Die Rolle der Dendritischen Zellen (DZ) bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Allergien ist schon lange Gegenstand der Forschung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten zur Erforschung dieser wichtigen Immunzellen, vor allem auch im Hinblick auf klinische Studien, auf die Spezies Pferd erweitert werden. Die Erkrankung des Sommerekzems bietet hierbei ein bereits bis auf Genebene analysiertes und identifiziertes Allergen, mit einem klinisch eindeutigen, vor allem beim Islandpferd häufig auftretenden Krankheitsbild. Der Idee, ausreichend DZ aus Vollblut beim Pferd ex vivo zu generieren, mit dem aufgearbeiteten Culicoidesprotein zu beladen, damit künftig solche DZ dem betroffenen Spendertier als Immuntherapie reinjiziert werden können, sollte hier näher nachgegangen werden. Die ausreichende und möglichst reine Generierung equiner DZ stellte die erste Hürde dar und konnte nach Vergleich und Verbesserung einiger unterschiedlicher Protokolle mit befriedigendem Ergebnis bewältigt werden. Funktionelle Analysen der so gewonnenen DZ zeigten die gewünschten, aus den humanen und murinen Studien bekannten Reaktionen der Zellen wie MHC-II-Hochregulierung, T-Zell-Stimulationsvermögen sowie Antigenaufnahme mittels Endozytose. Die angestrebte Aufnahme des markierten Culicoidesproteins in die Zellen konnte ebenso per Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie nachvollzogen werden. Eine äußerst wichtige Erkenntnis ergab sich aus der Zytokinuntersuchung auf RNA-Ebene, wo eine deutliche Erhöhung der RNA für IL-12 nach In-vitro-Stimulation mit LPS oder Culicoidesprotein nachgewiesen werden konnte. Dies ist ein Hinweis auf die eventuellen Nutzungsmöglichkeiten des hier beschriebenen DZ-Typs im Rahmen einer angestrebten Therapie der am Sommerekzem erkrankten Tiere. Denkbar wäre zum Beispiel die Initiierung einer Immuntherapie, abzielend auf Immundeviation. Die Culicoides-beladenen DZs sollten, repetitiv injiziert, über IL-12 dabei zu einer Unterdrückung der TH2-Immunantwort zu Gunsten von T-Helfer-1-Zellen (TH1) führen. Dieser erste Ansatz für eine klinische Anwendung der hier beschriebenen DZs soll zusätzlich auch die Forschungsbemühungen auf das Pferd und die hier noch im Verborgenen liegenden Erkenntnisse zum Verständnis von Allergien lenken.

L'inflammation allergique de la peau est un état dans lequel l'hôte réagit de manière excessive à des allergènes en induisant une inflammation de type Th2. Un certain nombre d’acteurs cellulaires et moléculaires ont été impliqués dans cette pathologie, mais la façon dont ils agissent dans le réseau inflammatoire demeure largement inconnue. Les basophiles ont été reconnus pour leurs fonctions effectrices en allergie, cependant, comment ils sont recrutés et activés, ainsi que comment ils interagissent avec d'autres cellules dans l’inflammation allergique cutanée demeurent mal caractérisés. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans le réseau inflammatoire de la peau allergique. En employant un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique, combiné à des outils génétique de souris, d’immunologie et d’approches biologiques cellulaires/moléculaires, l’étude de ma thèse a démontré que l’IL-3 joue un rôle crucial dans l’extravasation des basophiles dans la peau allergique des souris (Partie I), et que l’invalidation des basophiles chez les souris Mcpt8DTR entraîne une réduction systémique des éosinophiles et des neutrophiles (Partie II). Ces études fournissent ainsi de nouvelles connaissances sur le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans l'inflammation allergique de la peau. / Allergic skin inflammation is a state in which the host overreacts to otherwise innocuous allergens by inducing T helper type 2 inflammation. A number of cellular and molecular players have been implicated in the generation of allergic skin inflammation, but how they act and crosstalk in the inflammatory network remains largely unknown. Basophils have been recognized for their effector functions in allergy, however, how they are recruited to the inflamed tissue, get activated and crosstalk with other cells in inflammatory skin remain still incompletely understood. The objective of this PhD study is to investigate the recruitment, activation and function of basophils in the inflammatory network of allergic skin. Using experimental mouse model for allergic contact dermatitis, combined with mouse genetic tools, immunology and cellular/molecular biology approaches, the study of my thesis discovered that IL-3 plays a crucial role in basophil extravasation to mouse allergic skin (Part I), and that the depletion of basophils in Mcpt8DTR mice leads to a systemic reduction of eosinophils and neutrophils (Part II). These studies provide novel insights into the recruitment, activation and function of basophils in allergic skin inflammation.

