Thesis (Ph. D.)--Virginia Commonwealth University, 2006. / Prepared for: Dept. of Microbiology and Immunology . Bibliography: leaves 140 - 159. Also available online.

Thesis (M.Sc.) from the Department of Zoology, University of Adelaide, 1975.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T16:53:03Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves.pdf: 2443761 bytes, checksum: 5bc23ec355573ad0e8f665e326417048 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-05-21T12:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves.pdf: 2443761 bytes, checksum: 5bc23ec355573ad0e8f665e326417048 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-21T12:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves.pdf: 2443761 bytes, checksum: 5bc23ec355573ad0e8f665e326417048 (MD5) Previous issue date: 2006 / As amebas de vida livre são protozoários unicelulares encontrados tanto em solo úmido quanto em ambientes aquáticos. Desenvolvem-se no meio ambiente em solo, poeira e ar; em locais com água sem movimentação, em piscinas, lagos e represas; em soluções de limpeza de lentes de contato; em esgotos, unidades de ar-condicionado, aquecimento e ventilação. Os gêneros com relevância em Saúde Pública são Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia e, mais recentemente, Sappinia. Considerando o reconhecido impacto em Saúde Pública, foi feito um levantamento em Brasília (Distrito Federal) para determinar a presença em amostras ambientais principalmente dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria. Os ambientes de procedência das amostras foram piscinas ao ar livre e solo de jardins. Foram coletadas 34 amostras de piscinas e 15 de solo para tentativas de isolamento dos dois gêneros. Observações a fresco das amostras previamente concentradas e culturas “ïn vitro” foram realizadas. As amostras positivas para o gênero Acanthamoeba foram submetidas à classificação nos grupos I, II e/ou III de Pussard & Pons (1977). Os cistos dos dois gêneros foram medidos ao microscópio óptico de luz incidente calibrado com ocular micrométrica e aumento de 1000 vezes. As formas evolutivas foram documentadas na caracterização fenotípica. De acordo com a presença de maior quantidade de formas evolutivas, 13 isolados foram selecionados dentre as amostras positivas para Acanthamoeba spp e Naegleria spp e nomeados em UnB 1 a UnB 13. Os isolados UnB 1 a UnB 6 foram originados de amostras de piscinas e os isolados UnB 7 a UnB 13, de solo. Todos os isolados exibiram uma alta e eficiente proliferação em meio de cultura não definido, ágar – soja, a 25°C. Foram identificadas fenotipicamente, dentre os isolados, 8 (61%) amostras positivas para Acanthamoeba com morfologia similar aos grupos II e III (baseados no tamanho e morfologia dos cistos) e 8 (61%) para Naegleria. Além dos dois citados acima, o gênero Vannella também foi encontrado em 2 (15%) amostras. As formas evolutivas encontradas foram documentados por fotografia digital. Não foi possível demonstrar a presença de formas flageladas de Naegleria. Concluímos que, conforme a literatura especializada, os gêneros Acanthamoeba e Naegleria são freqüentes na natureza, especialmente nos ambientes pesquisados. A caracterização das espécies e o potencial patogênico das mesmas deverá ser estudado posteriormente para as recomendações de medidas de profilaxia. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Free-living amoebas are unicellular protozoan parasites found in humid soil and aquatic habitats. They develop in soil, dust, air and can also be isolated from motionless water, swimming pools, lakes, dams, contact lenses cleaning solutions, drains, air-conditioner, warming and ventilation units and intestinal lavage fluid. The genera of importance in Public Health are: Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia and Sappinia (recently discovered). Considering the Public Health impact of Acanthamoeba and Naegleria genera, a research was made to verify their existence in environmental samples (openair swimming pools and gardens) in Brasília, Brazil. Some samples from swimming pools (34) and soil (15) were collected in order to verify the presence of free-living amoebas. Direct observation of the samples previously concentrated and in vitro cultures were made. The Acanthamoeba positive samples were classified into the groups I, II and/or III of Pussard & Pons (1977). In an incident light optical microscope, we measured the cysts of the Acanthamoeba and Naegleria genera (1000x magnification); their evolutive stages were registered and phenotypically characterized. Due to the higher number of evolutive stages in comparison with all the Acanthamoeba and Naegleria positive samples, some isolates were selected (UnB 1 to UnB 13). The isolates named UnB 1 to UnB 6 were collected from swimming pools and the isolates named UnB 7 to UnB 13, from soil. We observed an effective and high proliferation in all the isolates with non-defined soy agar culture medium, incubated at 25°C. From all the samples phenotypically identified, the Acanthamoeba genus positive samples represented 61% (8 samples) and showed similarity to the groups II and III of Pussard & Pons (according to the cysts size and morphology); the Naegleria positive samples represented 61% (8 samples). Moreover, we registered the presence of Vannella spp in 15% of the isolates (2 samples). During the experimental tests, we used digital photography to document the evolutive stages seen. It was not possible to demonstrate the presence of the Naegleria flagellated forms. In accordance with the specialized literature, we conclude that Acanthamoeba and Naegleria genera can be frequently seen in nature, especially in soil and water. The characterization of the species and their pathogenic potential should be studied further to recommend prophylaxis.

