El cicle cellular és el conjunt d'esdeveniments ordenats que permeten a la cèllula donar lloc a dues cèllules filles genèticament idèntiques. Diversos senyals externs i interns regulen aquest procés per a que la cèllula proliferi només en les condicions apropiades. Un punt de control important pel que fa a la coordinació de la proliferació amb el creixement cellular es troba en la fase G1 (punt de restricció), on la cèllula comprova que ha adquirit la massa i la maquinària necessària per la replicació del DNA. Les ciclines D són molècules que juguen un paper clau en la regulació de la fase G1. Les cèllules de mamífer contenen gens que codifiquen per 3 ciclines de tipus D altament homòlogues (D1, D2, D3), que s'expressen de manera específica de teixit i s'associen a Cdk4 o Cdk6 per formar una proteïna quinasa activa. D'aquestes tres ciclines la ciclina D1 és la més estudiada ja que es troba freqüentment superexpressada en molts càncers humans. L'expressió de ciclina D1 i la seva unió a Cdk4 representa un dels esdeveniments més importants, regulats per senyals mitogènics, necessaris per la progressió del cicle cellular a través del punt de restricció. Les cèllules inhibeixen l'entrada en cicle en la fase G1 principalment per dos mecanismes diferents: la disminució de l'expressió de ciclines D i l'augment de les proteïnes KIP que inhibeixen l'activitat residual del complex Cdk4/6ciclina D. Tot i discrepàncies d'origen metodològic, diferents estudis han observat l'acumulació de la ciclina D1 en el citoplasma de cèllules quiescents o diferenciades, suggerint l'existència d'altres mecanismes que podrien regular l'activitat dels complexes Cdk4ciclina D1 a nivell de la seva distribució nucleocitoplasmàtica. D'altra banda, en el nostre laboratori s'havia desvetllat un mecanisme de retenció citoplasmàtica de Cln3, l'homòleg funcional de ciclina D1 en llevat de gemmació, que regula l'entrada en cicle i juga un paper molt important en la coordinació entre creixement i proliferació. Aquests antecedents ens van conduir a plantejar com a hipòtesi de treball d'aquesta tesi doctoral l'existència d'un mecanisme de control de la localització de la ciclina D1 entre el nucli i el citoplasma, que podria tenir un paper especialment rellevant en situacions d'aturada de la proliferació cellular. En aquest treball hem demostrat que la ciclina D1 es localitza en el citoplasma de fibroblasts embrionaris de ratolí quiescents, i que això succeeix per un mecanisme independent de l'export mediat per Crm1. De la cerca d'interactors de ciclina D1 per dihíbrid i copurificació hem identificat la transloquina, una proteïna que havia estat descrita com a important en el procés d'import nuclear de FGF2. En observar durant el nostre treball que FGF2 és un potent estimulador de l'acumulació nuclear de ciclina D1, varem decidir analitzar en detall les seves implicacions funcionals. La superexpressió de transloquina inhibeix l'acumulació nuclear de ciclina D1 en cèllules proliferant. En canvi, la inhibició de l'expressió de transloquina causa l'efecte oposat, és a dir, indueix l'acumulació nuclear de ciclina D1 i la fosforilació de RB per Cdk4 en cèllules sotmeses a condicions de quiescència. En resum, en aquest treball de tesi doctoral hem desvetllat i descrit un mecanisme de retenció citoplasmàtica de la ciclina D1 en fibroblasts embrionaris de ratolí, on la transloquina hi juga un paper important per a mantenir l'estat de quiescència cellular. La transloquina i Cdk4 s'uneixen i competeixen pel mateix domini de ciclina D1 i, donat que cal la formació prèvia del complex Cdk4ciclina D1 per al seu import nuclear, aquest fet permet establir una base molecular senzilla pel propi mecanisme de retenció citoplasmàtica. / El ciclo celular es el conjunto de sucesos ordenados que permiten a la célula originar dos células hijas genéticamente idénticas. Distintas señales internas y externas regulan este proceso para que las células proliferen sólo en las condiciones más apropiadas. Uno de los puntos de control importantes, donde se coordina la proliferación con el crecimiento celular se encuentra en la fase G1 (punto de restricción). En este punto la célula comprueba que ha adquirido la masa y la maquinaria necesaria para la replicación del DNA. Las ciclinas D son moléculas que tienen un papel clave en la regulación de la fase G1. Las células de mamífero contienen genes que codifican para tres ciclina tipo D altamente homólogas (D1, D2, D3), que se expresan de forma específica de tejido y se asocian a Cdk4 o Cdk6 para formar una proteína quinasa activa. Entre las tres