Seven naturally occurring pyranocarbazole alkaloids (pyrayafoline A–E, O-methylmurrayamine A and O-methylmahanine) have been obtained by total synthesis using a palladium(II)-catalysed oxidative cyclisation of a diarylamine to an orthogonally diprotected 2,7-dihydroxycarbazole as key step.

We describe an efficient synthesis of the methylene-bridged biscarbazole alkaloids bismurrayafoline-A, bismurrayafolinol and chrestifoline B–D using an Ullmann-type coupling at the benzylic position.

We describe an efficient synthesis of the methylene-bridged biscarbazole alkaloids bismurrayafoline-A, bismurrayafolinol and chrestifoline B–D using an Ullmann-type coupling at the benzylic position.

Einleitung: Im Pferdesport kann es heutzutage durch die starke Verbesserung der Sensitivität der eingesetzten Nachweismethoden bereits durch die Aufnahme von mit dopingrelevanten Stoffen kontaminiertem Futter zu positiven Anti-Doping-Proben kommen. Dies trifft insbesondere für Alkaloide zu. Wird nach dem tiermedizinisch begründeten Einsatz von Arzneimitteln bei Sportpferden keine ausreichende Frist beachtet, können auch hierdurch Fälle unabsichtlichen Dopings auftreten. Ziele der Untersuchung: Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die zur Verhinderung unabsichtlichen Dopings nach Arzneimittelanwendung durch den Tierarzt benötigten Informationen in den webbasierten Veterinärmedizinischen Informationsdienst für Arzneimittelanwendung, Toxikologie und Arzneimittelrecht (VETIDATA) zu integrieren. Dafür sollten insbesondere die Regel der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V. (FN) und des Weltpferdesportverbandes Fédération Équestre Internationale (FEI) berücksichtigt werden. Die International Federation of Horseracing Authorities (IFHA) hat im Jahr 2014 Rückstandshöchstmengen für die Kontrolle bestimmter dopingrelevanter Futtermittel-kontaminanten festgelegt. Die wissenschaftliche Untersuchung und Validierung der International Residue Limits (IRL) der Alkaloide Atropin, Scopolamin, Morphin, Koffein und Theophyllin war das zweite Ziel dieser Untersuchung. Material und Methoden: Zunächst wurde in VETIDATA ein Anti-Doping-Informationsmodul integriert. Zur Speicherung der für die Informationsanzeige benötigen Daten wurden Datenbanktabellen entwickelt und mit dem VETIDATA-System verknüpft. Zur Anzeige der Information wurde anschließend ein Prototyp der Darstellungslogik mit der Programmiersprache PHP erstellt. Dieser diente als Grundlage für die Aufnahme des Anti-Doping-Informationsmoduls in die Webseite von VETIDATA. Zur Bewertung der IRLs der untersuchten Alkaloide wurde eine systematische Metaanalyse durchgeführt. Zuerst wurden die Literaturdatenbanken PubMed, Web of Science, CABI und die Publikationsdatenbanken der deutschsprachigen veterinärmedizinischen Fakultäten und Hochschulen nach potentiell relevanten Veröffentlichungen durchsucht. Nach Anwendung von Inklusionskriterien, die z.B. Alter, Tierart, verabreichten Stoff und dessen Dosis, Applikationsweg und Angaben zu pharmakokinetischen Parametern in den Publikationen berücksichtigten, wurden die für diese Arbeit geeigneten Studien identifiziert und anschließend die darin enthaltenen pharmakokinetischen Daten extrahiert. Die Parameter Clearance, Verteilungsvolumen und Halbwertszeit wurden statistisch auf das Vorliegen einer