La chromatine protège et organise la molécule d'ADN dans le noyau. Sa dynamique est essentielle afin de réguler l'accès direct à l'information génétique encodée dans la séquence de l'ADN durant les processus de la réplication, la transcription et la réparation. Le complexe acétyltransférase TIP60/NuA4 est un régulateur clé de la stabilité et de l'expression du génome, fréquemment dérégulé dans certains cancers. L'analyse de ce complexe multiprotéique a constitué le cœur de mes études doctorales. Mon projet portait sur l'étude de la fonction et de la régulation du complexe au cours de la réparation des dommages de l'ADN. Il s'est ainsi découpé en 3 axes: comprendre le recrutement du complexe TIP60 à la cassure double-brin, sa régulation durant la réparation et sa fonction exacte au cours de la réponse aux dommages. Mon objectif initial était de purifier le complexe TIP60 natif afin d'effectuer des analyses par spectrométrie de masse. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode alliant édition du génome et étude protéomique afin d'améliorer et de faciliter l'exploration des interactions protéiques au sein de complexes à sous-unités multiples comme TIP60. Elle rend possible l'étude des activités biochimiques et des liens structure-fonction. De plus, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles du complexe comme l'acétylation et la phosphorylation. Finalement, j'ai cherché à clarifier la fonction du complexe durant la réparation via l'identification de nouveaux substrats d'acétylation. Ainsi, nous avons identifié MBTD1 comme étant une nouvelle sous-unité stable du complexe, ce qui nous a permis de clarifier la fonction de TIP60. De façon intéressante, l'identification d'un nouveau substrat au sein de la chromatine a éclairci la fonction précoce de TIP60 lors du choix de voie de réparation. Finalement, une fonction plus tardive de TIP60 est suggérée par l'identification de nouveaux substrats non histone au sein de la voie de recombinaison homologue. L'ensemble de ces travaux a permis d'éclaircir la régulation et la fonction de TIP60 au cours de la réparation des cassures double-brin de l'ADN conduisant à une meilleure compréhension des mécanismes d'oncogenèse.

La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours de divers processus nucléaires ayant besoin d’un accès direct à l’ADN tels que la réplication, la transcription ou la réparation des lésions. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés et regroupent les chaperons d’histones, les complexes de remodelage ATP-dépendants, les variants d’histone et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Le complexe acéyltransférase NuA4 responsable de l’acétylation des histones H4 et H2A participe activement à la dynamique de la chromatine au cours de ces processus. Il favorise sa relaxation lors de l’activation de la transcription et de la réparation de l’ADN. Il est le seul complexe acétyltransférase dont l’activité est essentielle chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le but de mon projet de doctorat était de mieux comprendre les mécanismes capables de réguler son activité. Nous avons mis en évidence trois niveaux de régulation de son activité, via (i) son auto-acétylation, (ii) son ciblage à la chromatine de façon spécifique et (iii) directement par son substrat histone. Alors que l’acétylation de la sous-unité Yng2 de NuA4 par le complexe lui-même est importante pour le maintien de l’intégrité du complexe et de son activité, nous avons découvert que NuA4 est capable de s’auto-acétyler in vivo et in vitro sur plusieurs de ces sous-unités et que l’acétylation d’un seule lysine dans le domaine MYST de sa sous-unité catalytique Esa1 est essentielle à l’activité du complexe, sans influencer son intégrité. D’autre part, nous avons caractérisé par des techniques de purification un sous-module de NuA4 composé des facteurs Eaf5, Eaf7 et de la protéine à chromodomaine Eaf3 capable de reconnaître les lysines méthylées, qui serait impliqué dans le ciblage de NuA4 à la chromatine. Ce complexe trimérique est également présent indépendant de NuA4 dans la cellule, et serait localisé de façon préférentielle sur la région codante des gènes. Enfin, les travaux du laboratoire ont montré que les modifications post-traductionnelles présentes sur la queue N-ter de H4 peuvent réguler l’activité de NuA4. La phosphorylation de H4 sur sa sérine 1 inhibe son acétylation sur les lysines adjacentes par NuA4. Alors que nous montrons que cette marque est spécifiquement induite sur la région codante de gènes activés, nos résultats indiquent que cette phosphorylation serait impliquée dans la dynamique de la chromatine au cours de l’élongation de la transcription. / Chromatin, which basic unit is the nucleosome, is a very dynamic structure that requires remodeling during nuclear processes that need to access the DNA such as replication, transcription and DNA damage repair. A number of remodeling factors have been characterized and include histone