ciclinas, la ciclina D1 es la más estudiada, ya que se encuentra sobrexpresada en muchos cánceres humanos. La expresión de ciclina D1 y su unión con Cdk4 representa uno de los acontecimientos más importantes, regulados por señales mitogénicas, necesarios para la progresión del ciclo celular a través del punto de restricción. Las células inhiben la entrada en ciclo en la fase G1 principalmente por dos mecanismos distintos: la disminución de la expresión de ciclinas D y el aumento de las proteínas KIP que inhiben la actividad residual del complejo Cdk4/6ciclina D. A pesar de alguna inconsistencia de origen metodológico, distintos estudios han observado la acumulación de la ciclina D1 en el citoplasma de células quiescentes o diferenciadas, sugiriendo la existencia de otros mecanismos que podrían regular la actividad de los complejos Cdk4ciclina D1 a nivel de su localización núcleocitoplasmática. Por otro lado, en nuestro laboratorio se había descrito un mecanismo de retención citoplasmática de Cln3, el homólogo funcional de ciclina D1 en levadura de gemación, que regula la entrada en ciclo y juega un papel muy importante en la coordinación entre crecimiento y proliferación. Estos antecedentes nos llevaron a plantear, como hipótesis de trabajo de esta tesis doctoral, la existencia de un mecanismo de control de localización de ciclina D1 entre el núcleo y el citoplasma, que podría tener un papel relevante en situaciones de detención de la proliferación celular. En este trabajo hemos demostrado que la ciclina D1 se localiza en el citoplasma de fibroblastos embrionarios de ratón quiescentes, y que además sucede por un mecanismo independiente del exporte por Crm1. De la búsqueda de interactores de ciclina D1 por dihíbrido y copurificación hemos identificado la transloquina, una proteína cuya implicación ya se había descrito en el proceso de importe nuclear de FGF2. Además, durante nuestro trabajo observamos que FGF2 es un potente estimulador de la acumulación nuclear de ciclina D1. La sobreexpresión de transloquina inhibe la acumulación nuclear de ciclina D1 en células proliferando. En cambio, la inhibición de la expresión de transloquina causa un efecto opuesto, induce la acumulación nuclear de ciclina D1 y la fosforilación de RB por Cdk4 en células sometidas a condiciones de quiescencia. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral hemos identificado un mecanismo de retención citoplasmática de la ciclina D1 en fibroblastos embrionarios de ratón, donde la transloquina juega un papel importante para mantener el estado de quiescencia celular. La transloquina y Cdk4 se unen y compiten por el mismo dominio de ciclina D1, y puesto que la formación del complejo Cdk4ciclina D1 es un requisito previo para el importe nuclear, este hecho permite establecer una base molecular sencilla para el propio mecanismo de retención citoplasmática. / The cell cycle is the series of events by which the cell duplicates its contents and divides into two daughter cells identical genetically. This process is regulated by different external and internal signals allowing the cell to proliferate under suitable conditions. Higher eukaryotes control proliferation and growth in late G1 at the restriction point, where they ensure that enough appropriate nutrients and extracellular mitogens are present to enter a new cell cycle and initiate DNA replication. Dtype cyclins are a key target in the regulation of G1 phase. Mammalian cells contain genes encoding three highly homologous Dtype cyclins (D1, D2, D3) that associate in a tissue specific manner with either Cdk4 or Cdk6 to form an active protein kinase. Among them, cyclin D1 is the most studied because its overexpression is frequently present in human tumors. Mitogendriven upregulation of cyclin D1 levels and assembly into active complexes with Cdk4/6 are key events for exit from quiescence and G1 progression in mammalian cells. Quiescent cells are thought to inhibit cell cycle entry mainly by two different mechanisms: downregulation of Dtype cyclin expression and upregulation of KIP proteins to inhibit residual Cdk4/6cyclin D activity. However, cytoplasmic accumulation of cyclin D1 in quiescent or differentiated cells has been observed in different instances, suggesting the existence of other mechanisms to control the nucleocytoplasmic distribution of cyclin D1 as a function of growth signals. On the other hand, we have previously characterized a cytoplasmic retention device that sequesters Cln3, the functional homologue of Dtype cyclins in budding yeast, to regulate G1 progression and