Normalverteilung geprüft und der jeweilige Mittelwert, das 95%-Konfidenzintervall sowie die Standardabweichung wurden berechnet. Dosis-Urinkonzentrationsverhältnisse wurde mittels linearer Regressionsanalysen untersucht. Diese Daten dienten als Grundlage für die Berechnung geeigneter Grenzwerte mithilfe von in der Literatur beschriebenen Methoden. Ergebnisse: Das erstellte Anti-Doping-Informationsmodul beinhaltet Angaben zum Status von 863 Wirkstoffen nach den Regeln der FEI und der FN. Diese umfassen alle in Deutschland in für Pferde zugelassenen Arzneimitteln enthaltenen wirksamen Substanzen sowie alle weiteren bei nicht von der Lebensmittelgewinnung ausgeschlossenen Pferden nach geltendem Recht anwendbaren Stoffe. Diese Informationen können vom Nutzer auf VETIDATA an unterschiedlichen Stellen abgerufen werden und sind direkt mit den für Pferde zugelassenen Tierarzneimitteln verknüpft. Für die Durchführung der Metaanalyse der IRLs wurden 1173 potentiell nutzbare Studien in der Literatur identifiziert. Nach Anwendung der Inklusionskriterien konnten Daten aus 42 Studien in die Metaanalyse inkludiert werden. Diese erlaubten eine statistische Untersuchung pharmakokinetischer Parameter für Morphin, Theophyllin und Koffein, nicht aber für Atropin und Scopolamin. Eine lineare Regressionsanalyse der Dosis-Urinkonzentrationsverhältnisse war bei Scopolamin und Koffein möglich. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen erlaubten in Verbindung mit nicht statistisch bearbeiteten Daten aus den inkludierten Studien die Anwendung einer Methode zur IRL-Bewertung von Atropin und Scopolamin, von zwei Methoden für Morphin und Theophyllin und von drei Methoden für Koffein. Dabei zeigte sich, dass von den untersuchten Stoffen nur die IRLs von Atropin und Theophyllin in geeigneter Höhe festgelegt wurden, um positive Dopingbefunde durch die Aufnahme von geringgradig kontaminierten Futtern zu verhindern. Die IRLs von Morphin, Theophyllin und Koffein sind geeignet, das Bestehen eines relevanten pharmakologischen Effekts nach systemischer Anwendung dieser Stoffe auszuschließen, was für Atropin und Scopolamin aufgrund der mangelhaften Datenlage nicht sicher beurteilt werden konnte. Ein eventuell vorhandener pharmakologischer Effekt nach lokaler Anwendung kann durch die IRLs von Atropin und Scopolamin nicht sicher ausgeschlossen werden. Die Eignung des IRL von Morphin für diesen Zweck wurde als fraglich beurteilt, während diese Fragestellung für Koffein und Theophyllin nicht relevant war. Das Fehlen eines IRL für den aus Koffein bzw. Theophyllin gebildeten aktiven Metaboliten Paraxanthin wurde als erheblicher Mangel am bestehenden IRL-System erkannt. Schlussfolgerungen: Die Integration des Anti-Doping-Informationsmoduls in VETIDATA ermöglicht Tierärzten einen einfachen und schnellen Zugang zu den für die Arzneimittelanwendung bei Sportpferden benötigten Informationen. Das IRL-System der IFHA erfüllt in seiner aktuellen Form nicht alle Anforderungen, die im Sinne eines fairen und dopingfreien Pferdesports zu stellen sind. Geeignete Änderungen an diesem System könnten eine Verbesserung der Einschätzung für Koffein und Theophyllin ermöglichen. Systematische Mängel des IRL-Systems erfordern einen strukturell anderen Ansatz zur Kontrolle der auch lokal wirksamen Stoffe Atropin, Scopolamin und Morphin.

