En esta tesis se ha caracterizado a nivel de especie la ecología del proceso de fermentación industrial de las aceitunas de mesa arbequinas. Los resultados muestran que se establece un equilibrio dinámico entre bacterias lácticas y levaduras. También existe inicialmente un importante número de enterobacterias que desaparecen conforme el pH del medio baja. Lactobacillus pentosus, Candida diddensiae y Candida boidinii han sido las principales especies identificadas. También se ha estudiado a escala piloto una fermentación espontánea comprobando como son los propios microorganismos de la fruta los que se desarrollan durante la fermentación. En la fermentación a escala se estudió el efecto de la sal y el grado de madurez de la aceituna observando que una mayor concentración salina favorece la desaparición de las enterobacterias sin afectar al desarrollo de las bacterias lácticas y un grado de madurez mayor favorece el desarrollo de las bacterias lácticas. El seguimiento de distintos cultivos iniciadores mediante el uso de la PCR GTG5 mostró que L. pentosus es la especie más adecuada para ser empleada como inóculo en el caso de las aceitunas arbequinas así como se comprobó las bondades del uso de una levadura como co-inóculo para favorecer la imposición de la bacteria láctica y aportar estabilidad microbiana. Se estudió la presencia de genes de plantaricinas en una colección de aislados de las especies L. paraplantarum, L. pentosus y L. plantarum observando que las tres especies poseen los mismos genes de plantaricinas y que existe una relación entre los genes que posee una cepa y el origen de aislamiento de la misma. Estudios transcripcionales confirmaron la importancia de la plantaricina S en L. pentosus B96 así como la contribución de otros genes de bacteriocinas expresados a su bioactividad total. PhD Thesis Abstract, Albert Hurtado Fernández-AnchuelaTITLE: Study of the microbial population associated to the fermentation process of arbequina cultivar table olives.DIRECTORS: Cristina Reguant y Nicolas Rozès / In this thesis the ecology of the industrial fermentation process of arbequina table olives has been characterized at species level. The results show that it is established a dynamic equilibrium between lactic acid bacteria and yeasts. Initially there is also a significant number of Enterobacteriaceae that disappear as medium pH falls. Lactobacillus pentosus, Candida diddensiae and Candida boidinii were the main species identified. It has also been studied a spontaneous fermentation at pilot-scale observing the development of wild microorganisms of the olive fruit during the fermentation. In the laboratory fermentation salt and olive maturity effect were studied, noting that a higher salt concentration favored the disappearance of Enterobacteriaceae without affecting lactic acid bacteria development and a greater maturity favored lactic acid bacteria growing. Different starter cultures were followed by means of GTG5 PCR during controlled fermentations. Results showed L. pentosus as the most suitable species to be used as inoculum in the case of arbequina olives. It was observed too the benefits of using a yeast as co-inoculum to favor the imposition of the lactic bacteria and to provide microbial stability. It was studied the presence of plantaricin genes in a collection of isolates of L. paraplantarum, L. pentosus and L. plantarum. The three species have the same plantaricin genes and it was observed a relationship between the genes a strain posses and its isolation source. Transcriptional studies confirmed the importance of plantaricin S in L. pentosus B96 and the contribution of other bacteriocin genes to the total bioactivity of the strain.