Les maladies allergiques sont devenues un enjeu de santé publique majeur en raison d’une prévalence en constante augmentation ces dernières années, d’un risque accru de choc anaphylactique et de l’absence de traitement curatif existant. Les allergies alimentaires sont caractérisées par une évolution fréquente vers le choc anaphylactique. Les lymphocytes T régulateurs (Treg), cellules permettant le maintien de l’homéostasie immunitaire et le contrôle des réponses, sont au centre du processus de régulation des réponses allergiques. Il a été démontré qu’il existait un déficit quantitatif et qualitatif de ces cellules chez les patients allergiques et que les manifestations allergiques étaient exacerbées en l’absence de Treg. L’induction, in vivo, de ces cellules semble donc être une alternative thérapeutique prometteuse afin de prévenir et traiter les maladies allergiques en particulier, l’allergie alimentaire. L’interleukine-2 (IL-2), cytokine du système immunitaire permettant la survie, l’expansion et la différenciation des lymphocytes, notamment les Tregs lorsqu’elle est utilisée à faible dose, constitue une avancée thérapeutique majeure. L’objectif de cette thèse a été d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’IL-2 faible dose dans l’allergie alimentaire. L'IL-2 faible dose induit l’expansion et l’activation de Treg permettant la mise en place d’une protection contre les manifestations cliniques d'allergie alimentaire dans deux modèles de souris avec l'ovalbumine et l'arachide. L’abolition de cet effet clinique chez les souris dont les Treg ont été éliminés démontre la contribution majeure des Treg dans l'efficacité de la thérapie IL-2. Les mécanismes associés à la protection peuvent être corrélés à une modification locale de la balance Th1 / Th2 et une inhibition du recrutement et de l'activation des mastocytes. Nous avons démontré que l’IL-2 induit une protection clinique durable, supérieure à 7 mois, aussi bien lorsqu’elle est administrée de façon préventive (avant la phase de sensibilisation), que curative (après la sensibilisation ou le déclenchement de l’allergie). Cette protection à long terme est également dépendante des Treg dans la mesure où leur déplétion entraine la perte de protection de souris. Ces résultats, combinés à l’absence visible d’augmentation des Treg en fin de protocole, nous ont conduits à caractériser les mécanismes immunorégulateurs inhérents à ce contrôle effectif à distance et sur le long terme après traitement, en analysant notamment les sous populations de cellules régulatrices particulièrement efficace pour contrôler les réponses allergiques. Les résultats préliminaires obtenus, qu’il conviendra de reproduire, ne nous permettent pas de conclure clairement quant à la sélection des Treg spécifiques de l’allergène, ou de sous population de Treg, réputées protectrices dans l’allergie. Toutefois, nos résultats constituent la preuve de concept de l’utilisation de l’IL-2 faible dose dans l’allergie alimentaire. De même l’IL-2 a également montré son efficacité dans un modèle murin d’allergie respiratoire (ovalbumine). Nous avons aussi démontré que des voies d’administration alternatives étaient possibles, notamment la voie orale. De ce fait, un essai clinique de phase II testant l’administration d’IL-2 faible dose dans la rhinoconjonctivite va prochainement être mise en place par notre centre d’investigation clinique. Ainsi, nous espérons développer une nouvelle biothérapie, sûre, efficace et peu coûteuse, dans la prise en charge thérapeutique des allergies. / Regulatory T cells (Treg) are pivotal for maintenance of immune self-tolerance, and also regulate immune responses to exogenous antigens, including allergens. Both decreased Treg number and function have been reported in allergic patients, offering new therapeutic perspectives. The in vivo induction of these cells therefore, appears to be a promising therapeutic option in order to prevent and treat allergic diseases in particular, food allergy. Interleukin-2 (IL-2), allowing the survival, expansion and differentiation of lymphocytes, especially Treg when used at low doses, is a major therapeutic advance. Here, we evaluated the ability of low dose IL-2 (intraperitoneal route to control) allergy in an experimental model of food allergy. Low dose IL-2 (ld-IL-2) induced Treg expansion and