Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, / Memoria para optar al Título de Bioquímico / Estudios muestran que el efecto reforzante del alcohol estaría mediado por su metabolito primario, el acetaldehído. Esta molécula actuaría estimulando al sistema de recompensa, formado por neuronas dopaminérgicas que se localizan en el área del tegmento ventral (VTA) y se proyectan hacia el núcleo accumbens (sistema dopaminérgico mesolímbico). Se ha visto que ratas se autoadministran acetaldehído 6 – 90 μM en el VTA, por lo que éste sería el rango de concentraciones reforzantes para los animales. Sin embargo, no se sabe si al administrar a ratas una dosis reforzante de etanol (1 ó 2 g/kg i.p.), se alcanza una concentración reforzante de acetaldehído en sus VTA, pues tampoco se ha detectado la generación de acetaldehído a nivel cerebral, probablemente porque su rápida metabolización dificulta su detección. El objetivo de este estudio fue establecer una técnica que permita: (a) detectar el acetaldehído que se forma in vivo en el cerebro y específicamente en el sistema dopaminérgico mesolímbico luego de una dosis reforzante de etanol (1 ó 2 g/kg i.p.), y (b) estimar los niveles de acetaldehído que se encuentran en el cerebro total y en el VTA, luego de una dosis altamente reforzante de etanol (1 g/kg i.p.). Para esto, se aprovechó la propiedad del acetaldehído de formar aductos con proteínas, los que al ser estabilizados por reducción, son detectables por un anti-suero que permite indirectamente la medición de acetaldehído. Así, se logró la detección por Western blot de aductos estables formados in vivo en el cerebro, y específicamente en el núcleo accumbens de rata, luego de una dosis de etanol 1 ó 2 g/kg i.p.. Para estimar la concentración de acetaldehído que se encuentra en el cerebro de rata por una dosis de etanol 1 g/kg i.p., se cuantificaron los aductos formados, y en paralelo se obtuvo una curva estándar que relaciona concentraciones conocidas de acetaldehído agregadas a homogeneizados de cerebro con la cantidad de aductos de proteína-acetaldehído formados. La concentración promedio de acetaldehído que se encontró en el cerebro total de rata fue de 6,42 ± 2,90 μM (n=5), concentración que si se encontrara en el VTA generaría refuerzo en los animales. Sin embargo, en el VTA no se detectaron aductos estables luego de una dosis de etanol 1 ó 2 g/kg i.p.. Esto sería explicado porque el VTA es altamente dopaminérgico, y el acetaldehído formado en esta zona puede condensar con la dopamina formando salsolinol, reacción que ocurriría más rápido que la formación de aductos estables. El salsolinol se ha postulado como el efector final del efecto reforzante causado por el etanol. / Several studies suggest that the reinforcing effect of ethanol would be mediated by its first metabolite, acetaldehyde. This molecule would act by stimulating the reward system, formed by dopaminergic neurons localized in the ventral tegmental area (VTA) projecting to the nucleus accumbens (dopaminergic mesolimbic system). Rats self-administer acetaldehyde 6 - 90 μM in the VTA, so this would be the range of reinforcing concentrations. Nevertheless, it is not known whether ethanol administered to rats in a reinforcing dose (1 or 2 g/kg i.p.) produce a concentration of acetaldehyde in the VTA that allows reinforcement, since acetaldehyde generation has never been detected probably because its rapid metabolism produce difficulty in its detection. The purpose of the present study was to establish a technique that allows: (a) to detect the acetaldehyde formed in vivo in total brain and specifically in the dopaminergic mesolimbic system after a reinforcing dose of ethanol (1 or 2 g/kg i.p.), and (b) to estimate acetaldehyde levels formed in total brain and in the VTA after a highly reinforcing dose of ethanol (1 g/kg i.p.). For this, we took advantage of the acetaldehyde property to interact with proteins forming adducts, that when are stabilized for reduction, are detectable by an anti-serum that allows the indirect measure of acetaldehyde. In this way, we detect by Western blot stable adducts formed in vivo in the brain, and specifically in the nucleus accumbens of rat, after a dose of ethanol 1 or 2 g/kg i.p.. To estimate acetaldehyde concentration reached in the total brain of rat after a dose of ethanol 1 g/kg i.p., the adducts formed were quantified and, in parallel, was obtained a standard curve that relates known acetaldehyde concentrations added to brain homogenates with the quantity of adducts formed. The mean concentration of acetaldehyde that was formed in the total brain of rat after a dose of ethanol 1 g/kg i.p. was estimated to be 6,42 ± 2,90 μM (n=5). If this concentration was found in the VTA, it could generate reinforcement in this rats. Nevertheless, no adducts were found in the VTA after a dose of ethanol 1 or 2 g/kg i.p. This could be explained because the VTA contains dopaminergic neurons, and the acetaldehyde formed in this zone could condensate with dopamine forming salsolinol, reaction that can occur more quickly that the formation of stable adducts. Salsolinol has been proposed to be the final effector of the reinforcing properties of ethanol. / Fondecyt