Tesis por compendio / The treatment of an industrial wastewater has been carried out in this Doctoral Thesis. This wastewater is the spent brine generated from the lactic Fermentation step during the "Spanish Stile" Table Olives Production (FTOP). An integral treatment is proposed for the FTOP management, which finality is to reuse this effluent as a new brine or as solution for olives conservation. PHYSICO-CHEMICAL The main objective of pre-treatments was to reduce the pollutant concentration in the FTOP, to make easier the subsequent biological treatment. In addition, one of these pre-treatments also had as objective the recovery of the phenolic compounds from these wastewaters. These natural phenols are valuable compounds in the pharmaceutical, cosmetic and food industries. - Organic matter and phenols removal pH adjustment, coagulants and flocculants addition and adsorption with powder activated carbon (PAC) were the techniques selected. Neither pH adjustment nor coagulation and flocculation achieved significant suspended solids and COD removal efficiencies. Therefore, these techniques were not considered as suitable pre-treatments for a subsequent biological treatment. The adsorption process achieved the highest COD and phenols removal percentages. The reaction time was optimized and adsorption was modelled by Langmuir isotherm. - Phenolic compounds recovery A non-ionic polymeric resin as adsorbent and ethanol as desorbent, were used to recover the phenolic compounds. The adsorption and desorption times were optimized; the adsorption process was described by a pseudo-second order kinetics and was fitted to Langmuir isotherm. Additionally, the resin reuse was evaluated. Three kinds of samples were used in the experiments: FTOP, ultrafiltrated FTOP and ultrafiltrated plus nanofiltrated FTOP. BIOLOGICAL TREATMENT Sequential batch reactors (SBR) were used. Experiments consisted of three steps: - Start-up Two strategies for the process start-up were performed for biomass adaptation to the FTOP: 1) adaptation to the simultaneous presence of salt and phenolic compounds of FTOP and 2) pre-acclimation to saline environments using saline synthetic water without phenols and subsequent FTOP addition. The first strategy was the best, which achieved high COD (80%) and phenolic compounds (97%) removal efficiencies. Amounts of Proteobacteria population increased with increasing SBR conductivity. - Optimization process: performance and energy consumption In order to increase the pollutants removal efficiencies three studies were carried out: 1) nutrients optimal relationship in the FTOP was 250:5:1 (COD:Nitrogen:Phosphorous). The SBR performance decreased for a nutrients ratio below the optimal one. No improvement in the SBR performance was observed with excess nutrients addition, 2) the hydraulic retention time decreased from 40 to 16 days when SBR was fed with pre-treated FTOP by adsorption with carbon and 3) the increase and maintenance of mixed liquor temperature at 30ºC did not produce the expected results, driving to a SBR performance lower than that achieved in the SBR working at room temperature. More than 70% of the bacterial population belonged to the Proteobacteria phylum. Dominant ciliate specie (Pseudocohnilembus sp) was identified, which coexists with other flagellate specie (Chilomastix sp) in some periods of the experimental procedure. Aeration time during reaction step was decreased from 22 to 14 hours in order to optimize the energy consumption. The reduction in the reactor yield was negligible. TERTIARY TREATMENT The biological process showed that the 20% of organic matter of the FTOP was non-biodegradable. Thereby; a tertiary treatment including a combined membrane system (ultrafiltration and nanofiltration in a series configuration), was necessary in order to treat the SBR effluent. This system provided a suitable final effluent for its reuse. / En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la depuración de un agua residual industrial, generada durante la producción de aceitunas de mesa al "Estilo Español". En concreto se ha trabajado con las salmueras agotadas de la etapa de fermentación láctica de las aceitunas (FTOP: Fermentation Brine from the Table Olive Processing). Para la depuración de las FTOP se propone un tratamiento integral, cuya finalidad es regenerar estos efluentes y reutilizarlos como salmuera nueva o como líquido de envasado de las aceitunas. PRETRATAMIENTOS Con los pretratamientos se buscó reducir la carga contaminante de las FTOP para facilitar un tratamiento biológico posterior. Otro objetivo fue la recuperación de los compuestos fenólicos presentes en estas aguas residuales, para su posterior valorización dentro de las industrias farmacéuticas, cosméticas