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O microrganismo alvo deste estudo pertence ao gênero Naegleria, que compreende amebas de vida livre amplamente distribuídas ao redor do mundo. Estas possuem estratégias de adaptação em condições de temperatura e pH que envolvem a diferenciação das células para as formas flagelada e cística. A via de biossíntese e incorporação do aminoácido selenocisteína (Sec, U) em N. gruberi foi descrita e, devido à incorporação co-traducional deste aminoácido em resposta a um códon UGA em fase de leitura, possui diversos fatores específicos que tornam a via alvo de estudos moleculares. Dentre os genes identificados, destaca-se o de selenofosfato sintetase (SPS), uma proteína funcionalmente dimérica envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, essencial à síntese de Sec. Diferindo das SPSs homólogas, em N. gruberi a proteína (NgSPS2) é codificada em fusão N-terminal com uma metiltransferase e totaliza 737 aminoácidos. Esta descoberta motivou os objetivos da pesquisa baseada na investigação celular de NgSPS2 nativa nas três diferentes formas de vida de N. gruberi através de ensaios imunoenzimáticos, e a caracterização bioquímica e biofísica da proteína recombinante. A análise dos resultados obtidos por Western blot indicaram que NgSPS2, in vivo, apresenta os dois domínios metiltransferase e SPS separados após a tradução para uma cultura amebóide e, após alcançar a diferenciação de cada uma das formas isoladamente, este resultado se confirmou também para cistos e flagelados. A investigação de N. gruberi em cultura indica o aumento na atividade da via de síntese de selenoproteínas na presença de selênio conferindo resistência às condições de estresse oxidativo. A caracterização bioquímica do domínio C-terminal de NgSPS2, por cromatografia de exclusão molecular analítica e eletroforese não desnaturante, revelou predominância de dímeros em solução, coerente com SPSs homólogas. Os testes de cristalização não resultaram na obtenção de cristais, porém a proteólise limitada permitiu selecionar tripsina como potencial para a clivagem do N terminal do N terminal flexível. A conservação dos resíduos de aminoácidos funcionais em NgSPS2.CTD e seu comportamento em solução confirmam a obrigatoriedade da união de cada monômero e, por isso o domínio metiltransferase adicional pode ser desfavorável à montagem do dímero e in vivo a fusão é desfeita após a tradução. / The target microorganism of the present study belongs to the Naegleria genus. This genus includes free life amoebas widely distributed around the world that, in order to survive in bad temperature and pH environments, developed an adaptive strategy consisting of cells differentiation to flagellate and cystic form. The biosynthesis and incorporation of selenocysteine amino acid (Sec, U) in N. gruberi has been described and, because of the co-translational incorporation of this amino acid in response to a UGA codon during the reading step, this process has several specific factors which make it a target for molecular studies. Among the identified genes, we can highlight the one which encodes the selenophosphate synthetase that is involved in the catalytic conversion of selenite and adenosine triphosphate into selenium phosphate, a necessary step to the Sec synthesis that uses selenide and ATP to produce selenophosphate. SPS from N.gruberi is encoded with an methyltransferase N-terminal fused with the typical SPS C-terminal domain, an open read frame that contains 2211 nucleotides encoding 737 amino acids. This discovery has motivated the initial aims of this project, based on the cellular investigation of SPS2, native on the three different form lifes of N. gruberi, through immunoenzymatic assays, besides a study with the recombinant protein to clarify the biochemistry and biophysics features of NgSPS2. The results indicated that the protein do not keep both domains fused after the translation process, suggesting that they need to be separated to perform their biological function. The investigation of the N. gruberi culture revealed that the cells become less sensitive to stress agent in the presence of selenium, which seems to be correlated with the increasing activity of the selenoprotein synthesis. The biochemistry characterization of the NgSPS2 C-terminal domain, using size exclusion chromatography and electrophoresis under non-denaturing conditions revealed the predominance of dimers in solution according with the typical homologous SPS oligomeric state. The crystallization tests have not resulted in crystal growth; however, the limited proteolysis may be an alternative to optimize the crystallization process. These studies may enlarge the knowledge about the biosynthesis of Sec. in N. gruberi.

