Vision impairment and blindness are in industrialized countries primarily caused by the degeneration of the retina, the light sensing tissue inside the eye. The degeneration, occurring in diseases like age-related macular degeneration (AMD) or retinitis pigmentosa (RP), can be caused by environmental factors as well as genetic defects and thus shows diverse pathologies. In all conditions, the light detecting photoreceptors (rods and/or cones) are dying caused by either direct photoreceptor damage or as a secondary effect following degeneration of supporting cells. Although promising treatment approaches are currently under investigation, up to date it is not possible to cure these diseases. Amongst these therapeutic strategies, pre-clinical studies evaluating the replacement of degenerated cells by transplantation of new photoreceptors demonstrated promising results. First studies conducted the specific enrichment and transplantation of primary photoreceptors derived from postnatal mice and their sufficient integration and differentiation into mature photoreceptors in wild-type as well as degenerated mouse retinae. Recent experiments additionally proved the recovery of some dim-light vision after transplantation in mice lacking night sight. The in vitro differentiation of whole eye cups containing photoreceptors, out of human or mouse ES or iPS cells, peaked in the transplantation of ES-derived photoreceptors into wild-type as well as degenerated mice and the integration and maturation of these cells. These observations are encouraging, but prior to a save implementation of this strategy into a clinical routine, several further hurdles need to be challenged. Collection of photoreceptors out of whole retinal tissues prior to transplantation was shown to be an important step to reach high integration rates. Additionally, transplantation of photoreceptors derived from stem cells comprises the risk of tumor formation after transplantation and thus also requires depletion of inadvertent cells. Therefore, we established the enrichment of photoreceptors using the cell surface marker dependent method magnetic-activated cell sorting (MACS). For identification of suitable target-specific surface markers, we characterized young transplantable mouse photoreceptors using microarray analysis and screened their transcriptome. Amongst others, ecto-5´nucleotidase (Nt5e, termed CD73) was identified being a rod photoreceptor specific cell surface protein. Thus, we enriched young photoreceptors with CD73-dependent MACS with sufficient purity and transplanted these cells into the subretinal space of wild-type mice. In contrast to unsorted retinal cells, enriched photoreceptors integrated in significantly higher number into the host retina, proving that MACS is a suitable alternative for specific photoreceptor enrichment. Testing other proteins, identified as photoreceptor specific, for MACS suitability and the translation of this approach to photoreceptors, derived from mouse as well as human iPS or ES cells, should be the focus of consecutive investigations. The integration of grafted cells into the retina is a complex process dependent on a variety of influencing factors. Transplantation experiments in aging wild-type mice and a rod-depleted mouse model, containing a retina composed of cone and cone-like photoreceptors, indicated that the activation of Müller glia cells facilitates integration of transplanted photoreceptors. Besides that, reduced outer limiting membrane (OLM) integrity, increased subretinal graft distribution or reduced retinal cell density are further suggested as potential cell engraftment enhancers. These factors might open up important possibilities of host retina manipulation to increase cell integration rates. Although retinal transplantation experiments were in addition to mice also performed using pigs or rats as hosts, the transplantation of enriched single photoreceptors, following the protocols successfully established in mice, has not been performed in other species. Nevertheless, transferring this technique is important and would allow better predictions for future application in human patients. Therefore, we transferred our protocol, using CD73 based MACS, to the rat and successfully