y de alimentación. - Eliminación de materia orgánica y fenoles Las técnicas utilizadas fueron la modificación del pH, la adición de coagulantes y floculantes y la adsorción con carbón activo en polvo (CAP). Ni el ajuste de pH ni el empleo de coagulantes y floculantes, ambos con posterior sedimentación, ofrecieron rendimientos de eliminación de sólidos en suspensión y DQO que justificaran su uso previo al tratamiento biológico. Los mayores porcentajes de eliminación de DQO y fenoles se consiguieron con la adsorción. Durante este estudio se optimizó el tiempo de reacción y se correlacionó la adsorción con la isoterma de Langmuir. - Recuperación de compuestos fenólicos Se utilizó una resina polimérica y etanol como desorbente. Se experimento con FTOP filtrada a 60 micras, FTOP ultrafiltrada y FTOP nanofiltrada. Se optimizaron los tiempos de adsorción y desorción, se correlacionó la adsorción con una cinética de pseudo-segundo orden y se ajustó a la isoterma de Langmuir. Además, se evaluó la vida útil de la resina. TRATAMIENTO BIOLÓGICO Se usaron reactores biológicos secuenciales (SBR). Etapas experimentales: - Puesta en marcha Se siguieron dos estrategias de adaptación de la biomasa: 1) adaptación conjunta a alta salinidad y compuestos fenólicos de las FTOP y 2) preadaptación inicial a medios salinos, utilizando un agua sintética salina libre de fenoles, previa a la adición de FTOP. La adaptación conjunta consiguió mayores rendimientos de eliminación de DQO (80%) y compuestos fenólicos (97%). La biomasa bacteriana incrementó su población de Proteobacterias a medida que aumentó la conductividad en los SBRs. - Optimización del proceso: rendimiento y consumo energético Para aumentar el rendimiento de eliminación de los contaminantes se realizaron tres actuaciones: 1) se estableció la relación óptima de nutrientes en las FTOP en 250:5:1 (DQO:Nitrógeno:Fósforo). Se comprobó que el déficit de nutrientes disminuyó el rendimiento del SBR y que un exceso de los mismos no conducía a una mejora significativa, 2) el pretatamiento de las FTOP con carbón permitió reducir el tiempo de retención hidráulico de 40 a 16 días, y 3) el aumento y mantenimiento de la temperatura del licor de mezcla a 30ºC no tuvo el efecto esperado, dando lugar a rendimientos por debajo de los obtenidos en los SBRs a temperatura ambiente. Las Proteobacterias representaron más del 70% de la población bacteriana. En cuanto a la población protista se encontró un único ciliado (Pseudocohnilembus sp), que en algunos casos convivió con otra especie flagelada (Chilomastix sp). Para optimizar el consumo energético se redujo el tiempo de aireación durante la etapa de reacción, pasando de 22 a 14 horas, con una reducción mínima del rendimiento del reactor. TRATAMIENTO TERCIARIO Durante el tratamiento biológico se comprobó que las FTOP contienen aproximadamente un 20% de materia orgánica no biodegradable. Es por ello que se aplicó un tratamiento terciario al efluente obtenido del tratamiento biológico, formado por un sistema de membranas / En la present Tesis Doctoral s'ha dut a terme la depuració d'un aigua residual industrial, generada durant la producció d'olives de taula al "Estilo Español". En concret s'ha treballat en les salmorres esgotades procedents de l'etapa de fermentació làctica de les olives (FTOP: Fermentation Brine from the Table Olive Processing). Per a depurar les FTOP es proposa un tractament integral, en la finalitat de regenerar estos efluents i reutilitzar-los com salmorra nova o com líquid de envasat de les olives. PRETRACTAMENTS Amb els pretractaments es va perseguir reduir la carrega contaminant de les FTOP per facilitar el tractament biològic posterior. Altre objectiu va ser la recuperació dels compostos fenòlics presents en estes aigües residuals, per a la seua posterior valorització dins de les industries farmacèutiques, cosmètiques i d'alimentació. - Eliminació de matèria orgànica i fenols Les tècniques utilitzades foren la modificació del pH, l'adició de coagulants i floculants i l'adsorció amb carbó actiu en pols (CAP). Ni l'ajust de pH ni l'ús de coagulants y floculants, tots dos amb posterior sedimentació, oferiren rendiments d'eliminació de sòlids en suspensió i DQO que