activation that elicited protection against clinical manifestations of food allergy in two mouse models with ovalbumin and peanut. This clinical effect was lost in Treg-depleted mice demonstrating the major contribution of Treg in ld-IL-2 efficacy. Also, protection from allergy could be explained by a Treg-dependent local modification of the Th1/Th2 balance and an inhibition of mast cell recruitment and activation. Then, preventive and therapeutic effects of ld-IL-2 were observed over a 7-month period, highlighting its long-term efficacy. This long-term protection is also dependent on Treg insofar as their depletion results in the loss of protection of mice. These results, with the loss of increase of Treg at the end of the protocol, led us to better characterize the immunoregulatory mechanisms involved in the ld-IL2 long term efficacy, in particular by analyzing subpopulations of Treg particularly effective in controlling allergic responses. The preliminary results obtained, which should be reproduced, do not allow us to conclude clearly to the selection of allergen-specific Treg, or Treg subpopulation involved in the regulation of allergic responses. However, our results demonstrate the proof of concept of the use of low-dose IL-2 in food allergy. Similarly IL-2 has also shown its efficacy in a mouse model of asthma (ovalbumin). Alternative routes of administration were also demonstrated, including oral route. As a result, a clinical trial testing low-dose IL-2 in rhinoconjunctivitis will soon be initiated by our center. The present data show for the first time the therapeutic potential of ld-IL-2 for the treatment of food allergy, and should prompt hope, in the therapeutic management of allergies. Patients will be offered the first curative treatment developed in food allergies to improve their quality of life. Keywords: Allergy, Interleukin 2, biotherapy, therapeutic option, allergen-specific Treg, peripheral Treg.

L’allergie de contact est une pathologie très répandue. Il n’existe cependant aucun traitement permettant de la soigner. L’éviction de l’allergène reste à ce jour reste le seul moyen de la prévenir. De nombreux tests visant à déterminer le pouvoir allergisant des molécules ont été développés. L’un de ces tests est le Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA), une méthode chimique visant à mimer une étape clé du mécanisme immunitaire menant à l’allergie de contact : la formation d’un complexe antigénique par réaction entre l’allergène et une protéine cutanée. Dans le cadre de la législation actuelle sur les cosmétiques, il pourrait être intéressant d’adapter ce test aux mélanges complexes. Le but de ce travail de thèse a été d’étudier la réactivité de différents mélanges d’allergènes connus vis-à-vis des trois peptides utilisés dans le DPRA et de la comparer à celle de chaque composant seul.Trois types de mélanges ont étés étudiés. Un mélange d’isothiazolinones utilisées comme conservateurs, trois mélanges binaires de trois aldéhydes utilisés comme parfums et enfin un mélange des deux responsables majeurs de l’allergie à l’absolu de mousse de chêne, un extrait utilisé en parfumerie. / Contact dermatitis is one of the most common health problems. It has unfortunately no cure yet. The only way to prevent it is to avoid contact with the allergen. Numerous tests have been developed in order to evaluate the allergenic potency of the tested chemical. One of these tests is the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) which aim is to mimic one of the key steps leading to sensitisation: the formation of an antigenic complex by reaction between the allergen and a cutaneous protein. Due to the recent legislation on cosmetic which ask to test every chemical used in the formulation of cosmetics it could be interesting to adapt the DPRA to complex mixtures.The aim of this PhD work is to study the reactivity of some known mixtures of allergens towards the three peptides used in the DPRA and to compare it with the reactivity of each compound alone.In this approach three different types of mixtures have been studied. The first one concerns two isothiazolinones used as preservatives the second one three different aldehydes used as fragrance and the third one concerns the main responsible of contact dermatitis to oak moss absolute a natural extract used in perfumery.