Endophytes live in partial symbiosis inside a plant and have been detected in all tested plants. They belong to the group of fungi or bacteria and their ecological function is mostly unknown. The fungal endophytes of the genus Epichloë belong to a special group of endophytes. Epichloë endophytes live symbiotically inside cool season grass species and some of them are able to produce alkaloids toxic to vertebrates and insects. Their symbiosis is seen as mutualistic for the following reasons: the fungus provides the plant herbivore resistance by producing alkaloids, and it increases the plant’s drought tolerance as well as its biomass production. In return, the grass provides the fungus shelter, nutrients and dispersal. Epichloë endophytes are host specific and the ability to produce alkaloids differs between species. In order to estimate intoxication risks in grasslands, it is necessary to detect infection rates of different grass species with Epichloë endophytes, and to determine the genotypes and chemotypes of the Epichloë species as well as the produced alkaloid concentrations. Factors like land-use intensity or season may have an influence on infection rates and alkaloid concentrations. Also, different methodological approaches may lead to different results. In this doctoral thesis my general aim was to evaluate intoxication risks in German grasslands caused by Epichloë endophytes. For that I investigated infection rates of different grass species and the genotypes and chemotypes of their Epichloë endophytes in German grasslands (Chapter II). Furthermore, I compared alkaloid concentrations detected with dry and fresh plant weight and different analytical methods. I also detected possible changes on the influence of season or land-use intensity (Chapter III). Additionally, I examined infections with Epichloë endophytes and alkaloid concentrations in commercially available grass seed mixtures and determined how that influences the intoxication risk of grazing animals in Europe (Chapter IV). It is of agricultural interest to estimate intoxication risks for grazing livestock on German grasslands due to Epichloë infected grass species. Therefore, it is important to investigate which grasses are infected with the Epichloë endophyte, if the endophytes have the ability to produce vertebrate and invertebrate toxic alkaloids and if the alkaloids are indeed produced. I showed that Epichloë festucae var. lolii infecting agriculturally important Lolium perenne lacked the starting gene for ergovaline biosynthesis. Hence, vertebrate toxic ergovaline was not detected in the majority of the collected L. perenne plants. The detection of alkaloid concentrations is an important tool to estimate intoxication risk for vertebrates, but also invertebrates. My studies showed that the usage of dry plant material is crucial to quantify the correct alkaloid concentrations, and that alkaloid concentrations can vary depending on the detection method. Hence, the usage of validated, similar detection methods is important to be able to compare alkaloid concentrations from different studies. Nevertheless, the trends of seasonal changes and the influence of land-use intensity stayed the same, regardless if dry or fresh plant weight was used. Also, alkaloid concentrations were below toxicity thresholds on population level, regardless of the method used. Two commercially available forage grass and two commercially available turf grass seed mixtures were infected with Epichloë endopyhtes and alkaloids were detected. This might contribute to the spreading of Epichloë endopyhtes in Germany, therefore seed mixtures should be tested for Epichloë infections. My results indicate that the intoxication risk is generally low in Germany at the moment, although that might change due to climate change, an increase of monocultural land-use, or the seeding of Epichloë infected grass seeds. / Endophyten leben, zumindest zeitweise, symbiontisch in Pflanzen und sind bisher in allen untersuchten Pflanzen nachgewiesen