München, Techn. Universiẗat, Diss., 2002.

München, Techn. University, Diss., 2001.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T16:53:03Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves.pdf: 2443761 bytes, checksum: 5bc23ec355573ad0e8f665e326417048 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-05-21T12:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves.pdf: 2443761 bytes, checksum: 5bc23ec355573ad0e8f665e326417048 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-21T12:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves.pdf: 2443761 bytes, checksum: 5bc23ec355573ad0e8f665e326417048 (MD5) Previous issue date: 2006 / As amebas de vida livre são protozoários unicelulares encontrados tanto em solo úmido quanto em ambientes aquáticos. Desenvolvem-se no meio ambiente em solo, poeira e ar; em locais com água sem movimentação, em piscinas, lagos e represas; em soluções de limpeza de lentes de contato; em esgotos, unidades de ar-condicionado, aquecimento e ventilação. Os gêneros com relevância em Saúde Pública são Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia e, mais recentemente, Sappinia. Considerando o reconhecido impacto em Saúde Pública, foi feito um levantamento em Brasília (Distrito Federal) para determinar a presença em amostras ambientais principalmente dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria. Os ambientes de procedência das amostras foram piscinas ao ar livre e solo de jardins. Foram coletadas 34 amostras de piscinas e 15 de solo para tentativas de isolamento dos dois gêneros. Observações a fresco das amostras previamente concentradas e culturas “ïn vitro” foram realizadas. As amostras positivas para o gênero Acanthamoeba foram submetidas à classificação nos grupos I, II e/ou III de Pussard & Pons (1977). Os cistos dos dois gêneros foram medidos ao microscópio óptico de luz incidente calibrado com ocular micrométrica e aumento de 1000 vezes. As formas evolutivas foram documentadas na caracterização fenotípica. De acordo com a presença de maior quantidade de formas evolutivas, 13 isolados foram selecionados dentre as amostras positivas para Acanthamoeba spp e Naegleria spp e nomeados em UnB 1 a UnB 13. Os isolados UnB 1 a UnB 6 foram originados de amostras de piscinas e os isolados UnB 7 a UnB 13, de solo. Todos os isolados exibiram uma alta e eficiente proliferação em meio de cultura não definido, ágar – soja, a 25°C. Foram identificadas fenotipicamente, dentre os isolados, 8 (61%) amostras positivas para Acanthamoeba com morfologia similar aos grupos II e III (baseados no tamanho e morfologia dos cistos) e 8 (61%) para Naegleria. Além dos dois citados acima, o gênero Vannella também foi encontrado em 2 (15%) amostras. As formas evolutivas encontradas foram documentados por fotografia digital. Não foi possível demonstrar a presença de formas flageladas de Naegleria. Concluímos que, conforme a literatura especializada, os gêneros Acanthamoeba e Naegleria são freqüentes na natureza, especialmente nos ambientes pesquisados. A caracterização das espécies e o potencial patogênico das mesmas deverá ser estudado posteriormente para as recomendações de medidas de profilaxia. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Free-living amoebas are unicellular protozoan parasites found in humid soil and aquatic habitats. They develop in soil, dust, air and can also be isolated from motionless water, swimming pools, lakes, dams, contact lenses cleaning solutions, drains, air-conditioner, warming and ventilation units and intestinal lavage fluid. The genera of importance in Public Health are: Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia and Sappinia (recently discovered). Considering the Public Health impact of Acanthamoeba and Naegleria genera, a research was made to verify their existence in environmental samples (openair swimming pools and gardens) in Brasília, Brazil. Some samples from swimming pools (34) and soil (15) were collected in order to verify the presence of free-living amoebas. Direct observation of the samples previously concentrated and in vitro cultures were made. The Acanthamoeba positive samples were classified into the groups I, II and/or III of Pussard & Pons (1977). In an incident light optical microscope, we measured the cysts of the Acanthamoeba and Naegleria genera (1000x magnification); their evolutive stages were registered and phenotypically characterized. Due to the higher number of evolutive stages in comparison with all the Acanthamoeba and Naegleria positive samples, some isolates were selected (UnB 1 to UnB 13). The isolates named UnB 1 to UnB 6 were collected from swimming pools and the isolates named UnB 7 to UnB 13, from soil. We observed an effective and high proliferation in all the isolates with non-defined soy agar culture medium, incubated at 25°C. From all the samples phenotypically identified, the Acanthamoeba genus positive samples represented 61% (8 samples) and showed similarity to the groups II and III of Pussard & Pons (according to the cysts size and morphology); the Naegleria positive samples represented 61% (8 samples). Moreover, we registered the presence of Vannella spp in 15% of the isolates (2 samples). During the experimental tests, we used digital photography to document the evolutive stages seen. It was not possible to demonstrate the presence of the Naegleria flagellated forms. In accordance with the specialized literature, we conclude that Acanthamoeba and Naegleria genera can be frequently seen in nature, especially in soil and water. The characterization of the species and their pathogenic potential should be studied further to recommend prophylaxis.