Up to now, solid organ transplantation remains the ultimate life-saving treatment for end-stage organ failure. However, transplantation could be complicated by allograft rejection wherein inflammation plays a pivotal role. In this process, inflammation secondary to ischemia/reperfusion and cell necrosis plays the role of adjuvant and enhances the antigen-specific adaptive response ultimately leading to allograft rejection. Therefore, anti-inflammatory strategies have to be developed to dampen inflammation and secondary alloreactivity. Recently, neuroimmune pathways and particularly the cholinergic anti-inflammatory pathway have been described to modulate inflammation in several experimental models as sepsis. The Vagus Nerve, the α7 nicotinic receptor (α7nAChR) and its agonists are specific targets to regulate the inflammatory response in several pathologies.The aim of this work is to investigate the potential protective effect of the cholinergic pathway in solid organ transplantation. In a model of renal ischemia/reperfusion injury induced by bilateral clamping of renal arteries, nicotine protects from renal dysfunction and tubular damages. This protection is associated to a reduction of inflammatory cytokines and neutrophils and is α7nAChR dependent. In a second part, we test the effect of the α7nACh receptor in a model of minor antigen mismatched skin allograft. Mice deficient for the α7nAChR reject earlier the skin allograft compared to α7nAChR +/+ mice and this is associated to higher Th1 and Th17 T cell responses. α7nAChR expressed on T cells is involved in skin allograft rejection as attested by adoptive transfer experiments in Rag H/H mice with either α7nAChR +/+ or α7nAChR H/H alloreactive T cells. The cholinergic pathway by itself or boosted by nicotinic agonists is able to modulate innate as well as acquired immune components involved in allograft rejection. Other agonists or devices used to stimulate the cholinergic pathway are actually developed in order to be more specific and to reduce toxicity. Our results are particularly relevant in human medicine as grafted organs lose their Vagus Nerve endings and their cholinergic regulatory innervation. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La confirmation d’une hypersensibilité médicamenteuse est importante car la plupart des cas allégués ne sont pas confirmés. Le diagnostic repose sur l’interrogatoire et le bilan allergologique, ce dernier comprenant surtout des tests in vivo. Ces tests ne sont pas dénués de risque. Ce travail se propose de répondre avec une méthodologie originale (pour le domaine de l’hypersensibilité médicamenteuse), à des questions en suspens visant la nécessité, les modalités et l’utilité du bilan allergologique, en prenant principalement mais pas exclusivement le modèle des hypersensibilités aux ß-lactamines. J’ai utilisé plusieurs approches méthodologiques, appliquées à une large base de données d’hypersensibilités médicamenteuses. Dans un premier temps, j’ai exploité les données cliniques rétrospectives afin de construire 2 modèles de diagnostic d’hypersensibilité aux ß-lactamines et j’ai ensuite testé leurs performances diagnostiques sur un échantillon prospectif de patients. Les modèles atteignent globalement une sensibilité de 50%, ce qui est difficilement acceptable, dans un contexte iatrogénique. Secondairement, j’ai réalisé le passage des protocoles de tests de provocation aux ß-lactamines, d’une étape avec paliers purement empiriques, à un protocole basé sur des données issues d’une analyse de survie. Autres 3 articles ont suivi une méthodologie similaire : les patients ayant eu un bilan allergologique négatif pour un médicament donné ont été re-contactés et interrogés au moyen d’un questionnaire. Le service rendu au patient a été calculé par le taux de patients ayant repris (sans réaction) le médicament autorisé (plus de 90% pour 3 classes médicamenteuses analysées). / Most alleged cases of hypersensitivity reactions following drug administration are actually ruled out by drug allergy work up. The diagnosis is based on clinical history and allergy tests, mainly in vivo tests. These tests carry a considerable risk of iatrogeny. The purpose of this thesis was to address some unmet needs regarding the need, technical aspects and utility of the drug allergy work up, using an original methodology applied to the drug hypersensitivity field. It focuses mainly (but not only) on drug hypersensitivity reactions to ß-lactams. I used different statistical methods, applied to a large database, the Drug Allergy and Hypersensitivity Database. First (Article 1), I used retrospective clinical data to build 2 models for ß-lactam hypersensitivity diagnosis. I then tested these models on a prospective sample, in order to analyze their diagnostic performances. The overall sensitivity of the 2 models is around 50%, which is unacceptable in an iatrogenic context. Second (Article 2), I worked on empirical protocols of drug provocation tests and I identified steps for data-driven, evidence-based protocols by means of survival analysis. The Articles 3, 4 and 5 were conceived following a similar methodology: patients with a negative drug allergy work-up for a certain drug were called and questioned on whether they had been exposed to this same drug, following allergy tests. High negative predictive values of these tests, with more than 90% of patients tolerating subsequent administration without any hypersensitivity reaction, were obtained for 3 different drug classes.