[ES] Los estudios sobre los daños en el ADN se han incrementado en las últimas décadas con el fin de profundizar en su implicación en la aparición del cáncer. Entre el gran número de lesiones del ADN, los aductos de tipo eteno han sido objeto de interés debido a su presencia en los tejidos humanos crónicamente inflamados. Asimismo, su cuantificación es útil para su uso como potencial biomarcador del cáncer de colon, próstata, pulmón, etc. Además, estas lesiones presentan propiedades altamente mutagénicas e inducen transiciones de bases o transversiones en las células de mamíferos. Los aductos de tipo eteno se generan principalmente de forma endógena como resultado de la peroxidación lipídica. Este proceso bioquímico produce aldehídos reactivos como el malondialdehído, que pueden combinarse con las bases del ADN creando un anillo exocíclico.Este anillo exocíclico proporciona a la nucleobase un sistema extendido p-conjugado que puede conferirles propiedades ópticas diferentes a las de las bases canónicas, lo que puede suponer una amenaza para la fotoestabilidad del ADN. Las bases canónicas tienen la capacidad de disipar la mayor parte de la energía recibida a través de canales no radiativos eficientes que conducen de nuevo al estado fundamental. Por lo tanto, los estudios sobre las propiedades ópticas de estos aductos etenos son clave para establecer si estas lesiones pueden poner en peligro la relajación eficiente de los estados excitados de las bases y desencadenar una fotorreactividad indeseada del ADN. La primera parte de la tesis trata de evaluar la fotoactividad potencial de estas lesiones del ADN mediante un estudio espectroscópico. En el Capítulo 3 se combinan experimentos de upconversión de fluorescencia en la escala de femtosegundos y cálculos teóricos (en los niveles PCM-TD-DFT y CASPT2/CASSCF) para proporcionar una imagen completa de la relajación de los estados excitados del aducto mutagénico 3,N4-eteno-2'-desoxicitidina (edC). El Capítulo 4 aborda las propiedades fotofísicas de los aductos junto con su fotorreactividad en presencia de fotosensibilizadores comunes como la Rosa de Bengala (RB) y la 4-carboxibenzofenona (CBP), prestando especial atención a la interacción con el 1O2. En condiciones aeróbicas, se observa una interacción con 1O2 para los tres aductos estudiados. Curiosamente, se observan los mismos fotoproductos, las nucleobases originales, para la irradiación en condiciones anaeróbicas, abriendo la posibilidad de un mecanismo mixto de Tipo I y Tipo II cuando se utiliza Rosa de Bengala como fotosensibilizador, y de Tipo I para la 4-carboxibenzofenona. Finalmente, el último capítulo trata de unir todos los conocimientos adquiridos sobre la fotorreactividad de los e-aductos para elegir el mejor cromóforo tratando de optimizar el proceso de reparación observado en el Capítulo 4. Para ello se utilizan sistemas híbridos de nanopartículas metálicas de Ag como matriz de soporte para la Rosa de Bengala. Las NPs metálicas, como las Ag NPs, poseen una resonancia plasmónica superficial localizada (LSPR), este efecto amplifica una gran variedad de fenómenos ópticos que pueden mejorar las propiedades ópticas de la Rosa de Bengala. / [CA] Els estudis sobre els danys en l'ADN s'han incrementat en les últimes dècades amb la finalitat d'aprofundir en la seua implicació en l'aparició del càncer. Entre el gran nombre de lesions de l'ADN, els adductes de tipus eteno han sigut objecte d'interés degut a la seua presència en els teixits humans crònicament inflamats, la qual cosa fa que la seua quantificació siga útil com a potencials biomarcadors del càncer de còlon, pròstata, pulmó, etc. A més, aquestes lesions presenten propietats altament mutagèniques i indueixen transicions de bases o transversions en les cèl·lules dels mamífers. Els adductes de tipus eteno es formen principalment de manera endògena com a resultat de la peroxidació dels lípids. Aquest procés bioquímic produeix aldehids reactius com el malondialdehid, que poden combinar-se amb les bases de l'ADN creant un anell exocíclic. Aquest anell exocíclic proporciona a les nucleobases un sistema estés p-conjugat que pot conferir-les propietats òptiques diferents a les de les bases canòniques, i que poden suposar una amenaça per a la fotoestabilitat de l'ADN. Les bases canòniques tenen la capacitat de dissipar la major part de l'energia d'excitació a través de canals no radiatius eficients que