Mémoire DES : Pharmacie hospitalière et des collectivités : Université de Nantes : 2005. Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 88-92 [86 réf.].

Thesis (Ph. D.)--Virginia Commonwealth University, 2009. / Prepared for: Dept. of Microbiology and Immunology. Bibliography: leaves 69-85. Also available online via the Internet.

O conhecimento a respeito dos fatores que de fato definem a patogenicidade de Acanthamoeba é limitado. A atividade proteolítica apresentada por isolados de Acanthamoeba tem sido associada a funções importantes na patogênese de doenças como ceratite e encefalite granulomatosa amebiana. O presente trabalho avaliou os perfis de atividade proteolítica de meios condicionados de Acanthamoeba isoladas de casos clínicos e do ambiente em gel de zimograma, com o objetivo de caracterizar as proteases secretadas e relacioná-las à capacidade patogênica apresentada pelos isolados nos testes in vivo e in vitro. Os isolados avaliados secretaram quantidades e tipos de proteases diferentes entre si, as quais não foram associadas à origem do isolado, genótipo ou espécie e nem à patogenicidade in vivo de Acanthamoeba. Os modelos in vivo aplicados foram úteis para avaliar a capacidade do mesmo isolado em estabelecer infecções uculares olhos e sistêmicas e diferenciar os isolados quanto ao grau de virulência. Além disso, demonstramos que cepas de origem ambiental são capazes de estabelecer infecções oculares e sistêmicas em animais, destacando o risco que estes protozoários podem oferecer à saúde humana. Em conjunto, nossos dados indicam que, apesar de importantes, testes fenotípicos e genotípicos para verificar diferenças entre isolados não podem prever a virulência dos mesmos, sendo necessário associar estes dados a testes in vivo. / The knowledge about the factors that determine the pathogenicity of Acanthamoeba is limited. The proteolytic activity presented by Acanthamoeba isolates has been associated with important roles in the pathogenesis of diseases such as keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. This study evaluated the profiles of proteolytic activity of Acanthamoeba-conditioned medium from clinical and environmental isolates in zymogram gels, in order to characterize the proteases secreted and relate them to the pathogenic capacity demonstrated by the isolated in in vitro and in vivo tests. The isolates secreted different amounts and types of proteases, which were not associated with the source of the isolate genotype or species, and in vivo pathogenicity of the Acanthamoeba. The in vivo models applied were useful to evaluate the ability of the same strain to establish systemic and eye infections, and to differentiate them in the degree of virulence. Furthermore, we demonstrated that isolates of environmental origin are able to establish ocular and systemic infections in animals, highlighting the risk that this protozoan can offer to human health. Furthermore, our data indicate that, despite important, phenotypic and genotypic tests for detecting differences between isolates cannot predict the virulence of the Acanthamoeba, being necessary to link these data to in vivo tests.