Les pénicillines font partie des molécules chimiques les plus fréquemment impliquées dans l’allergie médicamenteuse. Selon l’hypothèse de l’haptène, les molécules chimiques de petite taille doivent se lier aux protéines pour êtres immunogènes. Cependant, très peu est connu sur le processus d’immunisation des patients aux bioconjugués pénicilline-protéine. Notre groupe a récemment synthétisé des bioconjugués albumine sérique humaine-benzylpénicilline (HSA-BP) et a démontré l'existence de lymphocytes T CD4+ naïfs spécifiques du bioconjugué HSA-BP chez des donneurs sains. L'objectif de ce travail de thèse est d'identifier des séquences peptidiques issus de la HSA hapténisées avec la BP, impliquées dans l’activation des cellules T naïves ainsi que l’immunisation des patients allergiques et par conséquent les manifestations cliniques. Notre stratégie combine la spectrométrie de masse, la modélisation moléculaire et le criblage virtuel, la synthèse chimique orientée et la validation biologique sur des lignées de cellules T de longues durées chez les donneurs sains, et à l’aide du test de transformation lymphocytaire ainsi que les lignées de cellules T de courte durée chez les patients allergiques. Cette étude a permis: (1) l’identification des résidus lysine présents sur la HSA hapténisés par la BP par spectrométrie de masse, (2) la sélection par une approche in silico des peptides de 15-mer potentiellement immunogènes, (3) la synthèse orientée de ces peptides-BP à l’aide d’un monomère lysine-BP, (4) l’identification des épitopes reconnus par les cellules T naïves de donneurs sains, (5) la validation de deux épitopes situés sur les lysines 159 et 525 chez les patients allergiques aux pénicillines et (6) confirmation de la HSA comme un bon modèle pour l’hapténisation de la BP. / Penicillins are among the most prevalent drug-inducing allergy. According to the hapten hypothesis small chemical molecules needs to bind to proteins to be immunogenic. However, little is known on the process of patients immunization to penicillin-protein conjugates. Our group has recently synthesized benzylpenicillin-human serum albumin (BP-HSA) bioconjugate and demonstrated the existence of naïve CD4+ T lymphocytes specific to BP-HSA in healthy donors. The objective of this work was to identify peptides sequences from HSA haptenized with BP involved in naïve T-cells activation, immunization of patients and consequently the clinical manifestations. Our strategy combines mass spectrometry, molecular modeling and virtual screening, chemical oriented synthesis and biological validation using long-term T-cell lines in healthy donors and the lymphocyte transformation test as well as short-term T-cell lines in allergic patients. This study allowed: (1) the identification of lysine residues involved in the BP binding to HSA using mass spectrometry, (2) the selection of BP-peptides containing the lysine residues likely to induce immune response using an in silico approach, (3) the synthesis of the selected BP-15 mer peptide bioconjugates using a lysine-BP monomer, (4) the identification of epitopes recognized by naïve T cells from healthy donors, (5) the validation of two epitopes located on lysines 159 and 525 in allergic patients to penicillins and (6) the confirmation of HSA as a good model for BP haptenation.

