerischen Einrichtungen in Deutschland wurden 300 klinisch gesunde Ziegen im Rahmen tierärztlicher Routineuntersuchungen beprobt. Der Nachweis von STEC und Salmonella spp. wurde aus Rektaltupfern über die Anzucht auf GCG-Agar versucht. Für Escherichia coli verdächtige Kulturen wurden auf Blutagar überführt und auf ausgewählte Virulenzgene per PCR untersucht. In der Folge wurde eine Serotypisierung vorgenommen. Nach Coxiella burnetii wurde in Vaginaltupfern der 230 weiblichen Tieren der Studie mittels einer real-time PCR (qPCR) gesucht. Campylobacter spp. und Arcobacter spp. aus Rektaltupfern wurden nach Isolation über Selektivnährböden unter mirkoaerophilen Bedingungen jeweils per Multiplex-PCR und qPCR auf Artebene bestimmt. Rektaltupfer wurden nach einer Kälteanreicherung mit folgender Anzucht auf Selektivnährböden auf Yersinia spp. untersucht. Nach Anzucht über einen ESBL-Selektivagar auf Basis von Rektaltupfern wurden verdächtige Kolonien mit einem VITEK-System artbestimmt und auf mögliche Antibiotikaresistenzen untersucht. Beta-Lactamase-Gene wurden mittels PCR identifiziert. Das aus Nasentupfern stammende Untersuchungsmaterial zum MRSA-Nachweis wurde nach Anreicherung einer Kultur auf einem Selektivnährboden zugeführt. Eventuelle Kolonien wurden auf einen Blutagar transferriert und danach per MALDI-TOF massenspektrometrisch untersucht. Positive Proben wurden durch PCR-Microarray untersucht. Mit einer modifizierten Mackenzie-Brush- Methode gewonnene Hautschuppen wurden über einen Pilzagar und einen selektiven Dermatophytenagar untersucht. Demographische Korrelationen zum Auftreten von Campylobacter spp. wurden mit einem exakten Test nach Fisher evaluiert. Campylobacter spp. wurden bei 22,7 %, STEC bei 20,0 % und Arcobacter spp. bei 1,7 % der 300 getesteten Ziegen nach der Kultur aus Rektaltupfern und der folgenden PCR nachgewiesen. Die Prävalenz von Campylobacter spp. war bei juvenilen höher als bei adulten Tieren (53,0 % gegenüber 14.1 %; p<0,0001). Ein Isolat der Art Escherichia fergusonii trug phänotypisch Hinweise auf eine ESBL, die durch den Nachweis des Gens blaCTX-M-1 bestätigt wurde. Aus den Nasentupfern von 20,7 % der beprobten Ziegen konnte Staphylococcus aureus kultiviert werden, darunter auch ein mecC-positiver MRSA. Weder Salmonella spp. noch Yersinia spp. fanden sich in der Stichprobe und auch der Nachweis von Dermatophyten gelang bei einer häufigen Überwucherung durch ubiquitäre Pilze (19,3 %) nicht. Unter den 230 weiblichen Ziegen der Studie gab es bei zwei Tieren positive PCR- Signale für Coxiella burnetii, die nach ausgiebiger Nachbeprobung und epidemiologischer Prüfung als falsch-positiv gewertet werden mussten. Grundsätzlich muss vom Vorhandensein einiger Zoonoseerreger in Ziegenbeständen in Streichelzoos ausgegangen werden, da Campylobacter spp. und STEC regelmäßig in der Stichprobe auftraten. Damit sollte das Risiko der Übertragung zoonotischer Bakterien von Ziegen auf Zoobesucher beim Betrieb entsprechender Anlagen Berücksichtigung finden. Angemessene Informationen und Einrichtungen zum Waschen der Hände und zur Handdesinfektion sollten in jedem Fall zur Verfügung gestellt werden. Zum genaueren Verständnis des vermehrten Auftretens von Campylobacter spp. bei jungen Ziegen sind weitere Untersuchungen notwendig. Die Identifikation von asymptomatischen Ziegen mit einer Dermatophyteninfektion bedarf einer modifizierten Technik.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Geschichte und tiergärtnerische Bedeutung des Streichelzoos 3 2.2 Ausgewählte Zoonoseerreger bei Ziegen 4 2.2.1 Shigatoxin-bildende Escherichia coli 4 2.2.1.1 Erreger 4 2.2.1.2 Bedeutung bei der Ziege 5 2.2.1.3 Bedeutung beim Menschen 5 2.2.2 Coxiella burnetii 5 2.2.2.1 Erreger 5 2.2.2.2 Bedeutung bei der Ziege 6 2.2.2.3 Bedeutung beim Menschen 7 2.2.3 Campylobacter spp. 7 2.2.3.1 Erreger 7 2.2.3.2 Bedeutung bei der Ziege 8 2.2.3.3 Bedeutung beim Menschen 8 2.2.4 Arcobacter spp. 9 2.2.4.1 Erreger 9 2.2.4.2 Bedeutung bei der Ziege 9 2.2.4.3 Bedeutung beim Menschen 10 2.2.5 Salmonella spp. 10 2.2.5.1 Erreger 10 2.2.5.2 Bedeutung bei der Ziege 11 2.2.5.3 Bedeutung beim Menschen 11 2.2.6 Yersinia spp. 12 2.2.6.1 Erreger 12 2.2.6.2 Bedeutung bei der Ziege 12 2.2.6.3 Bedeutung beim Menschen 13 2.2.7 beta-Laktamasen mit breitem Wirkungsspektrum 13 2.2.7.1 Erreger 13 2.2.7.2 Bedeutung bei der Ziege 14 2.2.7.3 Bedeutung beim Menschen 14 2.2.8 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus 15 2.2.8.1 Erreger 15 2.2.8.2 Bedeutung bei der Ziege 15 2.2.8.3 Bedeutung beim Menschen 16 2.2.9 Dermatophyten 16 2.2.9.1 Erreger 16 2.2.9.2 Bedeutung bei der Ziege 17 2.2.9.3 Bedeutung beim Menschen 17 3 Veröffentlichung 19 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten an der Publikation 19 3.2 Publikation 20 4 Diskussion 31 5 Zusammenfassung 35 6 Summary 37 7 Literaturverzeichnis 39 8 Danksagung