justificaren el seu ús de forma prèvia al tractament biològic. Els majors percentatges d'eliminació de DQO i fenols s'aconseguiren amb l'adsorció. Al llarg de l'estudi s'optimitzà el temps de reacció i es va correlacionar l'adsorció amb la isoterma de Langmuir. - Recuperació de compostos fenòlics Es va utilitzar una resina polimèrica i etanol com desorbent. L'experimentació es va fer en FTOP filtrada a 60 micres, FTOP ultrafiltada y FTOP nanofiltrada. S'optimitzaren el temps d'adsorció i el de desorció, es correlacionà l'adsorció amb una cinètica de pseudo-segon ordre i es va ajustar amb la isoterma de Langmuir. A més, es va avaluar la vida útil de la resina. TRACTAMENT BIOLÒGIC Es feren servir reactors biològics seqüencials (SBR: Sequential Batch Reactor). El període experimental es va dividir en tres etapes: - Posada en marxa Es seguiren dos estratègies d'adaptació de la biomassa: 1) adaptació conjunta a l'alta salinitat i compostos fenòlics de les FTOP i 2) preadaptació inicial a mitjos salins, fent servir un aigua sintètica salina lliure de fenols, abans de l'adició de la FTOP. L'adaptació conjunta va aconseguir majorsrendiments d'eliminació de DQO (80%) i compostos fenòlics (97%). La biomassa bacteriana incrementà la seua població de Proteobacteries a mesura que anà augmentant la conductivitat en els SBRs. - Optimització del procés: rendiment i consum energètic Per incrementar el rendiment d'eliminació dels contaminants es feren tres actuacions: 1) es va establir la relació òptima de nutrients en les FTOP en 250:5:1 (DQO:Nitrògeno:Fòsfor). Es va comprovar que el dèficit de nutrients reduí el rendiment del SBR i un excés d'ells no va conduir a una millora significativa, 2) el pretractament de les FTOP amb carbó va permetir reduir el temps de retenció hidràulic de 40 a 16 dies, i 3) l'augment i manteniment de la temperatura del licor de mescla a 30ºC no va tindre l'efecte esperat, donant lloc a rendiments per baix dels obtinguts als SBRs a temperatura ambient. Les Proteobacteries representaren més del 70% de la població bacteriana. En quan a la població protista es trobà un únic ciliat (Pseudocohnilembus sp), que en alguns casos va conviure amb altra espècie flagel·lada (Chilomastix sp). Per optimitzar el consumo energètic es va reduir el temps d'aireació durant l'etapa de reacció, passant de 22 a 14 hores, amb una reducció mínima del rendiment del reactor. TRACTAMENT TERCIARI Durant el tractament biològic es va comprovar que les FTOP contenen aproximadament un 20% de matèria orgànica no biodegradable. Això fa necessari aplicar un tractament terciari al efluent obtingut del del biològic, format per un sistema s'aconseguí un efluent final apte per a la seua / Ferrer Polonio, E. (2017). TRATAMIENTO BIOLÓGICO AEROBIO PARA AGUAS RESIDUALES CON ELEVADA CONDUCTIVIDAD Y CONCENTRACIÓN DE FENOLES [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/83382 / Compendio

Wastewater generated by the industry of table olives production stands out by its high salinity and high organic matter load and phenolic compounds concentration, which are difficult to degrade. These compounds have a double characteristic, on one hand, they have a fitotoxic nature harmful to the ground, but on the other hand, they also possess an antioxidant nature, which has a great interest for the food, cosmetic and pharmaceutic industries. The main aim of this work is the recovery of phenolic compounds from the residual brine generated in the table olives fermentation process. For this purpose, membrane processes, both ultrafiltration (UF) and nanofiltration (NF), and adsorption with resins have been considered. The permeate from the UF was used as feed for the NF step and the NF permeate was submitted to a non-ionic resins adsorption process. The UF and the NF experiments were performed at laboratory scale using flat organic membranes of different molecular weight cut off and material (UP005 and UH030 UF membranes and NF245 and NF270 NF membranes). The following operating conditions were varied: the transmembrane pressure (for each type of membranes, a range of 1 to 3 bar and 5 to 15 bar were considered, respectively), the crossflow velocity (between 2.2 to 3.7 m¿s-1 and 0.5 to 1.5 m¿s-1, for each type