En 1985 Kroto décrit le troisième allotrope du carbone, le fullerène, une sphère de 60 carbones d’1nm de diamètre aux caractéristiques physico-chimiques particulières. La réactivité chimique du C₆₀ est dominée par les réactions d’addition et sa grande affinité pour les radicaux libres grâce à ses 30 double-liaisons. Cette propriété a été explorée dans le stress oxydant, tant in vitro qu’in vivo, où l’équilibre redox est impliqué, comme dans les situations pathophysiologiques impliquant l’inflammation et la dégénérescence cellulaire. En particulier, un traitement au C₆₀ solubilisé dans de l’huile a permis de prolonger l’espérance de vie chez le rat. Le produit, commercialisé à travers le monde, n’a pas encore fait l’objet d’essai clinique. D’autre part certaines préparations peuvent contenir des impuretés. Il est donc important d’établir des critères de pureté et d’intégrité des préparations de C₆₀. Ce travail de thèse comporte deux parties. La première, physicochimique, nous a permis d’évaluer la pureté de préparations commerciales de C₆₀ de différentes origines faisant appel à différentes techniques d’analyse: microscopie électronique à balayage, diffraction aux rayons X, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), analyse thermogravimétrique, chromatographie liquide (CLHP) ou en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM), ainsi que la spectroscopie ultraviolet-visible ou infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). La DSC est la technique de choix pour établir le critère de pureté et la FTIR la plus rapide. La CG-SM est nécessaire à l’identification des impuretés volatiles, tandis que la CLHP permet de détecter les fullerènes lourds et les dérivés du C₆₀. La deuxième partie a porté sur des aspects fonctionnels des fullerènes et nous avons, pour cela, utilisé des préparations pures selon les critères définis précédemment. Dans un premier temps, nous avons cherché à préciser le sous-compartiment cellulaire ciblé par le C₆₀ injecté in vivo chez la souris. Après administration d’une solution huileuse, les molécules de C₆₀ sont retrouvées dans le foie et la rate, à l’intérieur des cellules, parfois au niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique. La présence des molécules de C₆₀, au niveau des mitochondries a été corroborée par la mise en évidence de modifications spécifiques d’activité des enzymes de la mitochondrie (malate déshydrogénase et complexe I de la chaîne respiratoire). Dans un deuxième temps, nous avons abordé l’effet des fullerènes sur des cellules intervenant dans une dysrégulation immunologique où l’inflammation joue un rôle important : l’allergie. L’évènement cellulaire à l’origine des symptômes allergiques est la libération de médiateurs de l’inflammation et de la réponse immunitaire lors de l’activation dépendante des IgE des basophiles et des mastocytes. L’effet régulateur de C₆₀ et de quatre dérivés hydrosolubles, le fullérol, la β-cyclodextrine C₆₀, le dendro C₆₀ et le C₆₀ serinol-malonate, a été testé. L’innocuité des dérivés à des concentrations nanomolaires et leur pouvoir inhibiteur sur la dégranulation IgE et non IgE dépendante des lignées mastocytaires de rat a été vérifié in vitro. Dans un test d’activation cellulaire mesurant l’expression des marqueurs CD63 et CD203c par cytométrie de flux, nous montrons que les différents dérivés sont capables d’interférer ex vivo avec l’activation de basophiles de patients allergiques dans des conditions naturelles de sang total. Les taux d’inhibition dépendent des dérivés et des patients avec un maximum observé à 35% en présence de C₆₀ serinol-malonate. Ces inhibitions ont été reproduites sur des basophiles humains purifiés en étudiant des marqueurs d’activation supplémentaires CD107a et CD69. Les perspectives de ce travail portent sur la spécificité et les mécanismes d’inhibitions observés au niveau intracellulaire. Elles incluent, par exemple, l’étude des flux de calcium ou des protéines de fusion, ou des facteurs de transcription. / In 1985 Kroto discovered the third allotrope of carbon, fullerene, spherical molecule consists of 60 carbons with 1 nm in diameter with a specific physico-chemical characteristic. The chemical reactivity of C₆₀ is governed by addition reactions and its high affinity for scavenging free radicals thanks to its 30 double bonds. This property has been widely explored in the field of oxidative stress, in vitro and in vivo, where redox balance is involved, as physio-pathological situations involving inflammation and cellular degeneration. In particular, treatment with C₆₀ solubilized in olive oil extended life span in a rat experimental model. The product, marketed worldwide, has not yet been clinically tested. On the other hand, some preparations may contain impurities. It is therefore important to establish criteria for the purity and integrity of C₆₀ preparations. This thesis work consists of two parts. In the first physico-chemical part, a criterion of C₆₀ purity was established for evaluating the purity of several commercial preparations of C₆₀ with different origins using the following techniques: scanning electron microscopy, X-ray diffraction, Differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), liquid chromatography and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), as well as ultraviolet-visible and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results show that FTIR is the easiest way to