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_5885_.pdf: 3244352 bytes, checksum: e5fafdb73fe28c45324cf21dd7acb640 (MD5) Previous issue date: 2012-08-28 / O gênero Acanthamoeba compreende protozoários anfizóicos que estão presentes nos mais diversos ambientes, podendo causar no homem doenças graves, como a ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa. A sua patogenicidade não é inteiramente conhecida, assim como os fatores que determinam a infecção. Para isso, marcadores vêm sendo investigados na tentativa de mensurar a virulência de linhagens dessa ameba. Com o objetivo de esclarecer alguns aspectos biológicos e moleculares de Acanthamoeba, isolados clínicos e ambientais foram obtidos e caracterizados por análise morfológica, molecular e testes de patogenicidade. Foram coletadas amostras de raspado de córnea de pacientes com suspeita de ceratite amebiana e amostras ambientais provenientes de poeira, solo, piscina, água tratada, água do mar e água de inundação, em Vitória e região metropolitana (ES). Todas as amostras foram cultivadas em meio ágar soja. Além da cultura, as amostras de raspado de córnea também foram coletadas em salina de Page e submetidas a uma reação de semi-nested PCR. Culturas positivas para Acanthamoeba, identificadas com base na morfologia dos cistos e trofozoítos, foram selecionadas, clonadas e classificadas nos grupos morfológicos I, II ou III. Para a confirmação do gênero Acanthamoeba dos clones foi realizada PCR com iniciadores gênero-específicos do gene 18S rDNA. A genotipagem dos isolados foi realizada a partir do sequenciamento parcial deste mesmo gene e o potencial patogênico dos isolados clonados foi avaliado por meio de testes de termotolerância e de osmotolerância. Foram coletadas em ágar 90 amostras ambientais, 16 de raspado de córnea e 9 de lentes de contato (LC). Destas, 37 (32 ambientais, 4 clínicas e 1 de LC) foram positivas para Acanthamoeba, sendo obtidos 28 clones (24 ambientais, 3 clínicos e 1 de LC). Desses, 26 apresentaram características morfológicas do grupo II, um do grupo I (solo) e um não foi classificado de acordo com os parâmetros morfológicas de classificação. A PCR confirmou a identificação genérica de todos os isolados obtidos, sendo que os clínicos, o de LC e a maioria dos ambientais sequenciados foram classificados como pertencentes ao genótipo T4. Dentre os isolados ambientais, dois foram agrupados no genótipo T11 (piscina) e um no T1 (poeira). A partir dos testes de termotolerância e de osmotolerância, todos os isolados clonados, clínicos e ambientais, foram considerados potencialmente patogênicos, pois, embora o crescimento à concentração de 1M de manitol não tenha sido observado em todos os isolados, todos cresceram a 37°C. Os resultados deste estudo pioneiro no Espírito Santo confirmam a predominância do grupo morfológico II e do genótipo T4 em isolados clínicos e ambientais de Acanthamoeba e relata no Brasil o isolamento de Acanthamoeba pertencente ao genótipo T1. Este trabalho demonstra também a presença de isolados potencialmente patogênicos no ambiente, inclusive em amostras de água do mar e de água de inundação, o que pode representar um fator de risco para o desenvolvimento de infecções causadas por Acanthamoeba. Além disso, a metodologia utilizada neste estudo poderá ser utilizada para um diagnóstico mais rápido, sensível e específico de ceratite por Acanthamoeba. PALAVRAS CHAVES: Acanthamoeba, isolamento, genotipagem, termotolerância, osmotolerância.