cell size homeostasis. Thus, as the initial hypothesis of this doctoral thesis, we asked whether mammalian cells control the nucleocytoplasmic distribution of cyclin D1 as a function of growth signals. In this doctoral thesis we show that cyclin D1 is localized in the cytoplasm in quiescent mouse fibroblasts by a mechanism that does not involve the Crm1 exportin. We have screened for cyclin D1 interactors by twohybrid and coimmunopurification strategies and we have identified translokin, a protein that interacts with FGF2 and facilitates its nuclear import. We have also observed that FGF2 treatment of quiescent cells causes nuclear accumulation of cyclin D1. Overexpression of translokin prevents proper cyclin D1 accumulation in the nucleus of proliferating cells. On the other hand, downregulation of translokin levels results in nuclear accumulation of cyclin D1 and causes Cdk4dependent phosphorylation of RB in quiescent cells. In summary, in the present doctoral thesis we show that cyclin D1 is also subject to an analogous but different cytoplasmic retention mechanism in quiescent mouse fibroblasts. We have identified translokin as an interactor of cyclin D1 that plays an essential role to inhibit its accumulation in the nucleus under quiescence conditions. As translokin interacts with cyclin D1 domains also needed for Cdk4 binding and subsequent nuclear import, we propose that translokin is an essential component of a cytoplasmic retention mechanism of cyclin D1 that prevents cell cycle entry during cellular quiescence.

La matèria orgànica del sòl juga un paper essencial en el cicle global del carboni, allotjant bona part del C que contenen els ecosistemes terrestres. En àrees de muntanya, l’alta variabilitat climàtica associada a la complexitat topogràfica fa que els balanços de C siguin difícils de predir. L’objectiu d’aquesta tesi és en primer lloc estimar el contingut de C dels prats de muntanya del Pirineu i determinar els factors climàtics que determinen la seva distribució al paisatge. En segon lloc analitzar els factors que regulen processos específics que són claus en el cicle del C d’aquests ecosistemes. Mitjançant un mostreig extensiu de perfils edàfics en prats subalpins i alpins del Pirineu, s’estimà que el contingut de C dels prats de muntanya varia entre els 5,9 i els 29,9 kg C m-2. Aquests continguts tendeixen a reduir-se amb l’altitud, però mentre a les zones més baixes els sòls acumulen més C als vessants obacs, a les parts més altes és als solells on es tendeix a acumular més C. Això suggereix que l’acumulació de C al sòl està més relacionada amb les condicions que afavoreixen la producció que no pas amb les que n’afavoreixen la mineralització. La incubació al laboratori de les mostres de sòl dels perfils anteriors ens permeteren determinar els factors de tipus edàfic que són determinants en la mineralització de la matèria orgànica als sòls superficials i subsuperficials. Els resultats mostren que mentre als horitzons superficials la mineralització de la matèria orgànica es relaciona clarament amb la disponibilitat de C, en els sòls subsuperficials tot i que la proporció de C actiu és similar, la disponibilitat de N pren més rellevància. Per tal d’analitzar el component biòtic com a regulador de la mineralització de la matèria orgànica també es van incubar mostres de sòl al laboratori en les quals es van alterar les comunitats microbianes. L’addició d’una font de C làbil (glucosa) enriquida amb 13C permeté distingir el C respirat derivat de la matèria orgànica i de la glucosa. Els resultats indiquen que una font de C làbil estimula la mineralització de C (efecte priming) però la magnitud d’aquest estímul depèn en gran mesura de l’estructura de les comunitats microbianes. Als prats, el C orgànic edàfic prové majoritàriament de les arrels. Per això es va estimar la producció d’arrels, la descomposició d’arrels estàndard i la incorporació del C provinent d’aquestes arrels a les fraccions protegides del sòl en prats subalpins. Els resultats ens mostren que anualment es produeixen uns 400-500 g m-2 d’arrels en els primers 15 cm de sòl, cosa que suposa al voltant de 200 g C m-2, amb una marcada estacionalitat i amb una productivitat relativa a la biomassa que és superior a l’horitzó subsuperficial. D’altra banda, les taxes de descomposició són relativament baixes i no es redueixen amb la fondària, segurament per les millors condicions ambientals al sòl subsuperficial. La incubació al camp d’arrels enriquides amb isòtops estables permeté detectar que durant el primer any entre un 3.5 i un 7% del C incubat