chaperone, ATP-dependent remodelers, histone variants and post-translational histone modifiers. The NuA4 acetyltransferase complex, responsible for H4 and H2A acetylation, participates in chromatin and nucleosome dynamics associated to these nuclear processes. It was shown to promote chromatin relaxation during transcription activation and DNA repair. NuA4 is the only acetyltransferase complex essential for viability in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The objective of my Ph.D. project was to understand the mechanisms that regulate NuA4’s activity. We brought to the forefront tree different ways to control NuA4’s activity, via its auto-acetylation, its specific targeting to the chromatin and via its histone substrate. While acetylation of the Yng2 subunit of NuA4 by NuA4 itself is important for maintenance of the integrity and activity of the complex, we discovered that NuA4 is capable of in vivo and in vitro auto-acetylation of several of its subunits. In addition, we showed that the acetylation of a single lysine residue located in the MYST domain of the catalytic subunit Esa1 is essential for the activity of the complex and has no effect on its integrity. On another hand, we have characterized a sub-complex of NuA4 composed by the Eaf5, Eaf7 and the chromodomain-containing Eaf3 proteins that are implicated in NuA4 targeting to the chromatin. This trimeric complex is also found in the cell independent of NuA4 and preferentially associated to gene coding region. Finally, published works from our laboratory showed that post-translational modifications of H4 N-ter tail can regulate NuA4 activity. Phosphorylation of H4 serine1 inhibits its acetylation on adjacent lysines by NuA4. We demonstrated that this mark is specifically induced on coding region of active genes and that this phosphorylation would be implicated in chromatin dynamics associated with the transcription elongation process.

La chromatine est une structure essentielle qui régit l'homéostasie cellulaire à travers diverses voies dépendantes de la molécule d'ADN telles que l'expression des gènes, la stabilité du génome, l'apoptose, etc. Ainsi, étudier ses mécanismes de régulation est un enjeu crucial pour comprendre le fonctionnement cellulaire. Un des facteurs clés de la modulation de la structure de la chromatine est le complexe acétyltransférase NuA4/TIP60. En effet, ce complexe multi-protéiques très conservé permet l'acétylation des histones, dont H4, et l'incorporation du variant H2A.Z. Il agit alors sur plusieurs mécanismes cellulaires tels que la réparation des cassures doubles brins d'ADN en favorisant la recombinaison homologue ou encore l'activation de la transcription. C'est pourquoi, il est primordial de comprendre en détails les fonctions de ce complexe. Mon projet de doctorat se découpe en deux parties selon les sous-unités du complexe NuA4/TIP60 étudiées. La première partie concerne la sous-unité MRG15, associée à de nombreux complexes, et donc impliquée dans plusieurs fonctions telles que la régulation de l'épissage ou encore la réparation de l'ADN. Combinant des méthodes d'édition du génome avec des purifications de complexes natif et de spectrométrie de masse, nous avons pu identifier un nouveau complexe, composé des sous-unités BRD8, MRGBP, MRG15/X ainsi qu'une nouvelle sous-unité, EP400NL, initialement décrite comme un pseudogène. Puis, par une technique de séquençage d'ARNs, nous montrons que ce complexe est important pour moduler l'expression de gènes spécifiques. De plus, nous avons étudié le mutant W78A/F105A de MRGBP qui perd l'interaction avec MRG15, et le mutant W172A/Y235A de MRG15 qui n'interagit plus avec les facteurs de réparations PALB2/BRCA2. De ce fait, ces mutants aideraient à la compréhension de la fonction de MRG15 lors de la réparation de l'ADN. La seconde partie de mon doctorat concerne la sous-unité MBTD1. En effet, nous nous sommes intéressés à la fusion entre MBTD1 et le facteur d'épissage ZMYND11. Elle est retrouvée dans des cas de leucémies myéloïdes aigües (LMA). Nous avons montré que les mécanismes oncogéniques de cette fusion sont dépendants de la délocalisation sur les corps des gènes du complexes NuA4/TIP60 induisant une augmentation d'acétylation de H4. Ceci génère alors un défaut transcriptionnel dont une surexpression de l'oncogène Myc et des dérégulations d'épissage alternatif de transcrits spécifiques. De plus, nous avons mis en évidence les résidus essentiels pour l'interaction entre MBTD1 et la sous-unité EPC1, associant alors MBTD1 avec le reste du complexe NuA4/TIP60. Ensemble, ces résultats permettraient le développement de nouveaux outils thérapeutiques pouvant cibler MBTD1 afin de traiter les cas de LMA spécifiques. L'ensemble de ces travaux offre une meilleure compréhension des fonctions du complexe NuA4/TIP60 liées à ses différentes sous-unités, à la fois au niveau transcriptionnel mais également au niveau de la réparation de l'ADN. De plus, ils établissent les mécanismes oncogéniques associées à ce