control the quality of C₆₀ and GC-MS is necessary for identifying volatile impurities, while HPLC remains essential for detecting other fullerenes and C₆₀ derivatives. The second part of the thesis deals with functional aspect of fullerenes and for this purpose we used the pure preparation of C₆₀ evaluated according to the previously defined criteria. In a first chapter, to precise the sub-cellular compartment targeted, the C₆₀ dissolved in olive oil were in vivo injected in mice. After administration, C₆₀ molecules were visualized in the liver and in the spleen, inside the cells and sometimes in mitochondria and endoplasmic reticulum. The targeting of [60]fullerene to the mitochondria was confirmed by a specific modification of the activities of mitochondrial enzymes (malate dehydrogenase and complex I of respiratory chain). In a second chapter we studied the effect of fullerenes on cells involved in an immune dysregulation where inflammation plays a role: allergy. The cellular mechanism at the basis of allergic symptoms is the release in circulation and tissues of mediators of inflammation and immune response from IgE-dependent activation of basophiles and mast cells. The regulatory effects of [60]fullerene and 4 hydrosoluble derivatives, fullerol, β-cyclodextrin [60]fullerene, dendro [60]fullerene and [60]fullerene serinol-malonate, were tested. In vitro experiments showed an absence of toxicity at nanomolar concentrations and inhibitory abilities on the IgE-dependent and -independent activation of the rat mast cell line (RBL). In a cellular activation test monitoring the expression of the degranulation and activation markers CD63 and CD203c on basophiles, by flow cytometry, we show that the various fullerenes are able also to inhibit the ex vivo activation of basophiles from peanut allergic patients in a natural physiological environment: in whole blood. Inhibition rates depend on patients and derivatives with a maximum inhibition observed at 35% in presence of [60]fullerene serinol-malonate. These inhibitions were reproduced on purified human basophiles by studying further activation markers CD107a and CD69. Working perspectives will be on the specificity and the mechanisms of inhibition by studying intracellularly calcium influx or the expression of fusion proteins and transcription factors.

La dermatite allergique de contact (DAC) est une réaction inflammatoire aiguë, médiée par les cellules dendritiques (DCs) survenant suite à l’exposition répétée de la peau avec une molécule allergisante. La prévalence estimée des cas de DAC aux substances parfumantes est de 1,7 % à 4,1 % dans la population générale. Les molécules allergisantes sont des molécules appelées haptènes, qui vont se conjuguer avec des protéines de l’épiderme ou du derme. C’est le cas du cinnamaldéhyde (CinA), une molécule retrouvée dans la cannelle. Le linalol et le limonène sont des terpènes présents dans la lavande et l’orange, qui vont s’autoxyder au contact de l’air pour former des allergènes puissants, tels que les hydroperoxydes allyliques. Le premier objectif de cette thèse a été d’étudier le mécanisme d’action de ces terpènes et leurs hydroperoxydes allyliques respectifs sur la lignée cellulaire THP-1, qui sert de substitut aux cellules dendritiques. Le rôle du facteur de transcription Nrf2, majeur dans la lutte contre le stress oxydant, a également été investigué.Les consommateurs de produits cosmétiques sont exposés à de faibles concentrations de molécules allergisantes, mais plusieurs fois par jour ou par semaine. Nous avons souhaité étudier l’exposition répétée à de faibles doses d’haptène sur la peau.Les kératinocytes jouent également un rôle dans la DAC : ce sont les premières cellules qui vont rencontrer la molécule allergisante dans la peau. La deuxième partie de ce travail a été d’étudier l’impact d’une exposition répétée de CinA à de faible concentration sur ces KCs et plus particulièrement sur la différenciation de l’épiderme, en utilisant un modèle organotypique de peau en 3D. / Allergic contact dermatitis (ACD) represents a severe health problem. It is a dendritic cells (DCs) mediated skin disease caused by repeated exposure to an allergenic compound. ACD cases of fragrances in general population is estimated from 1.7 % to 4.1%. Contact sensitizers are compounds termed haptens and they will form a conjugate with epidermis and dermis proteins. Example is cinnamaldehyde (CinA), a molecule found in cinnamon. Linalool and limonene are terpenes found in lavender and oranges. In contact with the air, they will autoxidize to form highly allergenic compounds: allylic hydroperoxides. The first aim of this thesis was to study the mechanism of action of those terpenes and their respective allylic hydroperoxides on THP-1 cell-line, described as a surrogate of DCs. The transcription factor Nrf2 is playing a major role in oxidative stress and was also investigated.Consumers of cosmetic products are exposed to low quantities of allergenic compounds, but several times a day or a week. We wanted to study repeated exposure of low concentration of haptens on the skin.KCs also play a key role in ACD: they are the first cells that will encounter the allergenic compound in the skin. The second aim of this thesis was to study the impact of repeated exposure of low concentrations of CinA on those KCs and more particularly on the epidermis differenciation, using a 3D organotypic culture of skin.

Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l’enfant jeune chez qui l’allergie respiratoire et l’allergie alimentaire sont les principales pathologies. L’unique traitement curatif est l’immunothérapie spécifique d’antigène (ITA), largement développée dans l’allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l’allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l’allergie est indispensable et il n’existe actuellement pas d’examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d’IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l’intérêt d’un test fonctionnel, l’ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l’allergie aux acariens chez l’enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d’acariens sécréteur d’interleukine (IL)-4 ou d’IL-13 était associé à la présence d’une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d’une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d’une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l’année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’intérêt de l’ELISpot dans le diagnostic de l’allergie au lait de vache chez l’enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d’IL-4 et d’IL-13 était associé à l’allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l’enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d’une ITA sub-linguale (SLIT) d’une part et sous-cutanée (SCIT) d’autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d’IL-4 et IL-13) spécifiques d’acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d’IL-10 (Tr1) spécifiques d’acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n’avons pas retrouvé de production accrue d’interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d’acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu’un test fonctionnel, l’ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l’allergie aux acariens et de l’allergie au lait de vache chez l’enfant. Par ailleurs, l’ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu’une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l’enfant allergique aux acariens. / Allergic diseases are steadily increasing steadily and especially in children. Allergen specific immunotherapy (desensitization) is the only curative treatment for which accurate diagnosis of allergy is essential. Currently, the presence of specific IgE diagnoses a sensitization to an allergen but not a clinically symptomatic allergy. In a first part, we studied the value of a functional test, the ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot) in the diagnosis of allergy to house dust mites (HDM). The number of circulating HDM-specific IL-4 and IL-13 secreting T cells was associated with the presence of symptoms, regardless of specific IgE and was higher in severe rhinitis than in mild rhinitis. In addition, it varied according to the season with a peak in autumn and a peak in early spring (wet periods with greater allergen exposure). In a second part, we studied the value of ELISpot for the diagnosis of cow's milk allergy in children, confirmed by double blind placebo control food challenge. We found that the number of casein-specific IL-4 and IL -13 secreting T-cells was associated with allergy to cow's milk. It was also inversely correlated to the cow’s milk tolerated cumulative dose. Receiver-operating characteristic (ROC) curve of combined IL-4 and IL-13 analysis was generated. AUC was 0,98 (95% CI 0.90-1.06). For a cut-off of 10 IL-4- and 12 IL-13 secreting T-cells, sensitivity and negative predictive value were 100%.Finally, in the third part, we monitored antigen specific T-cell response in HDM allergic children treated with sublingual ITA (SLIT) on the one hand and subcutaneous ITA (SCIT) on the other hand, during one year. We found a decrease in HDM specific Th2 cells after 12 months of SLIT associated with an increase in HDM specific IL-10 secreting T-cells after 6 months of SLIT. In addition, regulatory T cells (CD4 + CD25hiCD127loFoxp3+) were increased after 12 months of SCIT. In conclusion, this work has allowed us to describe a functional test, the ELISpot, as a reliable tool for the diagnosis of mite allergy and cow's milk allergy in children. In addition, in HDM allergic children, a decrease of Th2 cells and an increase of IL-10 secreting T-cells was found in children treated with SLIT to HDM as well as an increase in Foxp3+ Treg in children treated with SCIT.