worden. Es handelt sich dabei um Pilze oder Bakterien und ihre ökologische Funktion ist meistens unbekannt. Eine spezielle Gruppe der Endophyten sind Pilzendophyten der Gattung Epichloë. Diese leben symbiontisch innerhalb von kaltgemäßigten Grasarten und einige sind in der Lage vertebraten- und/oder insektentoxische Alkaloide herzustellen. Die Symbiose wird meist als mutualistisch bezeichnet, weil der Pilz der Pflanze einen Herbivorenschutz durch die Produktion der Alkaloide und eine gesteigerte Trockenresistenz und Biomassesteigerung bietet. Das Gras hingegen bietet dem Pilz Unterkunft, Nährstoffe und Verbreitung. Epichloë Endophyten sind wirtsspezifisch und die Fähigkeit Alkaloide zu produzieren schwankt zwischen den Arten. Um das Vergiftungsrisiko im Grünland einzuschätzen, ist es nötig Infektionsraten verschiedener Grasarten mit Epichloë Endophyten, die Geno- und Chemotypen der Epichloë Arten, und die produzierten Alkaloidkonzentrationen zu bestimmen. Faktoren wie Landnutzungsintensität oder die Jahreszeit können Infektionsraten und Alkaloidkonzentrationen beeinflussen. Ebenso können Alkaloidkonzentrationen von methodischen Faktoren abhängen. In dieser Doktorarbeit habe ich Infektionsraten verschiedener Grasarten in Deutschland und die Geno- und Chemotypen ihrer Epichloë Endophyten untersucht (Kapitel II). Außerdem habe ich Alkaloidkonzentrationen mit Frisch- bzw. Trockengewicht gemessen und mit verschiedenen analytischen Methoden verglichen, um mögliche Änderungen beim Einfluss von Jahreszeiten oder der Landnutzungsintensität zu detektieren. Des Weiteren habe ich das Vergiftungsrisiko auf deutschen Grasflächen abgeschätzt (Kapitel III). Zusätzlich habe ich kommerziell erhältliche Grassaatgutmischungen auf Epichloë Infektionen und Alkaloidgehalt untersucht und habe versucht einzuschätzen, wie sich das auf das Vergiftungsrisiko von Weidevieh in Europa auswirkt (Kapitel IV). Die Einschätzung von Vergiftungsrisiken für Weidevieh aufgrund von Epichloë infizierten Grasarten auf deutschen Graslandflächen ist von landwirtschaftlichem Interesse. Deshalb ist es wichtig zu untersuchen, welche Grasarten mit Epichloë Endophyten infiziert sind, ob der Endophyt in der Lage ist vertebraten- oder insektentoxische Alkaloide zu produzieren und ob diese tatsächlich produziert werden. Ich konnte zeigen, dass Epichloë festucae var. lolii, welches das landwirtschaflich wichtige Lolium perenne infiziert, das Startgen für die Ergovalinbiosynthese fehlt. Deshalb wurde das vertebraten-toxische Ergovalin in der Mehrheit der gesammelten L. perenne Pflanzen nicht nachgewiesen. Die Detektion von Alkaloidkonzentrationen ist ein wichtiges Werkzeug, um das Vergiftungsrisiko für Vertebraten aber auch Invertebraten einschätzen zu können. Ich konnte zeigen, dass die Verwendung von trockenem Pflanzenmaterial essenziell ist, um korrekte Alkaloidkonzentrationen zu quantifizieren und dass Alkaloidkonzentrationen in Abhängigkeit von der Detektionsmethode schwanken können. Deshalb ist die Verwendung von validierten, ähnlichen Detektionsmethoden wichtig, um die Alkaloidkonzentrationen von verschiedenen Studien vergleichen zu können. Dennoch blieben die jahreszeitlichen Trends und der Einfluss von Landnutzungsintensität gleich, egal ob Trocken- oder Frischgewicht der Pflanze verwendet wurde und Alkaloidkonzentrationen lagen unter der Toxizitätsschwelle auf Populationsebene. Ich konnte außerdem zeigen, dass zwei kommerziell erwerbliche Futtergrasmischungen, sowie zwei Rasengrasmischungen mit Epichloë Endophyten infiziert waren und auch Alkaloide detektiert werden konnten. Das könnte zu einer weiteren Ausbreitung von Epichloë-Endophyten in Deutschland beitragen, weshalb Saatgutmischungen auf Epichloë Infektionen getestet werden sollten. Meine Ergebnisse zeigen, dass das Vergiftungsrisiko in Deutschland im Moment generell eher niedrig ist. Allerdings kann sich das auf Grund von Klimawandel, zunehmenden Monokulturen in der Landnutzung, aber auch der Aussaat von Epichloë infiziertem Saatgut ändern.