O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.

O microrganismo alvo deste estudo pertence ao gênero Naegleria, que compreende amebas de vida livre amplamente distribuídas ao redor do mundo. Estas possuem estratégias de adaptação em condições de temperatura e pH que envolvem a diferenciação das células para as formas flagelada e cística. A via de biossíntese e incorporação do aminoácido selenocisteína (Sec, U) em N. gruberi foi descrita e, devido à incorporação co-traducional deste aminoácido em resposta a um códon UGA em fase de leitura, possui diversos fatores específicos que tornam a via alvo de estudos moleculares. Dentre os genes identificados, destaca-se o de selenofosfato sintetase (SPS), uma proteína funcionalmente dimérica envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, essencial à síntese de Sec. Diferindo das SPSs homólogas, em N. gruberi a proteína (NgSPS2) é codificada em fusão N-terminal com uma metiltransferase e totaliza 737 aminoácidos. Esta descoberta motivou os objetivos da pesquisa baseada na investigação celular de NgSPS2 nativa nas três diferentes formas de vida de N. gruberi através de ensaios imunoenzimáticos, e a caracterização bioquímica e biofísica da proteína recombinante. A análise dos resultados obtidos por Western blot indicaram que NgSPS2, in vivo, apresenta os dois domínios metiltransferase e SPS separados após a tradução para uma cultura amebóide e, após alcançar a diferenciação de cada uma das formas isoladamente, este resultado se confirmou também para cistos e flagelados. A investigação de N. gruberi em cultura indica o aumento na atividade da via de síntese de selenoproteínas na presença de selênio conferindo resistência às condições de estresse oxidativo. A caracterização bioquímica do domínio C-terminal de NgSPS2, por cromatografia de exclusão molecular analítica e eletroforese não desnaturante, revelou predominância de dímeros em solução, coerente com SPSs homólogas. Os testes de cristalização não resultaram na obtenção de cristais, porém a proteólise limitada permitiu selecionar tripsina como potencial para a clivagem do N terminal do N terminal flexível. A conservação dos resíduos de aminoácidos funcionais em NgSPS2.CTD e seu comportamento em solução confirmam a obrigatoriedade da união de cada monômero e, por isso o domínio metiltransferase adicional pode ser desfavorável à montagem do dímero e in vivo a fusão é desfeita após a tradução. / The target microorganism of the present study belongs to the Naegleria genus. This genus includes free life amoebas widely distributed around the world that, in order to survive in bad temperature and pH environments, developed an adaptive strategy consisting of cells differentiation to flagellate and cystic form. The biosynthesis and incorporation of selenocysteine amino acid (Sec, U) in N. gruberi has been described and, because of the co-translational incorporation of this amino acid in response to a UGA codon during the reading step, this process has several specific factors which make it a target for molecular studies. Among the identified genes, we can highlight the one which encodes the selenophosphate synthetase that is involved in the catalytic conversion of selenite and adenosine triphosphate into selenium phosphate, a necessary step to the Sec synthesis that uses selenide and ATP to produce selenophosphate. SPS from N.gruberi is encoded with an methyltransferase N-terminal fused with the typical SPS C-terminal domain, an open read frame that contains 2211 nucleotides encoding 737 amino acids. This discovery has motivated the initial aims of this project, based on the cellular investigation of SPS2, native on the three different form lifes of N. gruberi, through immunoenzymatic assays, besides a study with the recombinant protein to clarify the biochemistry and biophysics features of NgSPS2. The results indicated that the protein do not keep both domains fused after the translation process, suggesting that they need to be separated to perform their biological function. The investigation of the N. gruberi culture revealed that the cells become less sensitive to stress agent in the presence of selenium, which seems to be correlated with the increasing activity of the selenoprotein synthesis. The biochemistry characterization of the NgSPS2 C-terminal domain, using size exclusion chromatography and electrophoresis under non-denaturing conditions revealed the predominance of dimers in solution according with the typical homologous SPS oligomeric state. The crystallization tests have not resulted in crystal growth; however, the limited proteolysis may be an alternative to optimize the crystallization process. These studies may enlarge the knowledge about the biosynthesis of Sec. in N. gruberi.

