Toutes les cellules de l’organisme relarguent de façon constitutive des nucléotides dans l’espace extracellulaire. Ces nucléotides extracellulaires agissent comme des molécules de signalisation, entre autres, via les récepteurs P2Y (P2YRs) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Les P2YRs sont exprimés, pour la majorité, de façon ubiquitaire dans l’organisme. L’analyse phénotypique des lignées de souris knockout pour les P2YRs (P2YR-/-) a permis de confirmer l’importance de cette voie de communication dans différents processus physio/pathologiques. Au sein de notre laboratoire, grâce à l’utilisation de souris P2YR-/-, nous étudions depuis quelques années le rôle de ces récepteurs dans la biologie des cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (MSCs). Ces cellules se caractérisent par une faible immunogénicité et surtout par la propriété de multipotence, i.e. capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires (adipocytes, chondroblastes, ostéoblastes). Cette dernière propriété suscite l’intérêt de la médecine régénérative qui vise à exploiter la multipotence de ces cellules en thérapie cellulaire. Toutefois, leur utilisation à des fins thérapeutiques est encore limitée, notamment parce que les mécanismes régulateurs de ces processus de différenciation sont encore mal compris. Il est donc fondamental de continuer à étudier les voies de signalisation régulant les processus de différenciation de ces cellules pour leurs applications cliniques.Dans ce travail de recherche, nous avons investigué l’implication de la signalisation dépendant des P2YR dans le modèle expérimental des MSCs dérivées du tissu adipeux sous-cutané inguinal (ATMSCs) murin. D’abord, nous avons montré que parmi les 7 sous-types connus de récepteur P2Ys, les ATMSCs expriment le P2Y2R (récepteur à l’ATP et l’UTP) et le P2Y6R (récepteur à l’UDP) et que ces récepteurs sont fonctionnels. Par une approche combinant l’analyse quantitative de leur expression, l’effet de leur activation pharmacologique et enfin l’effet de l’invalidation de leur gène (P2ry2 ou P2ry6), nous avons montré que ces deux récepteurs influencent à des degrés divers le processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs in vitro.Concernant le P2Y2R, nos données montrent que l’expression de son messager diminue dans les ATMSCs différenciées en adipocytes tandis que son activation et que l’invalidation de son gène sont sans effet sur l’intensité de différenciation adipogénique. Par ailleurs, après une différenciation ostéoblastogénique, le niveau d’expression du messager codant P2Y2R n’est pas modifié. Par contre, les ATMSCs P2Y2R-/- ont un potentiel de différenciation ostéoblastogénique diminué par rapport aux WT. Cet effet pourrait être lié à une diminution de l’expression de gènes codant des facteurs de signalisation des voies Wnt et/ou BMP, connues pour contrôler la production d’ostéoblastes à partir des MSCs.Le récepteur P2Y6R semble intervenir à la fois dans l’adipogénèse et l’ostéoblastogénèse des ATMSCs. En effet, l’expression du messager codant P2Y6R n’est pas modulée dans les adipocytes matures et l’activation du récepteur n’a pas d’effet sur le processus de différenciation adipogénique. Par contre, les ATMSCs P2Y6R-/- ont un potentiel de différenciation adipogénique réduit ce qui est corrélé à une diminution de l’expression du messager codant PPARγ2. D’autre part, nous avons constaté que l’augmentation de tissu adipeux est moindre chez les souris P2Y6R-/- âgées sous régime normal ou riche en graisse. Par ailleurs, l’expression du messager codant P2Y6R est diminuée après différenciation ostéoblastogénique. L’activation de P2Y6R par l’UDP altère la maturation complète des ATMSCs en ostéoblastes et l’invalidation du gène P2ry6 augmente l’activité principale de cette phase tardive, c’est-à-dire la production de minéralisation. Ces données suggèrent que la voie UDP-P2Y6R régule négativement le processus de différenciation ostéoblastogénique dans le modèle cellulaire étudié dans ce travail.Avec le modèle pathologique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs), modélisant une différenciation ectopique, nous avons montré que l’invalidation des gènes P2ry2 et P2ry6 affecte la transdifférenciation de ces cellules en cellules minéralisantes.En résumé, notre travail a permis de définir les rôles des P2Y2R et P2Y6R dans les processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs et de transdifférenciation des VSMCs en cellules calcifiantes. Des études complémentaires devront être réalisées pour établir la signification physio/pathologique de ces données expérimentales. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le tissue adipeux (TA) est un organe complexe specialisé dans le stockage et la libération d'énergie sous forme de lipides. Cet organe adipeux est essentiel pour le maintien de l'homéostasie énergétique. Les adipocytes sont les cellules prototypiques du TA. Elles se forment durant la différenciation de précurseurs, un processus appelé adipogenèse. L'adipogenèse est intimement associée à la synthèse des acides gras et de triglycérides lors de la lipogenèse. Néanmoins, divers facteurs peuvent perturber l'adipogénèse et la lipogenèse, contribuant au dysfonctionnement du TA et au développement des maladies métaboliques. Le but de cette thèse a été d'étudier la lipogenèse dans le contexte du stress du réticulum endoplasmiques (SRE), de la restriction calorique et du vieillissement. Dans le projet A, nous avons montré que l'exposition d'adipocytes à un SRE aigu inhibe l'expression des gènes liés à la lipogenèse et empêche l'incorporation du glucose dans les lipides. En plus, l'exposition des préadipocytes à un SRE chronique, détériore à la fois la lipogenèse et l'adipogenèse. Par contre, pour les adipocytes, un SRE chronique mais modéré n'a pas d'effet évident sur la lipogenèse. Ces effets du SRE pourraient contribuer à la détérioration de la fonction de TA vue dans l'obésité. La capacité du TA à stocker des lipides diminue avec l'âge, probablement à cause de l'accumulation de cellules sénescentes ou un SRE plus élevé. Dans le projet B, nous avons étudié la capacité lipogénique du TA humain en relation à la sénescence et aux marqueurs du SRE au sein d'une cohorte de femmes obèses jeunes ou âgées. Tandis que l'expression des principaux marqueurs de la sénescence était augmentée dans le TA des femmes âgées, l'expression génique des enzymes de lipogenèse et des chaperonnes était diminuée dans le TA des personnes âgées. Ces résultats étaient partiellement retrouvés dans les adipocytes différenciés in vitro des mêmes individus ce qui suggère une moins bonne capacité à faire face au SRE lors du vieillissement. Le régime à très basses calories (VLCD) est souvent prescrit en première intention pour une rapide perte de poids. L'amélioration de la sensibilité à l'insuline se voit dès 2 jours de VLCD. Néanmoins, on ne sait quasiment rien des modifications métaboliques du TA survenant durant les premiers jours. Dans le projet C, nous avons donc comparé les réponses métaboliques et inflammatoires du TA sous-cutané précocément (2 jours) et plus tardivement (28 jours) lors d'un VLCD. A 2 jours de régime, l'expression des gènes lipolytiques était augmentée, alors que l'expression des gènes lipogéniques était diminuées. Les marqueurs d'inflammation n'étaient pas changés dans le TA. Néanmoins, les changements d'expression dans le TA lors de la phase précoce du régime ne pouvait pas expliquer l'effet de ce régime court à l'amélioration de la sensibilité à l'insuline. Dans la phase tardive, l'expression des gènes impliqués dans la lipogenèse et la ß-oxydation était largement réduite, tandis que l'expression des marqueurs inflammatoires était augmentée. Nous avons donc montré que les réponses métaboliques et inflammatoires du TA sous-cutané à 2 jours et 28 jours de VLCD sont différentes. Dans le projet D, nous avons comparé et défini les effets de la restriction calorique modérée sur la physiologie des préadipocytes et des adipocytes différenciés in vitro chez des jeunes obèses ou des personnes âgées obèses. De façon surprenante, on n'a observé aucun effet de l'intervention sur le métabolisme des préadipocytes dans les deux groupes. Par contre, un effet bénéfique de l'intervention sur le métabolisme adipocytaire n'a été observé que chez les personnes âgées. Nos données montrent donc qu'une restriction calorique modérée peut avoir un effet positif sur le métabolisme adipocytaire des séniors. Pour conclure, cette thèse montre que la lipogenèse dans le TA