enriched rat photoreceptors with sufficient purity. We subsequently transplanted these cells into the subretinal space of rats as well as mice and observed limited integration capacity of grafted cells. Only few transplanted rat photoreceptors were localized in the rat retina, lacking proper photoreceptor morphology. Especially regarding a perspective clinical application in humans, these data are remarkable. They imply the question, whether low integration in rat represents a general problem and might thus also be relevant for treatment in humans, or whether the rat retina forms just an exception. Thus, further detailed analysis of the cellular and molecular mechanisms underlying the integration process of transplanted photoreceptors represent an essential prerequisite for the development of a safe and efficient therapy, aiming to treat retinal degenerative diseases characterized by photoreceptor loss. / Degenerationserkrankungen der Netzhaut (Retina) sind in Industrieländern die Hauptursache für verminderte Sehfähigkeit und Blindheit. Sowohl Umweltfaktoren als auch vererbte Mutationen können Defekte wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) oder Retinitis pigmentosa (RP) auslösen und führen zu einem sehr variablen Krankheitsbild. Eine Gemeinsamkeit aller Formen ist das Absterben der lichtdetektierenden Fotorezeptoren (Stäbchen und/oder Zapfen). Dieses kann entweder durch direkte Schädigung, oder als Sekundäreffekt nach Degeneration der unterstützenden Zellen erfolgen. Obwohl im Moment vielversprechende Behandlungsansätze untersucht werden, ist es zurzeit nicht möglich, retinale Degenerationserkrankungen dieser Art zu heilen. Ein erfolgversprechender Ansatz könnte jedoch der Ersatz der degenerierten Zellen durch transplantierte Fotorezeptoren sein. Erste Studien demonstrierten die spezifische Anreicherung von primären Fotorezeptoren aus der Netzhaut neugeborener Mäuse und deren subretinale Transplantation in Wildtyp-Mäuse und Mausmodelle mit retinaler Degeneration. Die transplantierten Zellen integrierten in die Empfängernetzhaut und entwickelten sich in ausgereifte Fotorezeptoren und konnten unter anderem bei nachtblinden Mäusen die Sehfähigkeit bei Dunkelheit verbessern. Die Differenzierung von humanen oder murinen ES- und iPS-Zellen in vitro in vollständige Retinae und die Transplantation daraus gewonnener Fotorezeptoren in Mäuse, bilden vorläufig den Höhepunkt dieser Entwicklung. Obwohl die Fortschritte der jüngsten Vergangenheit beeindruckend sind, sollten vor der sicheren und effektiven Anwendung einer retinalen Zellersatztherapie als therapeutische Maßnahme beim Menschen noch einige wissenschaftliche Fragestellungen beantwortet werden. Studien zeigen, dass Zellpopulationen, die direkt aus der Spendernetzhaut entnommen und transplantiert wurden, auf Grund ihrer Heterogenität in geringeren Zahlen in die Empfängerretina einwandern als angereicherte Fotorezeptoren. Zusätzlich besteht bei unsortierten Zellen, die aus Stammzellpopulationen gewonnen wurden, das Risiko einer Tumorbildung. Daher haben wir die magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) zur Anreicherung junger Fotorezeptoren etabliert. Die dabei benötigten, für Fotorezeptoren spezifischen, Oberflächenproteine wurden mit Hilfe von Microarray-Analysen des Transkriptoms junger Stäbchen von Mäusen identifiziert. Dabei wurde unter anderem die 5\'-Nukleotidase (Nt5e, CD73) entdeckt, die uns die erfolgreiche Anreicherung junger Mausfotorezeptoren mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS erlaubte. Die Transplantation dieser angereicherten Zellpopulation in die Netzhaut von Empfängertieren resultierte in einer signifikant erhöhten Integrationsrate im Vergleich zu nicht-angereicherten retinalen Zellen. Die Überprüfung der Nutzbarkeit weiterer identifizierter Oberflächenproteine zur Zellanreicherung bzw. die Übertragung der etablierten Protokolle zur Zellsortierung und Transplantation auf Fotorezeptoren aus ES- und iPS-Zellkulturen, sollten im Fokus nachfolgender Experimente stehen. Die Integration transplantierter Zellen in die Empfängernetzhaut ist ein komplexer Prozess und von unterschiedlichen Einflussfaktoren abhängig. Durch Transplantationsexperimente in alternden Wildtyp-Mäusen und einem