Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, / Memoria para optar al Título de Bioquímico / Estudios muestran que el efecto reforzante del alcohol estaría mediado por su metabolito primario, el acetaldehído. Esta molécula actuaría estimulando al sistema de recompensa, formado por neuronas dopaminérgicas que se localizan en el área del tegmento ventral (VTA) y se proyectan hacia el núcleo accumbens (sistema dopaminérgico mesolímbico). Se ha visto que ratas se autoadministran acetaldehído 6 – 90 μM en el VTA, por lo que éste sería el rango de concentraciones reforzantes para los animales. Sin embargo, no se sabe si al administrar a ratas una dosis reforzante de etanol (1 ó 2 g/kg i.p.), se alcanza una concentración reforzante de acetaldehído en sus VTA, pues tampoco se ha detectado la generación de acetaldehído a nivel cerebral, probablemente porque su rápida metabolización dificulta su detección. El objetivo de este estudio fue establecer una técnica que permita: (a) detectar el acetaldehído que se forma in vivo en el cerebro y específicamente en el sistema dopaminérgico mesolímbico luego de una dosis reforzante de etanol (1 ó 2 g/kg i.p.), y (b) estimar los niveles de acetaldehído que se encuentran en el cerebro total y en el VTA, luego de una dosis altamente reforzante de etanol (1 g/kg i.p.). Para esto, se aprovechó la propiedad del acetaldehído de formar aductos con proteínas, los que al ser estabilizados por reducción, son detectables por un anti-suero que permite indirectamente la medición de acetaldehído. Así, se logró la detección por Western blot de aductos estables formados in vivo en el cerebro, y específicamente en el núcleo accumbens de rata, luego de una dosis de etanol 1 ó 2 g/kg i.p.. Para estimar la concentración de acetaldehído que se encuentra en el cerebro de rata por una dosis de etanol 1 g/kg i.p., se cuantificaron los aductos formados, y en paralelo se obtuvo una curva estándar que relaciona concentraciones conocidas de acetaldehído agregadas a homogeneizados de cerebro con la cantidad de aductos de proteína-acetaldehído formados. La concentración promedio de acetaldehído que se encontró en el cerebro total de rata fue de 6,42 ± 2,90 μM (n=5), concentración que si se encontrara en el VTA generaría refuerzo en los animales. Sin embargo, en el VTA no se detectaron aductos estables luego de una dosis de etanol 1 ó 2 g/kg i.p.. Esto sería explicado porque el VTA es altamente dopaminérgico, y el acetaldehído formado en esta zona puede condensar con la dopamina formando salsolinol, reacción que ocurriría más rápido que la formación de aductos estables. El salsolinol se ha postulado como el efector final del efecto reforzante causado por el etanol. / Several studies suggest that the reinforcing effect of ethanol would be mediated by its first metabolite, acetaldehyde. This molecule would act by stimulating the reward system, formed by dopaminergic neurons localized in the ventral tegmental area (VTA) projecting to the nucleus accumbens (dopaminergic mesolimbic system). Rats self-administer acetaldehyde 6 - 90 μM in the VTA, so this would be the range of reinforcing concentrations. Nevertheless, it is not known whether ethanol administered to rats in a reinforcing dose (1 or 2 g/kg i.p.) produce a concentration of acetaldehyde in the VTA that allows reinforcement, since acetaldehyde generation has never been detected probably because its rapid metabolism produce difficulty in its detection. The purpose of the present study was to establish a technique that allows: (a) to detect the acetaldehyde formed in vivo in total brain and specifically in the dopaminergic mesolimbic system after a reinforcing dose of ethanol (1 or 2 g/kg i.p.), and (b) to estimate acetaldehyde levels formed in total brain and in the VTA after a highly reinforcing dose of ethanol (1 g/kg i.p.). For this, we took advantage of the acetaldehyde property to interact with proteins forming adducts, that when are stabilized for reduction, are detectable by an anti-serum that allows the indirect measure of acetaldehyde. In this way, we detect by Western blot stable adducts formed in vivo in the brain, and specifically in the nucleus accumbens of rat, after a dose of ethanol 1 or 2 g/kg i.p.. To estimate acetaldehyde concentration reached in the total brain of rat after a dose of ethanol 1 g/kg i.p., the adducts formed were quantified and, in parallel, was obtained a standard curve that relates known acetaldehyde concentrations added to brain homogenates with the quantity of adducts