humain peut être inhibée par le SRE, la restriction calorique sévère et le vieillissement. / Adipose tissue (AT) is a complex organ specialised in safe storage and release of energy as lipids. The adipose organ is therefore essential for the maintenance of energy homeostasis. The prototypical cells of AT are adipocytes, emerging from the precursors in a process called adipogenesis. Adipogenesis itself is tightly connected with lipogenesis, i.e. with the synthesis of fatty acids and triglycerides. Various stimuli can disturb adipocyte differentiation and lipogenesis and thus contribute to AT dysfunction and development of associated metabolic diseases. This thesis was focused on the investigation of lipogenesis in the context of endoplasmic reticulum stress (ERS), calorie restriction and aging. In Project A, we showed that exposition of adipocytes to high acute ERS inhibits expression of lipogenic genes and glucose incorporation into lipids. Moreover, chronic exposure of preadipocytes to ERS impaired both, lipogenesis and adipogenesis. On the other hand, chronic low ERS had no apparent effect on lipogenesis in adipocytes. These effects of ERS could therefore contribute to the worsening of AT function seen in obesity. The capacity of AT to store lipids decreases in aging, possibly due to the accumulation of senescence cells or higher ERS. In Project B, we investigated lipogenic capacity of human AT in relation to senescence and markers of ERS. AT and adipose cells from young and elderly women were investigated. While mRNA expression of major senescent markers was increased in AT from the elderly compared to young individuals, mRNA expression of lipogenic enzymes and chaperones was decreased in AT from elderly individuals. These results were also partly observed in vitro in differentiated adipocytes from AT of the same individuals suggesting the reduced capability to cope with ERS in aging. Very-low calorie diet (VLCD) is first line lifestyle intervention to achieve rapid weight loss. The improvement of whole body insulin sensitivity can be seen as soon as after 2 days of VLCD. However, little is known about AT metabolic changes in those early days. Thus, in Project C, we compared metabolic and inflammation-related characteristics of subcutaneous AT in the early (2 days) and later (28 days) phase of a VLCD. In the early phase of VLCD, the expression of lipolytic genes was increased, whereas the expression of lipogenic genes was suppressed. The inflammatory markers remained unchanged in AT. The changes in AT gene expression in the early phase of VLCD could not explain the effect of short calorie restriction on the improvement of insulin sensitivity. At the later phase, expression of genes involved in lipogenesis and ß-oxidation was markedly suppressed, whereas the expression of inflammatory markers was increased. Thus, we found that the early and later phases of VLCD differ with respect to metabolic and inflammatory responses in subcutaneous AT. In Project D, we compared and defined the effects of moderate calorie restriction on preadipocytes and in vitro differentiated adipocytes in two groups of obese men: juniors and seniors. We did not observe any effect of the intervention on metabolism of preadipocytes in either group. However, we observed an intervention-driven improvement in adipocyte metabolism selectively in the group of seniors. Therefore, our data suggest that moderate calorie restriction could initiate positive changes in metabolism of adipocytes in seniors. In conclusion, this thesis brought several pieces of evidence that lipogenesis in human AT can be inhibited by ER stress, severe caloric restriction and aging.