Within this thesis the first total syntheses of eight biologically active natural products from the family of carbazole alkaloids, antiostatins A1 to A4 and B2 to B5, were established. Spectroscopic data of the synthesised natural products are in good agreement with the isolated antiostatins from Streptomyces cyaneus 2007-SV1, which confirms the molecular structures assigned to the natural products. The total synthesis of the antiostatins A1 to A4 and B2 to B5 were achieved employing the iron-mediated synthesis to form the carbazole nucleus from a cyclohexadienylium iron salt and appropriate arylamines. This transition metal-mediated approach could be applied to all antiostatins in excellent yields. The antiostatins A1-4 and B2-5 represent the first carbazole alkaloids with an acetamide or substituted biuret chain. Introduction of the sophisticated substituents proceeded selectively on C-4 in high yields. Antiostatins A1 to A4 and B2 to B5 could be synthesised over eight steps from a tricarbonyliron-coordinated cyclohexadienylium salt. The overall yields are in the range of 31 – 63%.

Techn. Universiẗat, Diss., 2002--Braunschweig.

Die Ziele dieser Arbeit waren die Darstellung der Naturstoffe Murrayachinon-B–E und Pyrayachinon-A–C, sowie die Synthese einiger nicht natürlicher, potentiell anti-Tuberkulose-aktiver Carbazole und Carbazolchinone. Für die Darstellung der aus der Pflanze Murraya euchrestifolia Hayata isolierten Naturstoffe wurden verschiedene synthetische Herangehensweisen untersucht: Die Transformation eines 7 Hydroxycarbazolchinons in die Zielverbindungen gelang nicht, ebenso wie die Syntheseroute über eine trioxygenierte Vorstufe. 7-Methoxy-3-methyl-1-tosyloxycarbazol (A) ließ sich jedoch in einer Ausbeute von 76 % über drei Stufen darstellen. Ausgehend von A konnten die Zielverbindungen regioselektiv in fünf bis sieben Stufen in Gesamtausbeuten von 10 % bis 46 % synthetisiert werden. Der Pyranring in Pyrayachinon-A wurde dabei über eine Sequenz aus Bromierung, Prenylierung, Cyclisierung und Oxidation aufgebaut. Die Anellierung der Pyranringe in Pyrayachinon-B und –C erfolgte, nach Methyletherspaltung an A in zwei Stufen. Die Einführung der Prenyl- und Geranylgruppen für die Synthese der Murrayachinone gelang durch reduktive Pyranringöffnung bzw. über eine Sequenz aus Methyletherspaltung, Propargylierung, partieller Hydrierung und Umlagerung. Außerdem wurde für Murrayafolin-B, Bismurrayafolin-B und -D über diese Syntheseroute ein Zugang geschaffen. Diese Verbindungen konnten, ausgehend von A, in sechs bzw. sieben Stufen in Gesamtausbeuten von 39 % bis 53 % dargestellt werden. Im Vergleich zu den bislang beschriebenen Synthesen dieser Verbindungen konnten alle Gesamtausbeuten signifikant gesteigert werden. Besonders hervorzuheben sind die Synthesen von Murrayafolin-B (bislang: 0.4 %, in dieser Arbeit: 40.0 %) und Pyrayachinon-A (bislang: 3.0 %, in dieser Arbeit: 22.1 %). Überdies wurde erstmalig die palladiumkatalysierte oxidative Cyclisierung eines O-tosylgeschützten Diarylamins zu einem Carbazol beschrieben. In Fortführung vorangegangener Arbeiten wurden zehn bislang nicht beschriebene Derivate des anti-Tuberkulose-aktiven 3-Methoxy-2-methylcarbazol-1,4-chinons dargestellt, darunter neun Carbazolchinone und ein Carbazol. Die Synthese der Carbazolchinone gelang palladiumkatalysiert in je vier bis sechs Stufen. Das Carbazol wurde eisenvermittelt über fünf Stufen dargestellt. Die Untersuchung der Aktivität gegenüber Mycobacterium tuberculosis steht noch aus.

Seven naturally occurring pyranocarbazole alkaloids (pyrayafoline A–E, O-methylmurrayamine A and O-methylmahanine) have been obtained by total synthesis using a palladium(II)-catalysed oxidative cyclisation of a diarylamine to an orthogonally diprotected 2,7-dihydroxycarbazole as key step.