formed. The mean concentration of acetaldehyde that was formed in the total brain of rat after a dose of ethanol 1 g/kg i.p. was estimated to be 6,42 ± 2,90 μM (n=5). If this concentration was found in the VTA, it could generate reinforcement in this rats. Nevertheless, no adducts were found in the VTA after a dose of ethanol 1 or 2 g/kg i.p. This could be explained because the VTA contains dopaminergic neurons, and the acetaldehyde formed in this zone could condensate with dopamine forming salsolinol, reaction that can occur more quickly that the formation of stable adducts. Salsolinol has been proposed to be the final effector of the reinforcing properties of ethanol. / Fondecyt

Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular / Memoria para optar al Título de Bioquímico / Recientemente, se demostró que la metabolización de etanol a acetaldehído es indispensable para que su consumo sea reforzante; sin embargo, no se conoce el mecanismo cerebral por el cual se produce este efecto. Se ha postulado que el salsolinol, un producto racémico de la condensación no enzimática de acetaldehído con dopamina, es responsable del efecto reforzante del etanol. La concentración cerebral de salsolinol aumenta luego del consumo de etanol y el salsolinol es una molécula reforzante más potente que el acetaldehído y el etanol, probablemente activando al receptor μ de opioides. Sin embargo, el salsolinol de Sigma-Aldrich, caracterizado como reforzante en los estudios en la literatura, está compuesto por 4 isómeros: R- y S-salsolinol, y R- y S-isosalsolinol (este último es un producto secundario de la condensación no enzimática de acetaldehído y dopamina). Queda por esclarecer: cuál o cuáles de estas moléculas son reforzantes y si estas moléculas alcanzan su concentración reforzante cuando se consume etanol. Además, se ha reportado la existencia de una enzima R-salsolinol sintasa cuyos sustratos son dopamina y acetaldehído. Si la formación de R-salsolinol es responsable del efecto reforzante del etanol, esta enzima podría ser necesaria para que el etanol sea reforzante; sin embargo, no se ha publicado su secuencia aminoacídica. A partir de estos antecedentes se postula que un producto de la condensación de dopamina y acetaldehído es responsable del efecto reforzante del etanol, y este producto alcanza su concentración reforzante a través de su síntesis enzimática (por una R-salsolinol sintasa) o su síntesis no enzimática. Así, el primer objetivo de esta tesis fue detectar, caracterizar y purificar una enzima cerebral con actividad R-salsolinol sintasa en rata, que tenga como sustratos dopamina y acetaldehído. Se abordó la búsqueda de actividad R-salsolinol sintasa en las siguientes preparaciones de cerebro de ratas: homogeneizado completo, sobrenadante citosólico y proteínas purificadas en una resina modificada con dopamina. Se incubaron estas preparaciones con los sustratos dopamina y acetaldehído más cofactores que podrían ser requeridos por esta enzima. No se encontró actividad salsolinol sintasa en muestra alguna. Además, la revisión crítica de los artículos que reportan la presencia de la enzima como de peso molecular bajo 2 kDa y actividad de menor magnitud que la síntesis no enzimática, tornó su búsqueda infundada. Por lo tanto, se descartó esta línea de investigación. La búsqueda de una síntesis enzimática mostró que la velocidad de síntesis no enzimática de salsolinol podría ser suficiente para formar la cantidad reforzante de salsolinol. Luego de esta nueva evidencia, se siguió el objetivo alternativo en esta tesis: determinar cuál es el isómero de salsolinol reforzante, y si su concentración activa en el cerebro es alcanzable a partir de dopamina y acetaldehído. Primeramente, se determinó si las velocidades de síntesis no enzimática de los regioisómeros de salsolinol, salsolinol e isosalsolinol, son suficientemente rápidas para generar sus concentraciones reforzantes. Se midió la formación de salsolinol e isosalsolinol mediante cromatografía líquida de alta eficacia. Se calculó que la concentración reforzante de salsolinol, y no la de isosalsolinol, se alcanza en el cerebro partir de la concentración de acetaldehído reforzante; a través del uso de un modelo de estado estacionario que determina la concentración de salsolinol que se alcanza cuando sus velocidades de síntesis y de degradación se igualan. Debido a que las preparaciones de salsolinol (Sigma-Aldrich) usadas en estudios previos para determinar su efecto reforzante estaban contaminadas con isosalsolinol, era