es va incorporar a la fracció protegida (associada a llims i argiles). Aquesta matèria orgànica de les arrels incorporada a la fracció protegida era làbil i rica en N. Atesa la progressiva reducció de la pressió de pastura en extenses àrees de muntanya, es simulà un abandonament de pastura per detectar possibles canvis a curt termini en la producció i descomposició d’arrels. Els resultats indiquen un lleuger increment de la producció durant l’estiu en els prats no pasturats i no es detectà cap efecte en la descomposició de les arrels. / La materia orgánica del suelo juega un papel esencial en el ciclo del carbono, albergando la mayor parte del C que contienen los ecosistemas terrestres. En áreas de montaña, la elevada variabilidad climática asociada a la complejidad topográfica hace que los balances de C sean difíciles de predecir. El objetivo de esta tesis es en primer lugar estimar el contenido de C de los pastos de montaña del Pirineo i determinar los factores climáticos que determinan su distribución en el paisaje. En segundo lugar analizar los factores que regulan los procesos clave del ciclo del C en estos ecosistemas. Mediante un muestreo extensivo de perfiles edáficos en pastos subalpinos y alpinos del Pirineo, se estimó que el contenido de C de los pastos de montaña varía entre 5,9 y 29,9 kg C m-2. El contenido de C tiende a reducirse con la altitud, pero mientras en las cotas más bajas los suelos acumulan más C en las umbrías, en las zonas más altas es en las solanas donde tiende a acumularse más. Esto sugiere que la acumulación de C en el suelo está más relacionada con las condiciones que favorecen la producción que con las que favorecen la mineralización. La incubación en el laboratorio de las muestras de suelo de los perfiles anteriores nos permitió determinar los factores de tipo edáfico que son determinantes en la mineralización de la materia orgánica en suelos superficiales y subsuperficiales. Los resultados muestran que así como en los horizontes superficiales la mineralización de C está claramente relacionada con la disponibilidad de C, en los suelos subsuperficiales la disponibilidad de N toma más importancia. Para analizar el papel del componente biótico en la regulación de la mineralización de la materia orgánica también se incubaron muestras de suelo en el laboratorio en las cuales se alteraron las comunidades microbianas. La adición de una fuente de C lábil (glucosa) enriquecida con 13C permitió distinguir el C respirado derivado de la materia orgánica y de la glucosa. Los resultados indican que una fuente de C lábil estimula la mineralización del C (efecto priming), pero la magnitud de este estímulo depende en gran medida de la estructura de las comunidades microbianas. En los pastos, el C del suelo proviene mayoritariamente de las raíces. Por esto se estimó la producción radicular, la descomposición de raíces estándar y la incorporación del C que proviene de estas raíces a las fracciones protegidas del suelo en pastos subalpinos. Los resultados nos muestran qua anualmente se producen unos 400-500 g m-2 de raíces, lo que equivale a unos 200 g C m-2, con una marcada estacionalidad y con una productividad relativa a la biomasa que es superior en el horizonte subsuperficial. Por otro lado, las tasas de descomposición son relativamente bajas y no se reducen con la profundidad, seguramente por las mejores condiciones ambientales en el suelo subsuperficial. La incubación en campo de raíces enriquecidas con isótopos estables permitió detectar que durante el primer año entre un 3,5 y un 7% del C incubado se incorporó a la fracción protegida (asociado a limos y arcillas). Esta materia orgánica de las raíces incorporada a la fracción protegida era lábil y rica en N. Puesto que existe una progresiva reducción de las cargas de pastoreo en extensas zonas de montaña, se simuló el abandono del pasto para detectar posibles cambios a corto plazo en la producción y en la descomposición de las raíces. Los resultados indican un ligero incremento de la producción en verano en los pastos no pastoreados y no se detectó ningún efecto en la descomposición de las raíces. / Soil organic matter plays a key role in the global carbon cycle, storing most of the carbon contained in the terrestrial ecosystems. In mountain areas, the high spatial variability of climate conditions makes C balances difficult to predict. The main aim of this thesis is first to estimate soil C stocks and the environmental factors that determine C accumulation in the soils of the Pyrenean mountain grasslands. Secondly, we aim to analyse the