O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.

Naegleria fowleri (N. fowleri) and Naegleria lovaniensis (N. lovaniensis) are closely related amebae found in the environment. N. fowleri causes Primary Amebic Meningoencephalitis (PAM), a fatal disease of the central nervous system, while N. lovaniensis is nonpathogenic. N. fowleri infection occurs when amebae enter the nasal passages, and migrate to the brain. The molecular mechanisms involved in the pathogenesis of PAM are not well-defined. Therefore, the purpose of this study was to define phenotypic characteristics that may be functionally linked to the pathogenicity associated with N. fowleri. Studies revealed that N. fowleri has a faster growth rate and is more resistant to complement-mediated lysis when compared to N. lovaniensis. Additionally, contact-independent cytotoxicity was observed only for N. fowleri. The ability to invade tissues can be a characteristic that distinguishes pathogens from nonpathogens. Therefore, adhesion to extracellular matrix components (ECM), laminin-1, fibronectin, and collagen I, was assessed. N. fowleri exhibited a higher level of adhesion to ECM components and was shown to invade tri-dimensional ECM scaffolds (matrigel and collagen I) to a greater extent than N. lovaniensis. Scanning electron microscopy revealed that N. fowleri attached on ECM substrata exhibited a spread-out appearance that included the presence of focal adhesion-like structures. Attachment of N. fowleri to ECM components was decreased significantly when amebae were pretreated with trypsin, suggesting a role for a surface protein in this process. Pretreatment of N. fowleri amebae with periodate, a sugar oxidant, led to a decrease in attachment to laminin-1 and fibronectin suggesting that the surface component contained a sugar moiety. Western immunoblotting revealed two integrin-like proteins for both species. However, one with a molecular mass of approximately 70 kDa, was detected at a higher level for N. fowleri. Confocal microscopy indicated that the integrin-like proteins co-localized to the focal adhesion-like structures. An anti-integrin antibody decreased adhesion of N. fowleri to ECM components. Zymographic analysis demonstrated differential expression of proteases occurs when N. fowleri and N. lovaniensis invade ECM components using an in vitro invasion assay. These results indicate a distinction in adhesion to, and invasion of, extracellular matrix proteins between N. fowleri and N. lovaniensis.

We study the evolution of simple cells that are equipped with a genome, a rudimentary gene regulation network at transcription level and two classes of functional genes: motion effectors allow the cell to move in response to nutrient gradients while nutrient importers are required to actually feed from the environment. The model is inspired by the protist Naegleria gruberi which can switch between a feeding and dividing amoeboid state and a mobile agellate state depending on environmental conditions. Simulation results demonstrate how selection in a variable environment affects the gene number and effciency so that the cells can rapidly switch from one expression regime to the other depending on the external conditions.