importante confirmar si el salsolinol sin isosalsolinol mantiene su efecto reforzante. Existe evidencia de que al menos un isómero de salsolinol activa al receptor μ de opioides y que, posiblemente, este sea el mecanismo que ejerce su efecto reforzante. Por esto, se realizó un estudio de acoplamiento molecular in silico de los 4 isómeros de salsolinol en el receptor μ de opioides (recientemente cristalizado) que pudiera identificar a cada isómero como activo o inactivo, antes de estudiarlos in vivo. Se observó que todos los isómeros de salsolinol calzan correctamente en el bolsillo de morfina del receptor μ de opioides. Esto no esclarece si cada isómero es agonista (o antagonista) del receptor. Para determinar in vivo si el salsolinol sin isosalsolinol es reforzante, se realizaron dos ensayos: (i) se estudió si, presionando una palanca, ratas se autoadministran intracerebralmente salsolinol; y (ii) se estudió si el salsolinol infundido intracerebralmente provoca una preferencia de lugar condicionada por esta infusión de salsolinol en ratas. La autoadministración intracerebral de salsolinol resultó negativa, posiblemente por la dificultad de la metodología. En el ensayo de preferencia de lugar, las ratas mostraron una tendencia a preferir el lado en el cuál se infundió salsolinol racémico, sin isosalsolinol, y no cuando se infundió la mezcla de ambos regioisómeros. Los resultados en este trabajo (i) indican que el salsolinol racémico no necesita de isosalsolinol para ser reforzante, sugieren que (ii) el isosalsolinol disminuye la capacidad reforzante del salsolinol, y que (iii) el salsolinol racémico alcanza su concentración reforzante no enzimáticamente y podría ser responsable del efecto reforzante del etanol. / Recently, it was shown that the metabolism of ethanol to acetaldehyde is essential for its consumption to be reinforcing; however the cerebral mechanism by which this effect occurs is not known. It has been postulated that salsolinol, a racemic non-enzymatic condensation product of acetaldehyde with dopamine, is responsible for the reinforcing effect of ethanol. The concentration of salsolinol in the brain increases after consumption of ethanol and salsolinol is a more powerfully reinforcing molecule than acetaldehyde and ethanol, possibly activating the μ-opioid receptor. However, the Sigma-Aldrich salsolinol that has been characterized in the literature studies comprises 4 isomers: R- and S-salsolinol, and R- and S-isosalsolinol (the latter is a secondary non-enzymatic condensation product of acetaldehyde and dopamine). Which of these molecules is reinforcing and if this molecule reaches its reinforcing concentration in the brain when ethanol is consumed remains to be elucidated. Furthermore, the existence of an enzyme R-salsolinol synthase whose substrates are acetaldehyde and dopamine has been reported. If the R-salsolinol formation is responsible for the reinforcing effect of ethanol, this enzyme may be necessary for ethanol to be reinforcing; however, its amino acid sequence has not been reported. From this background it is postulated that a condensation product of acetaldehyde and dopamine is responsible for the reinforcing effect of ethanol, and this product reaches its reinforcing concentration through either an enzymatic synthesis (by an R-salsolinol synthase) or a non-enzymatic synthesis. Thus, the first objective of this thesis was to detect, characterize and purify a brain enzyme with R-salsolinol synthase activity in rat, having dopamine and acetaldehyde as its substrates. The search for R-salsolinol synthase activity was addressed by using the following rat brain preparations: whole brain homogenates, cytosolic supernatant and proteins purified in a resin modified with dopamine. These preparations were incubated with the substrates dopamine and acetaldehyde, and cofactors that may be required by this enzyme. No salsolinol synthase activity was found in any sample. In addition, a critical review of articles reporting the presence of the enzyme with a molecular weight lower than 2 kDa and an activity of lesser magnitude than the non-enzymatic rate of synthesis, turned his search unfounded. Therefore, this line of research was discarded. The search for an enzymatic synthesis revealed that the rate of non-enzymatic synthesis of salsolinol may be sufficient for the formation of the reinforcing amount of salsolinol. After this new evidence, we followed the alternative objective in this thesis: to determine which salsolinol isomer is reinforcing