Im urbanen Abwasser findet sich eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen, welche ein Risiko für Tier, Mensch und Umwelt darstellen. Um die Integration dieser und vieler weiterer Schadstoffe in den öffentlichen Wasserkreislauf zu verhindern, ist deren Eliminierung durch Klärwerke und die Überwachung dieser Abläufe von besonderer Relevanz. Obwohl die Präsenz mikrobiologischer Parameter dabei bisher lediglich akzessorisch betrachtet wird, sollten besonders Zoonosen im Abwasser aufgrund ihrer hohen Gesundheitsgefahr für Tiere und Menschen Beachtung in den vorgeschriebenen Kontrollen finden. Hierfür eignen sich besonders molekularbiologische Methoden, wie beispielsweise die zeiteffiziente real-time PCR, welche eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Eine Grundvoraussetzung für diesen DNA-basierten Pathogennachweis ist eine schnelle und effiziente Nukleinsäuren-Extraktion am Point-of-Need. Viele existierende Extraktionsverfahren werden diesem Anspruch jedoch aufgrund zeitintensiver und komplexer Protokolle nicht gerecht. Ziel dieser Studie war es, eine Extraktionsmethode für mikrobielle DNA aus Abwasser zu entwickeln, mit welcher Pathogene mittels molekularer Detektionsmethoden wie beispielsweise real-time PCR nachgewiesen werden können. Die Extraktion der DNA des grampositiven Bakteriums S. aureus, des gramnegativen Bakteriums E. coli und des Parasiten C. parvum basierte auf einer „Reverse Purification“. Um einen effizienten Zellaufschluss und DNA-Nachweis zu garantieren, wurde das Verfahren um a) mechanische (Bead Beating), b) chemische (alkalische Inkubation bei Raumtemperatur oder 95 °C) und/oder c) enzymatische (Proteinase K) Vorbehandlungen ergänzt. Das Bead Beating-Protokoll wurde anschließend durch die Variation der Kugelgrößen und den Einsatz von Vortexer oder Hulamixer anstelle eines komplexen Bead Beaters adaptiert. Mithilfe einer Verdünnungsreihe der Pathogene in experimentell kontaminiertem Abwasser wurde das Detektionslimit bestimmt und bei 95 %-iger Wahrscheinlichkeit durch das Wilrich&Wilrich Modell kalkuliert. Zusätzlich dazu wurden die Nukleinsäurekonzentrationen der einzelnen Protokolle mittels NanodropTM (Spektralphotometer) und QubitTM (Fluorometer) gemessen. Die Resultate wurden denen einer Silica-Säulen-basierten Referenzmethode gegenübergestellt. Die effizienteste Methode zum Zellaufschluss der Bakterien steigerte die Extraktionseffizienz gegenüber der Referenzmethode um das Vierfache und beinhaltete eine Kombination aus Bead Beating (mit 0,1mm Glaskugeln und einem Vortexer) und Proteinase K bei 60°C für 10 Minuten. Im Fall von C. parvum erwies sich Proteinase K als effektivste Vorbehandlung (siebenfacher Anstieg der Extraktionsmenge). Basierend auf der etablierten Extraktionsmethode wurde bis zu 0,74 Zellen pro Reaktion von S. aureus, 9,94 Zellen von E. coli und 13,55 Oozysten von C. parvum in experimentell kontaminiertem Abwasser extrahiert und detektiert. Zwischen den detektierten Nukleinsäurekonzentrationen und den ermittelten Extraktionseffizienzen in der real-time PCR wurde keine Korrelation festgestellt. Zur Extraktion mikrobieller DNA aus Abwasser wurde eine Methode für grampositive Bakterien (S. aureus), gramnegative Bakterien (E. coli) und Protozoen (C. parvum) entwickelt, welche eine schnelle und sensitive Erregerdetektion mittels real-time PCR garantiert. Diese Vorteile ermöglichen ein mobil einsetzbares Abwassermonitoring am Point-of-Need.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Mikrobielle Risiken im Abwasser 2.1.1 Staphylococcus aureus 2.1.2 Escherichia coli 2.1.3 Cryptosporidium parvum 2.2 Ablauf der Abwasseraufbereitung in Deutschland 2.3 Abwassermonitoring 2.3.1 Aktuelle Gesetzeslage und Empfehlungen 2.3.2 Zusätzliche Einsatzmöglichkeiten 2.4 Nachweismethoden im Abwasser: der Vergleich zwischen Kultur und real-time PCR 2.5 Extraktionsverfahren mikrobieller DNA 2.5.1 Konventionelle Extraktionsverfahren 2.5.2 Festphasen-Nukleinsäurenextraktion 3 PUBLIKATION 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil der Publikation 3.2 Publikation 4 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNG 5 ZUSAMMENFASSUNG 6 SUMMARY 7 REFERENZEN 8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9 TABELLENVERZEICHNIS 10 ANHANG 11 DANKSAGUNG