complexe. Ainsi, de futures stratégies thérapeutiques pourraient être développées. / Chromatin is an essential structure that governs cell homeostasis through various DNA molecule-dependent pathways such as gene expression, genome stability, apoptosis, etc. Thus, studying its regulatory mechanisms is a crucial issue in understanding cell functioning. One of the key factors in the modulation of chromatin structure is the acetyltransferase complex NuA4/TIP60. Indeed, this highly conserved multi-protein complex allows the acetylation of histones, including H4, and the incorporation of the H2A.Z variant. It then acts on several cellular mechanisms such as the repair of DNA double strand breaks by promoting homologous recombination or even the activation of transcription. This is why it is essential to understand in detail the functions of this complex. My doctoral project is divided into two parts according to the subunits of the NuA4/TIP60 complex studied. The first part concerns the MRG15 subunit, associated with many complexes and therefore involved in several functions such as the regulation of splicing or DNA repair. Combining genome editing methods with native complex purifications and mass spectrometry analysis, we were able to identify a new complex, composed of the BRD8, MRGBP, MRG15/X subunits as well as a new subunit, EP400NL, initially described as a pseudogene. Then, by an RNA sequencing technique, we show that this complex is important for modulating the expression of specific genes. In addition, we studied the W78A/F105A mutant of MRGBP which loses interaction with MRG15 and the W172A/Y235A mutant of MRG15 which loses its interaction with repair factors PALB2/BRCA2. Thus, these mutants would help to understand the function of MRG15 during DNA repair. The second part of my doctorate concerns the MBTD1 subunit. Indeed, we were interested in the fusion between MBTD1 and the splicing factor ZMYND11 found in cases of acute myeloid leukemia (AML). We then showed that the oncogenic mechanisms of this fusion are dependent on the delocalization of the NuA4/TIP60 complex on the bodies of the genes, leading to an increase of H4 acetylation. This generates a transcriptional alteration including overexpression of the Myc oncogene and deregulation of alternative splicing of specific transcripts. In addition, we have characterized the residues required for the interaction between MBTD1 and the EPC1 subunit, essential for the association of MBTD1 with the rest of the NuA4/TIP60 complex. Together, these results would allow the development of new therapeutic tools that can target MBTD1 to treat specific AML cases. All of this work provides a better understanding of the functions of the NuA4/TIP60 complex linked to its various subunits both at the transcriptional level but also in DNA repair. In addition, they establish the oncogenic mechanisms associated with this complex. Thus, future therapeutic strategies could be developed.

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L’acétylation des histones est associée à une activation transcriptionnelle. Cette acétylation est mise en place par des histone acétyltransférases (HATs) qui sont le plus souvent les sous-unités catalytiques de complexes multiprotéiques. Mon travail concerne plus particulièrement deux complexes contenant l’acétyltransférase Mof, MSL et NSL, ainsi que le complexe HAT Tip60-p400 dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Nos analyses de localistaion sur l’ensemble du génome par ChIP-seq indiquent que MSL, NSL et Tip60-p400 se lient aux gènes activement transcrits et agissent comme des co-activateurs transcriptionnels majeurs dans les mESCs. MSL, NSL et Tip60-p400 ont des rôles à la fois chevauchants mais aussi distincts dans la régulation transcriptionnelle dans les mESCs. Chaque complexe présent un profil distinct de liaison à la chromatine. NSL lie principalement des gènes de ménage. MSL et Tip60-p400 sont également présent les gènes impliqués dans le développement. MSL est directement impliqué dans l’augmentation de l’expression de ces gènes au cours de la différenciation des mESCs. / Histone acetylation is involved in transcriptional activation of genes and is carried out by histone acetyltransferases (HATs), which are part of molecular protein complexes. This study focuses on the genome-wide role of Mof-containing MSL and NSL complexes and the Tip60-p400 complex in mouse embryonic stem cells (mESCs). I have analysed these complexes by ChIP-seq, shRNA knockdown and biochemical approaches. The genome-wide binding studies show that NSL, MSL and Tip60-p400 have a global overlap at promoters, but also bind to specific gene sets. There distinct binding profiles propose distinct roles in transcriptional regulation. MSL is the main H4K16 acetylase in mESCs.NSL binds mainly to housekeeping genes, whereas MSL and Tip60 are also present at developmental genes. Importantly, these developmental genes are directly regulated by MSL during cellular differentiation.