and whether its active concentration in the brain can be reached from dopamine and acetaldehyde. Firstly, we investigated whether non-enzymatic synthesis rates of salsolinol and isosalsolinol were fast enough to generate its reinforcing concentrations. The formation of salsolinol and isosalsolinol was measured by high performance liquid chromatography. It was calculated that the reinforcing concentration of salsolinol, and not of isosalsolinol, can be reached in the brain if synthesized from the reinforcing concentrations of acetaldehyde; by means of a steady state model which determines the concentration of salsolinol achieved when its rate of synthesis and degradation are equal. Given that the salsolinol (Sigma-Aldrich) preparations used to determine its reinforcing effect in previous studies were contaminated with isosalsolinol, it was important to confirm that salsolinol without isosalsolinol retains its reinforcing effect. There is evidence that at least one salsolinol isomer activates the μ-opioid receptor and that, possibly, this is the mechanism that exerts its reinforcing effect. Therefore, we performed molecular docking studies of the 4 salsolinol isomers to the μ-opioid receptor (recently crystallized) aimed at identifying each isomer as active or inactive, before studying these in vivo. It was observed that all salsolinol isomers properly fit in the morphine pocket of the μ-opioid receptor. This result does not clarify if an isomer is an agonist (or antagonist) for this receptor. Subsequently, to determine in vivo if salsolinol without isosalsolinol is reinforcing, two assays were performed: (i) we studied if rats self-administered salsolinol directly in the brain by pressing a lever, and (ii) we examined whether salsolinol infused in the brain is capable of inducing a conditioned place preference in rats. The intracraneal salsolinol self-administration was negative, possibly because of the difficulty of the methodology. In the place preference test, rats showed a tendency to prefer the side on which racemic salsolinol without isosalsolinol was infused, and not when a mixture of both regioisomers was infused. The results in this study (i) indicate that racemic salsolinol does not need isosalsolinol to be reinforcing, suggest that (ii) the isosalsolinol decreases the salsolinol reinforcing capability, and (iii) racemic salsolinol reaches its reinforcing concentration non-enzymatically and could be responsible for the reinforcing effect of ethanol. / Fondecyt

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las propiedades reforzantes del etanol en el sistema nervioso central (SNC), que se postula son responsables de la auto-administración repetida de alcohol, se deben al aumento de la liberación de dopamina, inducido por el etanol, en el núcleo accumbens, área del sistema mesolímbico inervada por neuronas del área tegmental ventral. Esta acción parece estar mediada por su metabolito primario, el acetaldehído, producido en el cerebro por la oxidación del etanol a través de dos sistemas enzimáticos alternativos: la catalasa cerebral y el citocromo p450 2E1 (CYP2E1). Las ratas se autoadministran tanto etanol como acetaldehído directamente en el área tegmental ventral. La concentración necesaria para producir efectos reforzantes es menor para el acetaldehído que para el etanol, indicando que este metabolito del alcohol es un agente reforzante más potente que el etanol. El acetaldehído se puede condensar con la dopamina formando una mezcla de salsolinol e isosalsolinol. Las ratas se autoadministran salsolinol comercial (que contiene entre un 8 % y un 15 % de isosalsolinol) directamente en el área tegmental ventral. Las concentraciones autoadministradas son aún menores que las de acetaldehído, indicando una mayor potencia del salsolinol (y/o del isosalsolinol) como agente reforzante. Tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los enantiómeros R y S. En el cerebro, el salsolinol sería producido por al menos tres vías: 1) condensación no enzimática del acetaldehído con dopamina, que produce la mezcla racémica de (R,S)-salsolinol y, posiblemente en menor proporción, una mezcla racémica de (R,S)- isosalsolinol; 2) condensación enzimática del acetaldehído con la dopamina, que produciría preferencialmente (R)-salsolinol y 3) condensación enzimática del ácido pirúvico con dopamina seguido de descarboxilación del producto, lo cual produciría preferencialmente (R)-salsolinol. No existe claridad acerca de cuál de los isómeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, específicamente, cuál de los enantiómeros - R o S - de estos compuestos es el que tiene una mayor actividad biológica. Para poder determinar cuál de los isómeros presentes en el salsolinol comercial -(R)- salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol o (S)-isosalsolinol- es el que tiene una mayor actividad biológica y para poder profundizar en los efectos que tiene el consumo de etanol sobre la producción de ellos in vivo, es necesario poder contar con metodologías que permitan la producción de estos isómeros en forma separada y a su vez que permitan cuantificarlos en muestras de origen biológico. En este sentido, los principales resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron los siguientes: (i) Se desarrolló una metodología de HPLC de apareamiento iónico en columna de gel de sílice-C18 acoplada a detector electroquímico capaz de separar y cuantificar dopamina, salsolinol e isosalsolinol en aproximadamente 30 min. En este sistema, la dopamina eluye primero (13,0 min. aprox.) seguida del salsolinol y el isosalsolinol (14,4 min. aprox y 26,1 min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de estos analitos en concentraciones desde 10-8 M. (ii) Se estableció que las sustancias separadas mediante HPLC de apareamiento iónico a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol (tiempo de retención 14,4 min. aprox.) e isosalsolinol (tiempo de retención 26,1 min. aprox) sobre la base de que: a) El tiempo de retención de SC1 (14,4 min. aprox.) es menor que el tiempo de retención de SC2 (26,1 min. aprox.) y, teóricamente, cabe esperar que el salsolinol eluya antes que el isosalsolinol por tener sus grupos hidroxilo más disponibles para interactuar con la fase móvil. b) La razón entre las áreas de los picos del salsolinol comercial SC1 (tiempo de retención 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retención 26,1 min. aprox.) se corresponde con los porcentajes de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) en el salsolinol comercial determinados por 1H-RMN. c) El peso molecular de las sustancias separadas a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, se corresponde con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol (179 g/mol). (iii) Se determinó que la dopamina se degrada (posiblemente por autoxidación) en solución a pH 7,4 de acuerdo a una cinética de orden cero, mientras que el salsolinol y el isosalsolinol lo hacen de acuerdo a una cinética de orden uno, siendo la velocidad de oxidación del isosalsolinol 10 veces mayor que la del salsolinol. (iv) Se desarrolló una metodología de HPLC de fase inversa en columna de gel de sílice modificado con β-ciclodextrina capaz de separar y cuantificar dopamina, (R)- salsolinol y (S)-salsolinol en aproximadamente 40 minutos. En este sistema, la dopamina eluye primero (22,9 min. aprox) seguida de (S)-salsolinol (26,9 min. aprox.), (R)-salsolinol (29,9 min. aprox.) y el (R) y (S)-isosalsolinol (31,3 y 32,9 min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de dopamina, (S)- salsolinol y (R)-salsolinol en concentraciones desde 10-8 M. Si bien el isosalsolinol pudo ser separado de dopamina y de los enantiómeros R y S del salsolinol, no se logró separar completamente los enantiómeros R y S del isosalsolinol entre sí. A futuro, estas metodologías permitirán la detección y cuantificación de los enantiómeros en muestras de origen biológico y la administración selectiva de un enantiómero específico directamente en el cerebro de las ratas, ampliando así los conocimientos que se tienen sobre las propiedades reforzantes del etanol como una prodroga y cómo éstas pueden ser mediadas por el salsolinol / The reinforcing properties of ethanol in the central nervous system (CNS), believed to be responsible for the repeated self-administration of ethanol, are due to the increase of dopamine release -induced by ethanol- in the nucleus accumbens, a part of the mesolimbic system innerved by neurons from the ventral tegmental area. This action of ethanol seems to be mediated by its primary metabolite, acetaldehyde, which is produced in the brain from ethanol oxidation by two alternative enzymatic systems: brain catalase and cytochrome p450 2E1 (CYP2E1). Rats selfadminister both ethanol and acetaldehyde directly into the ventral tegmental area. The concentration needed to produce the reinforcing effects is lower for acetaldehyde than for ethanol, suggesting that this metabolite is a more powerful reinforcing agent than ethanol. Acetaldehyde can condense with dopamine to form salsolinol and isosalsolinol. Rats selfadminister commercially available salsolinol (which contains between 8% to 15% of isosalsolinol) directly in the ventral tegmental area. The concentrations of salsolinol selfadministered are even lower than acetaldehyde concentrations, suggesting that salsolinol (and/or isosalsolinol) is an even more powerful reinforcing agent. Both salsolinol and isosalsolinol have a chiral center and exist as the R and S enantiomers. In brain, salsolinol could be produced by at least three pathways. 