Mausmodell, dessen Fotorezeptorschicht keine Stäbchen und stattdessen nur Zapfen und zapfenähnlichen Fotorezeptoren aufweist, konnte gezeigt werden, dass vor allem die Aktivierung von Müllerzellen die Integrationsrate der Fotorezeptoren erhöht. Neben dieser sogenannten Gliose werden weitere Faktoren, wie die reduzierte Stabilität der äußeren Grenzmembran, die flächenmäßig größere Verteilung der transplantierten Zellen im subretinalen Raum oder die reduzierte Dichte der Zellen in der äußeren Körnerschicht, als potentielle integrationsfördernde Komponenten in Betracht gezogen. Diese bilden interessante Schwerpunkte für weitere Forschungen, um eine ausreichende Zellintegration durch Manipulation der Empfängernetzhaut, auch in der klinischen Anwendung, zu erreichen. Obwohl Transplantationsexperimente zusätzlich zur Maus auch in anderen Empfängerspezies, wie Ratten und Schweinen, durchgeführt wurden, liegen bis jetzt keine Studien vor, die die in der Maus erfolgreich etablierten Protokolle der Zellanreicherung und Transplantation von Fotorezeptor-Suspensionen in diesen Spezies reproduzierte. Der Transfer dieser Technik und eine Generalisierung der Anwendbarkeit eines Fotorezeptorersatzes durch Transplantation in verschiedenen Säugetierarten geben jedoch wichtige Hinweise für eine mögliche Translation dieser Technologie für klinische Anwendungen. Deshalb haben wir unser bereits an der Maus getestetes Protokoll auf die Ratte übertragen und erfolgreich Fotorezeptoren der Ratte mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS angereichert. Nach deren Transplantation in die Netzhaut von Ratten und Mäusen zeigten die Rattenfotorezeptoren aber eine stark verminderte Integrationsfähigkeit und das Fehlen einer reifen Fotorezeptormorphologie. Speziell in Hinsicht auf eine zukünftige klinische Anwendung sind diese Ergebnisse relevant, da sie die Frage aufwerfen, ob die mangelnde Integration in der Ratte ein generelles Problem darstellt und daher auch beim Menschen zu erwarten ist, oder ob sie nur eine Ausnahme im Rattenmodell bildet. Aus diesem Grund bildet die weitere Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen der Integration transplantierter Fotorezeptoren eine wichtige Grundlage für die Entwicklung einer sicheren und effizienten Therapie mit dem Ziel, degenerative Netzhauterkrankungen zu heilen.

L’obésité est en croissance rapide à l’échelle mondiale et représente un facteur de risque important pour plusieurs pathologies, dont la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Dans l’obésité, le tissu adipeux blanc (WAT) subi un remodelage pathologique caractérisé par le recrutement de macrophages pro-inflammatoires facilitant l’établissement de l’inflammation stérile systémique. Contrairement au WAT, les tissus adipeux brun (BAT) et beige (BgAT) participent à la thermogénèse, un processus qui libère de la chaleur en métabolisant les lipides. En raison de leurs potentiels effets physiologiques bénéfiques, le recrutement d’adipocytes et l’activation de ces types spécifiques de tissu adipeux (AT) ont fait l’objet de multiples recherches et débats. Malgré les avancées considérables dans le domaine, les mécanismes impliqués dans l’activation du BAT et du BgAT ainsi que les mécanismes impliqués dans le développement de l’obésité et leur contribution à des maladies comme la DMLA, restent mal définis. Dans un premier temps, nous avons développé le protocole RELi pour permettre une extraction et une quantification fiable des protéines du AT murin saturé en lipides. Notre protocole élimine les lipides contaminants en excès, réduit la variabilité du chargement de protéines pour le western blot et l’usage de gènes de ménage standards (Article #1). Ensuite, nous avons étudié l’inflammation au niveau du BAT dans un modèle d’obésité induite par l’alimentation. La délétion de la Neuropiline 1 (NRP1) chez les macrophages résidents du tissu adipeux (ATMs) a provoqué une diminution des densités de la vasculature et de l’innervation. De plus ces souris sont devenues plus sensibles à l’exposition au froid suggérant un rôle des ATMs-Nrp1+ dans la régulation de l’homéostasie du BAT et de la température corporelle (Article #2). Finalement, nous avons exploré l’axe BgAT-DMLA; plus spécifiquement son impact