O conhecimento a respeito dos fatores que de fato definem a patogenicidade de Acanthamoeba é limitado. A atividade proteolítica apresentada por isolados de Acanthamoeba tem sido associada a funções importantes na patogênese de doenças como ceratite e encefalite granulomatosa amebiana. O presente trabalho avaliou os perfis de atividade proteolítica de meios condicionados de Acanthamoeba isoladas de casos clínicos e do ambiente em gel de zimograma, com o objetivo de caracterizar as proteases secretadas e relacioná-las à capacidade patogênica apresentada pelos isolados nos testes in vivo e in vitro. Os isolados avaliados secretaram quantidades e tipos de proteases diferentes entre si, as quais não foram associadas à origem do isolado, genótipo ou espécie e nem à patogenicidade in vivo de Acanthamoeba. Os modelos in vivo aplicados foram úteis para avaliar a capacidade do mesmo isolado em estabelecer infecções uculares olhos e sistêmicas e diferenciar os isolados quanto ao grau de virulência. Além disso, demonstramos que cepas de origem ambiental são capazes de estabelecer infecções oculares e sistêmicas em animais, destacando o risco que estes protozoários podem oferecer à saúde humana. Em conjunto, nossos dados indicam que, apesar de importantes, testes fenotípicos e genotípicos para verificar diferenças entre isolados não podem prever a virulência dos mesmos, sendo necessário associar estes dados a testes in vivo. / The knowledge about the factors that determine the pathogenicity of Acanthamoeba is limited. The proteolytic activity presented by Acanthamoeba isolates has been associated with important roles in the pathogenesis of diseases such as keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. This study evaluated the profiles of proteolytic activity of Acanthamoeba-conditioned medium from clinical and environmental isolates in zymogram gels, in order to characterize the proteases secreted and relate them to the pathogenic capacity demonstrated by the isolated in in vitro and in vivo tests. The isolates secreted different amounts and types of proteases, which were not associated with the source of the isolate genotype or species, and in vivo pathogenicity of the Acanthamoeba. The in vivo models applied were useful to evaluate the ability of the same strain to establish systemic and eye infections, and to differentiate them in the degree of virulence. Furthermore, we demonstrated that isolates of environmental origin are able to establish ocular and systemic infections in animals, highlighting the risk that this protozoan can offer to human health. Furthermore, our data indicate that, despite important, phenotypic and genotypic tests for detecting differences between isolates cannot predict the virulence of the Acanthamoeba, being necessary to link these data to in vivo tests.

O conhecimento a respeito dos fatores que de fato definem a patogenicidade de Acanthamoeba é limitado. A atividade proteolítica apresentada por isolados de Acanthamoeba tem sido associada a funções importantes na patogênese de doenças como ceratite e encefalite granulomatosa amebiana. O presente trabalho avaliou os perfis de atividade proteolítica de meios condicionados de Acanthamoeba isoladas de casos clínicos e do ambiente em gel de zimograma, com o objetivo de caracterizar as proteases secretadas e relacioná-las à capacidade patogênica apresentada pelos isolados nos testes in vivo e in vitro. Os isolados avaliados secretaram quantidades e tipos de proteases diferentes entre si, as quais não foram associadas à origem do isolado, genótipo ou espécie e nem à patogenicidade in vivo de Acanthamoeba. Os modelos in vivo aplicados foram úteis para avaliar a capacidade do mesmo isolado em estabelecer infecções uculares olhos e sistêmicas e diferenciar os isolados quanto ao grau de virulência. Além disso, demonstramos que cepas de origem ambiental são capazes de estabelecer infecções oculares e sistêmicas em animais, destacando o risco que estes protozoários podem oferecer à saúde humana. Em conjunto, nossos dados indicam que, apesar de importantes, testes fenotípicos e genotípicos para verificar diferenças entre isolados não podem prever a virulência dos mesmos, sendo necessário associar estes dados a testes in vivo. / The knowledge about the factors that determine the pathogenicity of Acanthamoeba is limited. The proteolytic activity presented by Acanthamoeba isolates has been associated with important roles in the pathogenesis of diseases such as keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. This study evaluated the profiles of proteolytic activity of Acanthamoeba-conditioned medium from clinical and environmental isolates in zymogram gels, in order to characterize the proteases secreted and relate them to the pathogenic capacity demonstrated by the isolated in in vitro and in vivo tests. The isolates secreted different amounts and types of proteases, which were not associated with the source of the isolate genotype or species, and in vivo pathogenicity of the Acanthamoeba. The in vivo models applied were useful to evaluate the ability of the same strain to establish systemic and eye infections, and to differentiate them in the degree of virulence. Furthermore, we demonstrated that isolates of environmental origin are able to establish ocular and systemic infections in animals, highlighting the risk that this protozoan can offer to human health. Furthermore, our data indicate that, despite important, phenotypic and genotypic tests for detecting differences between isolates cannot predict the virulence of the Acanthamoeba, being necessary to link these data to in vivo tests.

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