En impesanteur réelle ou simulée, l'absence de gravité oriente les cellules souches multipotentes de la moelle osseuse à privilégier l’adipogénèse aux dépens de l’ostéogénèse. Ceci entraine une perte osseuse fréquemment rencontrée chez les astronautes lors des vols spatiaux. Parmi les traitements médicamenteux existants, le strontium possède une double action, à la fois activatrice de l'ostéogénèse et inhibitrice de l’adipogénèse. Dans ce contexte, l’objectif général de ce projet de thèse a été de démontrer que le strontium peut être un bon candidat pour contrecarrer les effets de l'impesanteur. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux petites protéines Rho de la famille des GTPases, qui contrôlent le cytosquelette de la cellule, sa tension cellulaire ainsi que de nombreuses voies de signalisation. D'après la littérature, ces signalisations ont aussi été montrées comme étant liées aux voies du VEGF ou au statut oxydant des cellules, impliquées dans l’engagement des cellules souches multipotentes. La première partie de cette étude a permis de montrer l’effet antioxydant du strontium sur la lignée C3H10T1/2 en tant qu’activateur de la GTPase RhoA, permettant l’induction du gène clé de la réponse antioxydante, Nrf2, et par conséquent l’inhibition de l’adipogénèse. La deuxième partie a utilisé comme modèle des cultures 3D sur microbilles de polystyrène recouvertes de collagène pour la culture d'adipocytes, avec l'ajout de minéraux d’apatite pour la culture d'ostéoblastes. Ces billes ont été mises en culture dans un bioréacteur simulant l’impesanteur (Rotating Wall Vessel, RWV, NASA). Sous strontium, cette culture en RWV a favorisé l’ostéogenèse et limité l’adipogénèse, validant l'utilisation du strontium en tant que répresseur des effets délétères de l'impesanteur sur l’os. Nous avons montré que cet effet peut être expliqué d'une part par la stimulation des activités des deux GTPases RhoA et Rac1, et d'autre part par l’induction de l’isoforme matricielle du VEGF chez les ostéoblastes. En revanche, chez les adipocytes, les deux formes solubles et matricielles du VEGF étaient inhibées. De plus, le strontium a induit l'expression du récepteur Flt-1 qui favoriserait l’ostéogénèse. L’ensemble de ces données nous a permis de mieux comprendre les cinétiques de RhoA et Rac1 pendant l’ostéoblastogénèse et l’adipogénèse, ainsi que le rôle important des voies de signalisation du VEGF et du statut oxydant dans l’orientation de la différenciation des cellules multipotentes. Le strontium s’est révélé être un bon inducteur ostéogénique dont les applications fondamentales peuvent amener de nouvelles voies d’utilisation / In real or simulated microgravity, the absence of gravity directs multipotent stem cells from bone marrow to favor adipogenesis at the expense of osteogenesis. This causes a bone loss, commonly found in astronauts during spaceflight. Among existing drug therapies, strontium has a double action, both activating osteogenesis and inhibiting adipogenesis. In this context, the general objective of this project was to demonstrate that strontium may be a good candidate to counteract the microgravity effects. We were particularly interested in small proteins Rho of the GTPases family, which control cell cytoskeleton, cell tension and many signaling pathways. According to the literature, these pathways were also shown to be related to the VEGF singaling or the cell oxidative status, involved in the multipotent stem cells commitment. The first part of this study demonstrated the strontium antioxidant effect on the C3H10T1/2 line as an activator of the GTPase RhoA, allowing the induction of the key antioxidant response gene, Nrf2, and therefore inhibiting adipogenesis. The second part used a 3D cultures model on polystyrene microbeads coated with collagen for the adipocytes culture, and with mineral apatite added for osteoblasts culture. These beads were cultivated in a bioreactor simulating microgravity (Rotating Wall Vessel, RWV, NASA). With strontium, this RWV culture promoted osteogenesis and limited adipogenesis, validating the use of strontium as a repressor of the microgravity deleterious effects on bone. We have shown that this effect can be explained first by the stimulation of both GTPases RhoA and Rac1 activities, and secondly by the induction of the matrix-bound VEGF isoform in osteoblasts. In contrast, in adipocytes, both soluble and matrix-bound VEGF isoforms were inhibited. Moreover, strontium induced Flt-1 receptor expression, which would promote osteogenesis. All these data allowed us to better understand the RhoA and Rac1 kinetics during osteoblastogenesis and adipogenesis, and the important role of VEGF signaling pathways and oxidative status in directing multipotent cells differentiation. Strontium was found to be a good osteogenic inductor whose core applications can bring new ways of use