Les glycosides cardiotoniques sont des inhibiteurs des pompes sodium / potassium utilisés pour le traitements des insuffisances cardiaques, qui détiennent également des activités anticancéreuses et épigénétiques récemment caractérisées. Toutefois, dans l’objectif de repositionner ces médicaments comme traitement anticancéreux, les mécanismes sousjacents aux activités anticancéreuses et épigénétiques des glycosides cardiotoniques restent à être déterminés. Dans nos travaux, nous révélons que la proscillaridine A est le glycoside cardiotonique qui détient des activités anticancéreuses et épigénétiques les plus puissantes dans des lignées de cancer du côlon, de leucémies et de sarcomes pédiatrique. De plus, nous avons identifié que l’activité anticancéreuse de la proscillaridine A corrèle positivement avec le niveau d’expression protéique du proto-oncogène MYC dans un panel de 14 lignées cellulaires cancéreuses. Dans les lignées cellulaires exprimants un haut niveau de MYC telles que les lignées leucémiques, la proscillaridine A agit comme un inhibiteur de MYC et module sa stabilité protéique ainsi que la régulation transcriptionnelle et translationnelle de ces cibles. Cette inhibition est induite par la baisse significative de l’expression des enzymes épigénétiques les lysines acétyltransférases (KATs), qui contrôlent l’ajout des résidus d’acétylcoenzyme A sur les histones et sur d'autres protéines dont MYC. La baisse d’expression des KATs résultent à une baisse de l’acétylation des résidus de l’histone 3 et à une reprogrammation de l’acétylome des cellules cancéreuses surexprimant MYC. Ces changements au niveau de la chromatine induisent une reprogrammation transcriptionnelle et phénotypique des cellules surexprimant MYC, qui se traduit par une perte de la transcription des programmes oncogéniques et l’induction des programmes associés à la différenciation cellulaire. Pour finir, nous avons évalué le potentiel synergique anticancéreux et épigénétique de la proscillaridine A avec le médicament épigénétique la décitabine dans des lignées cancéreuses exprimants des niveaux différentiels de MYC. Dans une lignée résistante à la proscillaridine A et exprimant de faible niveau de MYC (lignée de cancer de côlon), la décitabine et la proscillaridine A démontrent des activités épigénétiques synergiques tandis que dans une lignée sensible à la proscillaridine A et surexprimant MYC (lignée de sarcome pédiatrique), la décitabine et la proscillaridine A démontrent des activités antiprolifératives synergiques. Dans ces travaux, nous avons donc démontré le potentiel de repositionner la proscillaridine A dans les cancers surexprimant MYC. Également, nous démontrons le potentiel synergique anticancéreux et épigénétique de la proscillaridine A avec la décitabine et nous suggérons d’étudier cette combinaison de médicaments dans les cancers plus résistants à la proscillaridine A. / Cardiac glycosides are sodium/potassium pomps’ inhibitors used for the treatment of heart failure, and whose anticancer and epigenetic activities have been recently characterized. However, in order to repurpose cardiac glycosides as anticancer drugs, mechanistic studies are required to identify the anticancer and epigenetic mechanism of actions. In our experiments, proscillaridin A exhibited the most powerful anticancer and epigenetic activities in colon cancer, leukemia, and sarcoma cell lines. Moreover, we demonstrated that in a panel of 14 cancer cell lines, proscillaridin A anticancer activities positively correlated with MYC protooncogene expression level. In high MYC expressing cell lines such as leukemia, proscillaridin A inhibited MYC expression through protein destabilization and through transcriptomic and translational regulation of MYC targets. Theses inhibitions are induced by the loss of lysine acetylatransferase (KAT) expressions, which are epigenetic enzymes controlling the addition of acetyl-coenzyme A on histones and other proteins such as MYC. KAT inhibitions are responsible for the global loss of histone 3 acetylation and acetylome reprogrammation in high MYC expressing cancer cells. These chromatin changes induced transcriptomic and phenotypic reprogrammation, defined by a loss of the transcription of oncogenic programs and the induction of cell differentiation. To finish, we evaluated the anticancer and epigenetic synergic potential of proscillaridin A in combination with the epigenetic drug the decitabine in cancer cell lines expressing different MYC levels. In a cancer cell line resistant to proscillaridin A treatments and expressing low MYC level (colon cancer cell line), the combination of decitabine and proscillaridin A demonstrated synergistic epigenetic activity although, in a cell line sensitive to proscillaridin A treatments and expressing high MYC level (sarcoma cell line), the combination of decitabine and proscillaridin A exhibited synergistic anti-proliferative activity. To conclude, we highlighted the potential of repurposing proscillaridin A as an anticancer treatment in high MYC expressing cells. Furthermore, we demonstrated the anticancer and epigenetic synergistic potential of proscillaridin A in combination with decitabine and we propose to study the drug combination in cancers that are resistant to proscillaridin A treatment.