condueixen de nou a l'estat bàsic. No obstant això, els estudis sobre les propietats òptiques d'aquests adductes de tipus eteno són fonamentals per a deixar clar si aquestes lesions poden posar en perill aquesta relaxació eficient i desencadenar una fotoreactivitat indesitjada de l'ADN. La primera part de la tesi tracta d'estimar el potencial fotoactiu d'aquestes lesions de l'ADN mitjançant un estudi espectroscòpic. En el Capítol 3 es combinen experiments de "upconversió" de fluorescència en una escala de femtosegons i càlculs teòrics (en els nivells PCM-TD-DFT i CASPT2/CASSCF) per a proporcionar una imatge completa de la relaxació dels estats excitats del adducte mutagènic 3,N4-eteno-2'-desoxicitidina (edC). El Capítol 4 aborda les propietats fotofísiques dels adductes restants juntament amb el seua fotoreactivitat en presència d'alguns fotosensibilitzadors comuns com la Rosa de Bengala (RB) i la 4-carboxibenzofenona (CBP), prestant especial atenció a la interacció amb el 1O2. S'observa la interacció amb 1O2 per als tres adductes estudiats. Curiosament, s'observa la mateixa formació de nucleobases per a la irradiació en condicions anaeròbiques, obrint la possibilitat d'un mecanisme mixt de Tipus I i Tipus II quan s'utilitza Rosa de Bengala com fotosensibilitzador i de Tipus I per a la 4-carboxibenzofenona. Finalment, l'últim capítol tracta d'unir tots els coneixements adquirits sobre la fotoreactivitat dels adductes de tipus eteno per a triar el millor cromòfor tractant d'optimitzar el procés de reparació observat en el Capítol 4. Per a això s'utilitzen sistemes híbrids de nanopartícules metàl·liques de Ag com a matriu de suport per a la Rosa de Bengala. Les NPs metàl·liques, com les de Ag, posseeixen ressonància plasmónica superficial localitzada (LSPR), aquest efecte amplifica una gran varietat de fenòmens òptics que poden millorar les propietats òptiques de la Rosa de Bengala. / [EN] Studies dealing with DNA damages have increased during the last decades in order to get more insight into their involvement in the appearance of cancer. Among the large number of DNA lesions, etheno adducts have been the matter of interest because of their presence in chronically inflamed human tissues, making their quantification useful as potential biomarkers for cancer of colon, prostate, lung, etc. Moreover, these lesions exhibit highly mutagenic properties and induce base transitions or transversion in mammal cells. Etheno adducts are mainly formed endogenously as a result of lipid peroxidation. This biochemical process produces reactive aldehydes such as malondialdehyde, which can combine with DNA bases creating the exocyclic ring. This exocyclic ring provides to the nucleobases an extended p- conjugated system that might confer them optical properties different from those of the canonical bases, and can pose a threat to the DNA photostability. Canonical bases have the ability to dissipate most of the excitation energy through efficient nonradiative channels leading back to the ground state. However, the studies about the optical properties of this etheno adducts are basics to make it clear whether these lesions can jeopardize this efficient relaxation and trigger undesired DNA photoreactivity. The first part of the thesis establishes the potential photoactivity of these DNA lesions through a spectroscopic study. Chapter 3 joints femtosecond fluorescence upconversion experiments and theoretical calculations (at the PCM-TD-DFT and CASPT2/CASSCF levels) to provide a comprehensive picture of the mutagenic etheno adduct 3,N4-etheno-2'-deoxycytidine (edC) excited states relaxation. Chapter 4 addresses the photophysical properties of the adducts together with its photoreactivity in the presence of some common photosensitizers as Rose Bengal and 4-carboxybenzophenone, paying a special attention to interaction with 1O2. Interaction with 1O2 is observed for the three studied e-adducts. Interestingly, the same nucleobase formation is detected for irradiation under anaerobic conditions, opening the possibility of a mixed Type I and Type II mechanism when Rose Bengal is used as photosensitizer, and Type I for 4-carboxybenzophenone. Finally, the last chapter takes advantage of all the gained knowledge about the photoreactivity of e-adducts to choose the best chromophore and optimize the repair process observed in Chapter 4. To achieve this, hybrid systems of Ag metal nanoparticles are used as a support matrix for the Rose Bengal. Metal NPs, such as Ag NP, possess localized surface plasmon resonance (LSPR). This effect amplifies a wide variety of optical phenomena that can enhance the Rose Bengal optical properties. / Lizondo Aranda, P. (2022). Photoreactivity of DNA Etheno Adducts: Spectroscopic and Mechanistic Study [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/189688