of membranes, respectively) and the volume reduction factor. The effect of these parameters on the permeate flux and the recovery of the phenolic compounds was studied. Furthermore, the influence of these parameters on the membrane fouling was analysed and the optimal cleaning protocols were selected. Moreover, the experimental results obtained in the UF step were fitted to mathematical models to predict the evolution of permeate flux with time. Adsorption was performed using a non-ionic resin, and desorption was carried out by using ethanol as a solvent. Results showed that the UF membranes were capable of eliminate nearly all the turbidity of the residual brine, obtaining a permeate stream with a greater purity of phenolic compounds. The best results in terms of permeate flux, chemical oxygen demand elimination and phenolic compounds recovery were reached using a UP005 membrane at 3 bar and 2.2 m¿s-1. The NF membranes could remove practically all the colour of the residual brine and to increase to a greater extent the purity of phenolic compounds in the permeate stream. The best results in terms of permeate flux, chemical oxygen demand elimination and phenolic compounds recovery were obtained using a NF245 membrane at 15 bar and 1.5 m¿s-1. The combination of both membrane processes increased the phenolic compounds/DQO ratio by 60% when compared to the residual brine. The subsequent adsorption step showed that it is possible to recover a high fraction (98 %) of the phenolic compounds (hydroxytyrosol and tyrosol) present in the NF permeate, achieving a high purity (97%), and obtaining also an acid saline stream with low concentration of phenolic compounds. / Las aguas residuales generadas en el proceso de elaboración de aceitunas de mesa destacan por su elevada salinidad y su elevada concentración de materia orgánica y de compuestos fenólicos, los cuales son difíciles de degradar. Estos compuestos tienen una característica dual, por un lado, tienen carácter fitotóxico para el suelo, pero por contra, tienen un fuerte carácter antioxidante, lo que resulta de gran interés para las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. El objetivo principal de este proyecto es la recuperación de los compuestos fenólicos presentes en la salmuera residual del proceso de fermentación de las aceitunas de mesa, mediante la utilización de procesos de membrana, tanto ultrafiltración (UF) como nanofiltración (NF), y adsorción con resinas. El permeado obtenido en la UF fue utilizado como alimentación de la NF, y el permeado obtenido en la NF se sometió a una etapa de adsorción con resinas no iónicas. Los ensayos de UF (UP005 y UH030) y NF (NF245 y NF270) se realizaron a escala de laboratorio con membranas planas orgánicas de distinto corte molecular, variando en cada ensayo la velocidad tangencial (entre 2.2 y 3.7 m¿s-1, y 0.5 y 1.5 m¿s-1, respectivamente), la presión transmembranal (entre 1 y 3 bar, y 5 y 15 bar, respectivamente) y el factor de reducción de volumen. Se estudió cómo afectan estos parámetros a la densidad de flujo de permeado y a la recuperación de compuestos fenólicos. Así mismo, también se estudió el efecto que tienen estos parámetros sobre el ensuciamiento de las membranas y se seleccionaron los protocolos óptimos de limpieza de las mismas. Además, los resultados experimentales obtenidos en los ensayos con las membranas de ultrafiltración se ajustaron a modelos matemáticos para predecir la variación de la densidad de flujo de permeado con el tiempo. La adsorción se realizó con una resina no iónica, y la desorción se realizó utilizando etanol como disolvente. Los resultados obtenidos mostraron que las membranas de UF son capaces de eliminar casi totalmente la turbidez de la salmuera residual, logrando producir una corriente de permeado con un mayor grado de pureza de compuestos fenólicos. Las mejores condiciones de operación en la ultrafiltración, en términos de densidad de flujo de permeado, eliminación de demanda química de oxígeno y recuperación de compuestos fenólicos, se obtuvieron con la membrana UP005 a 3 bar y 2.2 m¿s-1. Las membranas de NF consiguieron reducir casi completamente el color de la salmuera residual y enriquecer más corriente de permeado en