potentiel sur la néovascularization choroïdienne (CNV) en utilisant des approches in vivo et in vitro. Nous avons démontré que la délétion génétique de PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16 (PRDM16), un gène impliqué dans la thermogénèse, conduit à une réduction de la CNV, et que la réintroduction d’AT-PRDM16+ exacerbe la formation de CNV pathologique. Le traitement d’explants de choroïde avec du milieu conditionné par des adipocytes-PRDM16+ augmente la croissance des vaisseaux sanguins. Ensemble, les données suggèrent un rôle sécrétoire potentiel pour le BgAT-PRDM16+ capable d’influencer la formation distale de CNV qui pourrait être pertinente pour la DMLA (Article #3). Les travaux présentés dans cette thèse établissent les bases d’un protocole permettant l’obtention de résultats reproductibles dans l’étude du AT, soulignent l’importance des ATMs- Nrp1+ dans la régulation de l’homéostasie du BAT et explorent pour la première fois l’implication du BgAT-PRDM16+ chez la DMLA neovasculaire. Ce travail établit les bases de la compréhension des mécanismes moléculaires reliant la régulation du AT thermogénique et les pathologies caractérisées par un excès de gras. Ce travail souligne également l’importance d’évaluer l’activation du BgAT chez les patients atteints de la DMLA. / Obesity is rapidly growing worldwide and represents a significant risk factor to several pathologies, including age-related macular degeneration (AMD). In obesity, the white adipose tissue (WAT) undergoes a strong remodeling characterized by the recruitment of pro- inflammatory macrophages, facilitating low-grade chronic inflammation. Unlike WAT, brown (BAT) and beige (BgAT) adipose tissues participate in thermogenesis, a process that releases heat by metabolizing lipids. Due to the likely beneficial physiological effects of BAT and BgAT, the recruitment of adipocytes and activation of these specific types of adipose tissue (AT) has been the subject of much research and debate. Despite considerable advances in the field, the mechanisms involved in BAT- and BgAT-activation as well as mechanisms involved in the development of obesity and their contribution to diseases such as AMD, remain ill-defined. First, we developed the RELi protocol to allow a reliable extraction and quantification of proteins from murine AT saturated with lipids. Our protocol eliminates excess contaminating lipids, reduces the variability of protein loading in Western blot and stabilizes expression of housekeeping genes (Article #1). Next, we investigated the inflammatory component of BAT in a diet-induced obesity model. The deletion of NRP1 in resident adipose tissue macrophages (ATMs) led to the expansion of the BAT and affected the densities of the vasculature and the innervation. Moreover, these mice became more sensitive to cold exposure, suggesting a role of ATMs-Nrp1+ in the regulation of BAT homeostasis and body temperature (Article #2). Lastly, we explored the axis of BgAT and AMD; more specifically, its potential impact on choroidal neovascularization (CNV) using in vivo and in vitro approaches. We demonstrated that the genetic deletion in BgAT of PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16 (PRDM16), a gene involved in thermogenesis, leads to a reduction of CNV, and that the reintroduction of BgAT-PRDM16+ via AT transplantation exacerbates the formation of pathological CNV. Treatment of choroid explants with PRDM16+-adipocyte-conditioned medium augmented blood vessel growth. Altogether, the data suggest a potential secretory role for BgAT-PRDM16+ to influence distal CNV formation that could be relevant to AMD (Article #3). The work presented in this thesis establishes the basis of a protocol allowing reproducible results in the study of AT, underlines the importance of ATMs-Nrp1+ in the regulation of BAT homeostasis and explores, for the first time, the involvement of BgAT-PRDM16+ in neovascular AMD. This work sets the basis for the understanding of the molecular mechanisms linking the regulation of thermogenic AT and pathologies characterized by an excess of fat. This work also highlights the importance of assessing the activation of BgAT in patients with AMD.

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