1) non-enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine, which produces a racemic mixture of R and S salsolinol and possibly, to a lesser extent, a racemic mixture of R and S isosalsolinol; 2) enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine which would produce, preferentially, (R)-salsolinol and 3) enzymatic condensation of pyruvic acid with dopamine followed by decarboxylation of the condensation product wich would produce, preferentially, (R)-salsolinol. There is no clarity about which of the isomers, salsolinol or isosalsolinol (or both), is primarily responsible for the observed reinforcing properties, nor, specifically, about which of the enantiomers –R or S- of these compounds has a greater biological activity. In order to determine which of the isomers present in comercially available salsolinol –(R)- salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol and (S)-isosalsolinol- has stronger biological activity and in order to better understand the effects of ethanol consumption on the in vivo synthesis of these isomers, methodologies that allow us to produce these substances independently and methodologies that allow us to quantify them in biological samples are needed. In relation to this, the main results obtained in this thesis were the following: (i) An ion pairing HPLC methodology using a silicagel-C18 column coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, salsolinol and isosalsolinol in approximately 30 min., was developed. By this methodology, dopamine elutes first (13.0 min. approx.) followed by salsolinol and isosalsolinol (14.4 min. approx. and 26.1 min. approx.), allowing a good separation and quantification of these analytes in concentrations above 10-8 M. (ii) The substances separated by ion pairing HPLC from commercially available salsolinol correspond to salsolinol (retention time of 14.4 min. approx.) and isosalsolinol (retention time of 26.1 min. approx.). This was established on the basis that: a) The retention time of SC1 (14.4 min. approx.) is lower than the retention time of SC2 (26.1 min. approx.) and, theoretically, it is expected that salsolinol elutes before than isosalsolinol because salsolinol has its hydroxyl groups more available to interact with the mobil phase than isosalsolinol. b) The ratio between the areas of the peaks observed for commercially available salsolinol SC1 (retention time of 14.4 min. approx.) and SC2 (retention time of 26.1 min. approx.) is in agreement with the expected percentages of salsolinol (92%) and isosalsolinol (8%) in the commercially available salsolinol as determined by 1H-NMR. c) The molecular weight of the substances separated from commercially available salsolinol, SC1 and SC2, is the same as the molecular weight of salsolinol and isosalsolinol (179 g/mol). (iii) It was determined that dopamine degradation (possibly by autoxidation) at pH 7.4 follows zero order kinetics, while salsolinol and isosalsolinol oxidations follow first order kinetics. The rate of oxidation of isosalsolinol is about 10 times higher than the rate of oxidation of salsolinol. (iv) A reversed phase HPLC methodology using a silicagel-β-cyclodextrin coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, (R)-salsolinol and (S)-salsolinol in about 40 minutes, was developed. In this methodology, dopamine elutes first (22.9 min. approx.), followed by (S)-salsolinol (26.9 min. approx.), (R)- salsolinol (29.9 min. approx.) and (R) and (S)-isosalsolinol (31.3 and 32.9 min. approx.), allowing a good separation and quantification of dopamine, (S)-salsolinol and (R)-salsolinol in concentrations above 10-8 M. Although this methodology succeeded in separating isosalsolinol from dopamine and from the R and S enantiomers of salsolinol, it was unable to completely resolve (R)-isosalsolinol from (S)-isosalsolinol. In the future, these methodologies will allow the detection and quantification of these regioisomers and enantiomers in biological samples and will allow the selective administration of a specific enantiomer directly into rat brain, extending our knowlegde on the reinforcing properties of ethanol as a prodrug and on how these properties may be mediated by salsolinol