Ausgangspunkte der vorliegenden Arbeit waren stereoselektive Synthesen von Reissert-Verbindungen über chirale N-Acylisochinoliniumsalze. Es galt die Konfiguration der erhaltenen Produkte zu beweisen und deren Synthesepotential zu erforschen. Ein Ziel dieser Arbeit war es, weiterführende Reaktionen für die Synthese von alkaloidanalogen Substanzen zu entwickeln. Es gelang, die Reissert-Reaktion mit Chlorameisensäurementhylester erfolgreich auf andere Heterocyclen als Isochinolin auszudehnen. Die Annahme eine stereoselektiven Verlaufes mußte korrigiert werden. Das Reissert-Produkt konnte mit einer großen Anzahl von Alkylhalogeniden in 1-Position alkyliert werden. Die Cyanogruppe konnte in zwei Verfahren abgewandelt werden. Die Behandlung des Reissert-Produktes und der alkylierten Verbindungen mit Säuren, Halogen und Grignard-Reagenzien führte zu verschiedenen interessanten Cyclisierungen. Es gelang, die Reissert-Reaktion auf elektronenreiche Aromaten und metallorganische Reagenzien als Nucleophile zu erweitern. Es gelang eine asymmetrische C-C-Knüpfung mit Zink-Nucleophilen sowie Grignard-Verbindungen. 4-Bromsubstituierte Mannich-Produkte konnten erfolgreich in einer Suzuki-Kupplung zu 4-arylsubstituierten Isochinolinaddukten umgesetzt werden. Es gelang die Hydrierung der Enamindoppelbindung und die Abspaltung des chiralen Auxiliars auf zwei verschiedenen Wegen. Während Additionsreaktionen an die 1-Position von 2-Menthyloxcarbonylisochinoliniumsalzen im wesentlichen nicht stereoselektiv verliefen, konnte beim Einsatz von geschützten Aminosäurefluoriden als chirale Auxiliare Diastereoselektivitäten bis zu 6:1 erzielt werden. Der Einsatz der elektronenreichen Aromaten als Nucleophile führte zu Mannich-Produkten in guten Ausbeuten. Auch der Einsatz von Grignard-Reagenzien als Nucleophile konnte erfolgreich getestet werden. Hiermit ist die erste stereoselektive Addition von elektronenreichen Aromaten an cyclische Iminiumsalze gelungen. / Starting points of the present work were stereoselective syntheses of Reissert compounds about chiral N-acylisoquinoliniumsalts. It was a matter of proving the configuration of the preserved products and of investigating synthesis potential. A purpose of this work was to develop continuing reactions for the synthesis of alkaloide-analogous substances. One succeeded in expanding the Reissert reaction with menthylchloroformat successfully to other heterocycles than isoquinoline. The acceptance a stereoselective course had to be corrected. The Reissert product could be alkylated with a big number of alkylhalides in 1 position. The Cyanogroup could be modified in two procedures. The treatment of the Reissert product and the alkylated compounds with acids, halogens and Grignard reagents led to different interesting cyclisations. One succeeded in extending the Reissert reaction to electronrich aromatic and heteroaromatic compounds and metal-organic reagents as nucleophiles. An asymmetrical C-C-bondformation with Zink-nucleophiles as well as Grignard compounds succeeded. 4-Bromine-substituted Mannich products could be transformed successfully in a Suzuki coupling to 4-arylsubstituted isoquinolineadducts. The hydrogenation of the enamindoublebond and the splitting off chirale auxiliary on two different ways succeeded. While addition reactions ran to the 1 position of 2-Menthyloxcarbonylisoquinoliniumsalts basically not stereoselectively, could be achieved by the application by protected Aminosäurefluoriden as chirale auxiliaries slide stereo selectivities up to 6:1. The application of the electronrich aromatics as nucleophiles led to Mannich products in good exploiting. Also the application of Grignard reagents as nucleophiles could be tested successfully. Herewith the first stereoselective addition from electronrich aromatics to cyclic iminiumsalts has succeeded.