compuestos fenólicos. Las mejores condiciones de operación en la nanofiltración, en términos de densidad de flujo de permeado, eliminación de demanda química de oxígeno y recuperación de compuestos fenólicos, se obtuvieron con la membrana NF245 a 15 bar y 1.5 m¿s-1. Mediante la combinación de estos procesos de membranas se aumentó el ratio compuestos fenólicos/DQO un 60% respecto de la salmuera inicial. La adsorción mostró que es posible recuperar una elevada fracción de los compuestos fenólicos, 98%, (hidroxitirosol y tirosol) presentes en la corriente de permeado de la NF con una alta pureza (97%), obteniéndose por otro lado una corriente salina ácida con muy baja concentración de compuestos fenólicos. / Les aigües residual generades en el procés d'elaboració d'olives de taula destaquen per la seua elevada salinitat i la seua elevada concentració de matèria orgànica i de compostos fenòlics, els quals són difícils de degradar. Estos compostos tenen una característica dual, d'una banda, tenen caràcter fitotòxic, i d'un altra, tenen un fort caràcter antioxidant, el que fa que tinguen un gran interès per a les industries alimentaries, cosmètiques i farmacèutiques. L'objectiu principal d'aquest projecte és la recuperació de compostos fenòlics continguts en la salmorra residual del procés de fermentació de les olives de taula, mitjançant l'utilització de processos de membrana, tant d'ultrafiltració (UF), com de nanofiltració (NF), i adsorció amb resines. El corrent de permeat obtingut en la UF va ser utilitzat com alimentació de la NF, i el permeat obtingut en la NF va ser sotmès a una etapa d'adsorció amb resines no iòniques. Els assajos d'UF (UP005 i UH030) i NF (NF245 i NF270) es realitzaren a escala de laboratori amb membranes planes orgàniques de distint tall molecular, variant en cada assaig la velocitat tangencial (entre 2.2 i 3.7 m¿s-1, i 0.5 i 1.5 m¿s-1, respectivament), la pressió transmembranal (entre 1 i 3 bar, i 5 i 15 bar, respectivament) i el factor de reducció de volum. Es va estudiar com afecten aquests paràmetres a la densitat de flux de permeat i a la recuperació dels compostos fenòlics. Així mateix, també es va estudiar l'efecte que tenen aquests paràmetres sota l'embrutament de les membranes i es van seleccionar el protocols òptims de neteja de les mateixes. A més, els resultats experimentals obtinguts en els assajos amb les membranes d'ultrafiltració es van ajustar a models matemàtics per a predir la variació de la densitat de flux de permeat amb el temps. L'adsorció es realitzà amb una resina no iònica, i la desorció es realitzà utilitzant etanol com a dissolvent. Els resultats obtinguts mostraren que les membranes d'UF poden eliminar quasi completament la terbolesa de la salmorra residual, aconseguint produir un corrent de permeat amb un major grau de puresa de compostos fenòlics. Les millors condicions d'operació en la ultrafiltració, en els termes de la densitat de flux de permeat, l'eliminació de la demanda química d'oxigen i la recuperació dels compostos fenòlics, es van obtindré amb la membrana UP005 a 3 bar i 2.2 m¿s-1. Les membranes de NF van aconseguir reduir quasi completament el color de la salmorra residual i enriquir més el corrent de permeat en compostos fenòlics. Les millors condicions d'operació en la nanofiltració, en els termes de la densitat de flux de permeat, l'eliminació de la demanda química d'oxigen i la recuperació de compostos fenòlics, es van obtindré amb la membrana NF245 a 15 bar i 1.5 m¿s-1. Mitjançant la combinació d'aquests processos de membranes s'augmentà el rati de compostos fenòlics/DQO un 60% respecte de la salmorra inicial. L'adsorció va mostrar que es possible recuperar una elevada fracció del compostos fenòlics, 98%, (hidroxitirosol i tirosol) presents en el corrent de permeat de la NF amb una alta puresa (97%), obtenint-se per un altre costat un corrent salí àcid amb una baixa concentració de compostos fenòlics. / Carbonell Alcaina, C. (2017). Recuperación de compuestos fenólicos contenidos en la salmuera residual del proceso de fermentación de las aceitunas de mesa mediante procesos de membrana: combinación de la ultrafiltración y la nanofiltración [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86142