factors that regulates some specific processes of the C cycle in these ecosystems. An extensive sampling in subalpine and alpine grasslands along the Pyrenees revealed that mountain grasslands store between 5.9 and 29.9 kg C m-2. Carbon stocks generally reduced with altitude, but while in the highest altitudes soils accumulated more C in the south-facing slopes, at the subalpine areas was at the north-facing slopes where soil stored more C. This suggests that soil organic C accumulation is enhanced at the sites with the most suitable conditions for plant productivity rather than at the sites with expected low mineralization rates. The laboratory incubation of soil samples coming from these soil profiles allowed determining the soil factors that regulates organic matter mineralisation in surface and subsurface soils. The results indicated that while C availability was the main factor explaining C mineralisation in surface soils, in the subsoil N availability became the most important factor. The role biotic factor in regulating organic matter mineralisation was assessed by incubating soil samples in the laboratory in which microbial community structure was altered. The addition of a labile C substrate (glucose) enriched with 13C allowed to partition the respired C among soil organic matter derived C and glucose-derived C. The results indicated that the addition of a labile C source promotes the C mineralisation through the priming effect, but the magnitude of priming is depends on the structure of microbial communities. Most of organic C in grassland soils derives from root tissues. Hence we estimated belowground production, decomposition rates of standard roots and root-derived C incorporation into the protected pool (associated to silt and clay fractions) in subalpine grasslands. The results showed that these grasslands produce about 400-500 g m-2 y-1 of roots at the top 15 cm, meaning about 200 g C m-2 y-1. This production showed a great seasonality and with higher relative productivity rates in the subsoil than in the top 5 cm. Root decomposition rates quite low and did not decreased with depth, probably because of better microclimate conditions in the subsurface soil. The field incubation of roots enriched with stable isotopes allowed us to detect that between 3.5% and 7% of the incubated C had been incorporated into the protected fraction (associated to silt and clay) during the first year. The root-derived organic matter incorporated into the protected pool was labile and N-enriched. Given the reduction of stocking rates in extensive pastures in mountain areas, we simulated the pasture abandonment to detect short term changes in root production and decomposition. The results indicated a discrete increase of root production in summer in the non-grazed grasslands and no-effects were detected in root decomposition rates.

L'activitat humana és una de les majors causes d'elevades concentracions de nutrients i substàncies tòxiques en els ecosistemes fluvials. Entre la gran varietat de factors que alteren aquests ecosistemes, l'eutrofització i la contaminació per metalls pesants són dos dels principals problemes ambientals en països desenvolupats. Els biofilms fluvials (també anomenats comunitats perifítiques) representen una eina valuosa per avaluar els efectes dels contaminants (ex. nutrients i metalls) en els ecosistemes aquàtics. Aquest treball pretén investigar el destí i els efectes del Cu en els ecosistemes fluvials centrant-se en les comunitats perifítiques. Diferents metodologies han estat desenvolupades i/o adaptades per investigar específicament la dinàmica del Cu, la seva toxicitat i bioacumulació en comunitats perifítiques naturals, i la interacció entre l'eutrofització i la toxicitat del Cu en aquests ecosistemes. / Human activity is one of the major causes of elevated concentrations of nutrients and toxic substances in fluvial ecosystems. Among the many ecosystem stressors, eutrophication and metal pollution are two of the major environmental problems in many developed countries. Fluvial biofilms (periphyton communities) are a useful tool for monitoring the effects of pollutants (e.g. nutrients and metals) into aquatic ecosytems. The present study aims to investigate the fate and effects of Cu in fluvial ecosystems focusing on periphyton communities. Different methodologies have been developed and/or adapted to specifically investigate the dynamics of Cu, its toxicity and bioaccumulation on natural periphyton communities, and the interaction between eutrophication and Cu toxicity in these ecosystems.