En este estudio se plantea el desarrollo de métodos analíticos para la detección de cambios metabólicos a corto plazo frente a situaciones de estrés en fruta fresca, como son las infecciones fúngicas y los impactos mecánicos. A pesar de las modernas técnicas que se aplican actualmente en las líneas de manipulación en cítricos en postcosecha y del uso de fungicidas, continúa siendo muy frecuente la aparición de infecciones fúngicas en las frutas almacenadas, por germinación de esporas de mohos en la corteza de los cítricos favorecidas muchas veces por las heridas o magulladuras que se producen en las frutas por impactos ocurridos durante su manipulación. Dichas infecciones tradicionalmente se hacen evidentes por la detección de signos visuales de infección en la corteza de los cítricos ("podrido") con la consecuente pudrición de las frutas afectadas, depreciación del producto y en muchos casos, la imposibilidad de su comercialización. Dada esta situación se consideró de interés desarrollar métodos que pudieran colaborar en la predicción de la aparición de infecciones fúngicas por detección de cambios metabólicos antes que las mismas fueran evidentes y de esta manera contribuir al desarrollo de sistemas para la optimización de las etapas de comercialización. La detección de cambios metabólicos se orientó hacia el análisis de tasas respiratorias, así como la eventual aparición de volátiles indeseables (acetaldehído y etanol). Se ha diseñado e implementado un sistema de análisis de tasas respiratorias mediante cromatografía gaseosa del espacio de cabeza. Para ello se conectó un microcromatógrafo de gases (mCG) a una cámara de respiración hermética conteniendo la fruta a estudiar que analiza el espacio de cabeza por aspiración automática de muestras gaseosas de manera casi continua a tiempos prefijados y con tiempos cortos de análisis. El sistema se desarrolló con naranjas sanas var. Navelate. Posteriormente se aplicó en naranjas var. Navelate inoculadas con esporas / Stern Freifeld, D. (2005). Desarrollo de métodos analíticos para la detección de cambios metabólicos frente a situaciones de estrés en fruta fresca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1931

Se ha analizado el efecto de los tratamientos osmóticos hasta distintos niveles, con y sin aplicación de pulso de vacío (50 mbar durante 5 minutos) y la influencia del lactato cálcico en la disolución osmótica, así como el efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento en diferentes propiedades relacionadas con la estabilidad y la calidad de fresa y manzana. Para ello, en primer lugar se ha caracterizado la cinética de deshidratación en mitades de fresa y en rodajas de manzana, para establecer los tiempos de tratamiento requeridos. Posteriormente se ha evaluado el efecto de los tratamientos sobre las propiedades mecánicas y la tasa respiratoria de las frutas. Por otra parte, en la fresa se ha analizado la influencia de los tratamientos en las propiedades ópticas y en la producción de etanol y acetaldehído. En la manzana se ha estudiado también el efecto de la modificación de la atmósfera del espacio de cabeza en su respiración y el efecto de los tratamientos en la evolución de la carga microbiana. Los tratamientos osmóticos implican cambios en la pauta respiratoria del tejido de las frutas, dependiendo de las condiciones de operación. Los tratamientos con pulso de vacío provocan mayor restricción al transporte de oxígeno dando lugar a mayores valores del coeficiente respiratorio y a una mayor potenciación de rutas anaerobias. Como consecuencia, se desarrollan volátiles indeseables como se ve en fresa. El calcio disminuye la respiración de fresa con menor influencia en la manzana. Desde este punto de vista, se recomiendan tratamientos osmóticos cortos y a presión atmosférica. Los tratamientos osmóticos provocan cambios en las propiedades mecánicas de fresa y manzana, tanto más cuanto mayor es el nivel de deshidratación. La aplicación de pulso de vacío potencia la caída de la firmeza por efecto del tratamiento pero mejora su estabilidad en el almacenamiento. / Castelló Gómez, ML. (2007). Efecto de las condiciones de operación en los cambios fisicoquímicos y fisiológicos de frutas mínimamente procesadas por deshidratación osmótica [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1830